一種豬hev總抗體膠體金快速診斷試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條及其制備方法，該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條包括：吸水玻璃纖維層、硝酸纖維素膜層、吸水濾紙層和白色塑料墊板；該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的制備方法包括以下步驟：制備HEV包被抗原、HEV標(biāo)記抗原、HEV標(biāo)記抗原-膠體金；組裝膠體金快速診斷試紙條。本發(fā)明可以用于豬戊型肝炎病毒總抗體檢測(cè)，診斷操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，攜帶方便；為戊型肝炎病毒流行病學(xué)大規(guī)模調(diào)查提供相應(yīng)的研究基礎(chǔ)和技術(shù)保障；采用雙抗原夾心法原理，包被抗原與血清中抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合，結(jié)合抗原抗體復(fù)合物與標(biāo)記抗原再次產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，兩個(gè)抗原結(jié)合不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，特異性好，靈敏度高。
【專利說(shuō)明】一種豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于戊型肝炎病毒的檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]戍型肝炎(Hepatitis E)是一種由戍型肝炎病毒(Hepatitis E virs, HEV)引起的經(jīng)消化道傳播的人畜共患傳染病。該病在青少年中容易發(fā)展為暴發(fā)性肝炎，可以導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)，病死率高達(dá)21%。HEV分布廣泛，危害嚴(yán)重。
[0003]世界各國(guó)相繼都有豬源HEV相關(guān)的報(bào)道，與人類HEV序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者具有極高的同源性，隨后又發(fā)現(xiàn)提取的病毒RNA可以感染黑猩猩和恒河猴。隨后，相繼的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明豬戊型肝炎是一種人畜共患病，豬作為戊型肝炎病毒的主要自然宿主，HEV平均感染率最高可達(dá)83.4%，許多攜帶戊肝病毒的豬群并不表現(xiàn)發(fā)病狀態(tài)(Meng X J et al.，1997)。豬是人類重要的肉食來(lái)源，同時(shí)作為人類器官移植的主要供體，有效控制戊型肝炎就必須切斷人-豬傳播途徑。這就凸現(xiàn)了豬戊型肝炎病毒的檢測(cè)診斷的意義。HEV具有遺傳的不穩(wěn)定性和變異的特性，不同毒株之間的抗原表位也不盡相同。
[0004]由于嗜肝病毒本身的生物學(xué)特性，目前還沒(méi)有成熟的體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以大量增殖病毒粒子，加上病毒本身對(duì)外界環(huán)境抵抗力弱，至今還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出令人滿意的戊型肝炎診斷試劑盒和疫苗。
[0005]HEV為RNA病毒，對(duì)HEV RNA的檢測(cè)主要為采用PCR方法進(jìn)行，但是由于各地所用引物不盡相同，檢測(cè)結(jié)果不盡人意；而且由于病毒RNA在血液中存在時(shí)間較短，病毒含量低，RNA易于降解等因素，使得檢測(cè)HEV RNA存在一定的困難。因此，目前對(duì)HEV的診斷主要通過(guò)檢測(cè)血清中抗HEV IgG和抗HEV IgM來(lái)進(jìn)行診斷。
[0006]目前，免疫學(xué)檢測(cè)方法特異性高，敏感性強(qiáng)，簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，成為HEV血清學(xué)檢測(cè)最常用的方法，現(xiàn)在隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，可以采用基因工程方法表達(dá)相關(guān)蛋白來(lái)建立一系列血清學(xué)檢測(cè)方法。本發(fā)明采用雙抗原夾心法建立的豬戊型肝炎病毒總抗體膠體金檢測(cè)試紙條，旨在快速準(zhǔn)確高效的對(duì)豬血清中戊型肝炎病毒總抗體進(jìn)行檢測(cè)，從而建立一種靈敏度好、特異性高的免疫學(xué)檢測(cè)方法，用于檢測(cè)和評(píng)估豬群的HEV抗體水平，對(duì)于豬群戊型肝炎病毒的臨床診斷和預(yù)防控制具有重要意義。
[0007]目前市場(chǎng)上戊型肝炎病毒的檢測(cè)主要采用血清學(xué)ELISA檢測(cè)法，此產(chǎn)品主要應(yīng)用于人血清抗體的檢測(cè)，還沒(méi)有相關(guān)產(chǎn)品用于豬HEV抗體的檢測(cè)，豬作為戊型肝炎病毒的主要自然宿主，由于缺乏相關(guān)可行的檢測(cè)產(chǎn)品，暫時(shí)也沒(méi)有豬群HEV抗體水平的檢測(cè)報(bào)告。豬源HEV與人類HEV序列具有極高的同源性，且其病毒RNA還可以感染黑猩猩和恒河猴等其它動(dòng)物，為了彌補(bǔ)這一技術(shù)空白，開(kāi)發(fā)了豬源HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條?？朔爽F(xiàn)有試劑盒只能特異性檢測(cè)人戊型肝炎病毒的不足，該產(chǎn)品為第一個(gè)專門用于檢測(cè)動(dòng)物戊型肝炎總抗體的免疫產(chǎn)品系列。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條及其制備方法，旨在解決現(xiàn)有戊型肝炎病毒的試劑盒只能特異性檢測(cè)人戊型肝炎病毒，而不能檢測(cè)豬源的戊型肝炎病毒的問(wèn)題。
[0009]本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的制備方法，該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的制備方法包括以下步驟:
[0010]第一步，HEV包被抗原的制備:
[0011]首先PCR擴(kuò)增豬源SWCH189株HEV 0RF2基因部分的兩個(gè)片段，上下游引物分別帶有BamH I和Not I酶切位點(diǎn)；FS為S片段上游引物，帶有BamH I酶切位點(diǎn)，RS為片段下游引物，帶有Not I酶切位點(diǎn)；FP12為P12片段上游引物，帶有BamH I酶切位點(diǎn)，RP12為片段下游引物，帶有Not I酶切位點(diǎn)；
[0012]PCR片段擴(kuò)增后回收，采用BamH I和Not I雙酶切，連接到pMD18_T載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取轉(zhuǎn)化子，小提質(zhì)粒，用BamH I和Not I酶切鑒定，鑒定陽(yáng)性克隆分別命名為T-S和T-P12 ;
[0013]將pET32a ( + )與鑒定的克隆質(zhì)粒分別以BamH I /Not I進(jìn)行消化，進(jìn)行瓊脂糖電泳，膠回收目的片段后進(jìn)行連接，構(gòu)建可在大腸桿菌中表達(dá)的重組質(zhì)粒，命名PET-S和PET-P12，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取轉(zhuǎn)化子，小提質(zhì)粒，用BamH I和Not I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定；
[0014]陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-S和pET-P12轉(zhuǎn)化Rossetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆菌落于氨芐西林鈉LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)10h，菌液以1:100的比例加入到IL含100 μ g/ml氨芐西林鈉的LB培養(yǎng)基37°C振蕩培養(yǎng)至0D600=0.8，加入的終濃度為0.5mmol/L的IPTG，25°C誘導(dǎo)5h，4°C 6000r/min離心15分鐘收集菌體，菌體采用20mll%Triton X-100的PBS懸浮，超聲波破碎，4°C 12000r/min離心30分鐘，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，分析確定表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌的存在形式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白以包涵體的形式存在。
[0015]目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，命名為S蛋白，純化的S蛋白為包被抗原；
[0016]第二步，HEV標(biāo)記抗原的制備:
[0017]將陽(yáng)性克隆pET-P12于Amp+LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)10h，菌液以1:100的比例加入到IL含100 μ g/ml氨芐西林鈉的LB培養(yǎng)基37°C振蕩培養(yǎng)至0D600=0.8，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，25°C誘導(dǎo)5h，4°C 6000r/min離心15分鐘收集菌體，菌體采用20mll%Triton X-100的PBS懸浮，超聲波破碎，4°C 12000r/min離心30分鐘，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，確定表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在于沉淀，通過(guò)蛋白的純化得到的蛋白命名為P12蛋白，為標(biāo)記蛋白；
[0018]第三步，膠體金的制備，具體包括以下步驟:
[0019]首先將HauC14先配制成0.01%水溶液，取IOOml于磁力加熱攪拌器上加熱至沸騰，加入lmll%檸檬酸三鈉水溶液，邊加熱邊攪拌，繼續(xù)加熱煮沸15min，觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色，全過(guò)程2?3min,冷卻至室溫后用蒸懼水恢復(fù)至原體積；
[0020]第四步，HEV抗原-膠體金標(biāo)記物的制備，具體包括以下步驟:
[0021]首先采用紫外分光光度計(jì)在0D595測(cè)定標(biāo)記抗原P12的蛋白濃度；[0022]取IOml膠體金，邊攪拌邊緩慢加入100 μ I的0.lMCBpHIO調(diào)節(jié)pH至7.6，繼續(xù)攪拌至完全混勻；標(biāo)記抗原P12按10 μ g/ml進(jìn)行標(biāo)記,繼續(xù)攪拌至完全混勻，靜置20min ;力口入0.5ml封閉液，室溫下封閉15分鐘，封閉液為0.5%BSA, 20mMPB, 150Mm NaCl，0.1%穩(wěn)定劑Τ，0.01%Proclin300, ；12000r/min離心20分鐘，吸出上清，收集沉淀；沉淀中加入1/2體積的金標(biāo)洗液，超聲混勻；12000r/min離心20min,棄上清，收集沉淀，金標(biāo)洗液為20mMPB，150mM NaCl, 1%BSA，0.01%NaN3 ;超聲混勻三次，最后收集的沉淀采用pH7.4的膠體金懸浮液，超聲混勻后于4°C保存，膠體金懸浮液為20mM PB, 150mM NaCl，1%BSA，2%Twee_20，
0.2%Sucrose，0.01%Proclin300 ；
[0023]第五步，試紙條的組裝:
[0024]膠體金懸浮液將金標(biāo)抗原標(biāo)記物6倍稀釋，均勻的鋪于普通無(wú)紡布，加入入量以加入液體開(kāi)始向外流出為止，于55度烘箱干燥2小時(shí)后4°C存放；
[0025]金標(biāo)懸浮液將S抗原稀釋至1.2mg/ml,將對(duì)照抗體稀釋至0.6mg/ml后用噴膜機(jī)噴涂在NC膜上形成檢測(cè)線和控制線，置37°C烘箱烘烤20?30min。
[0026]進(jìn)一步,在第一步中，蛋白純化采用Invitrogene clonetech蛋白純化柱,具體步驟如下:
[0027]步驟一，準(zhǔn)備IL表達(dá)菌體細(xì)胞，取5ml菌液12000r/min離心2min，棄去上清，加入lmmol/LPH7.4的PBS充分懸浮，4°C 6000r/min離心15min,保留沉淀,如此反復(fù)離心3次；
[0028]步驟二，沉淀于_70°C放置5min，之后取出溶化；如此反復(fù)凍融循環(huán)3?5次，以實(shí)現(xiàn)最大的裂解；
[0029]步驟三，加入100 μ I 的 I XFastBreakTM cell Lysis Reagent 溶液于沉淀中，充分懸?。?br> [0030]步驟四，加入I μ I的DNase I ,室溫下200r/min搖震30min ；
[0031]步驟五，加入30 μ I的N1-Particles或加入0.03g的NaCl固體；
[0032]步驟六,采用移液器反復(fù)吸吹混合10次后，室溫靜置孵育30min ；
[0033]步驟七，將EP管放入碳磁力架上30s，鎳柱被吸附到靠近磁力架的一邊，用移液器將剩余的液體吸出來(lái)；
[0034]步驟八，加入150 μ I的Bind/Wash Buffer,反復(fù)吸吹混合10次，室溫靜置孵育IOmin,之后放入磁力架30s，將剩余的液體吸出來(lái)，采用同樣的液體反復(fù)洗兩遍，最后一次的液體務(wù)必吸干凈，不要有殘留；
[0035]步驟九,加入100 μ I的Elution Buffer,多次混合吹打后于磁力架上作用30s后保留不同菌體蛋白的液體并分別標(biāo)號(hào)，同時(shí)將純化的蛋白和各自的鎳柱進(jìn)行蛋白電泳分析結(jié)果。
[0036]本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種硝酸纖維素膜、檢測(cè)線、質(zhì)控線、樣本墊、吸水墊、金標(biāo)墊、PVC板；
[0037]檢測(cè)線和質(zhì)控線設(shè)置在硝酸纖維素膜的左右兩側(cè)，吸水墊和金標(biāo)墊設(shè)置在硝酸纖維素膜上方的兩側(cè)，樣本墊設(shè)置在金標(biāo)墊上，PVC板設(shè)置在硝酸纖維素膜的下方。
[0038]進(jìn)一步,該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的使用方法:
[0039]首先在樣本墊上的反應(yīng)孔處加入10 μ I的全血、血清或血漿，讓樣品完全吸收融入圓孔里的樣品墊內(nèi)，在方孔上方Icm處垂直地拿著緩沖瓶，在試劑盒底部的方孔內(nèi)加入2滴緩沖液，加緩沖液15分鐘內(nèi)讀結(jié)果，在測(cè)試區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)粉紅色線的痕跡就表明陽(yáng)性結(jié)果，超過(guò)15分鐘后讀取的結(jié)果將認(rèn)為是無(wú)效的，必須要重做。
[0040]進(jìn)一步，該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條檢測(cè)300份豬血清，靈敏度為98.1%，特異性為98.5%，準(zhǔn)確率為96.6%。
[0041]本發(fā)明提供的豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條及其制備方法，采用雙抗原夾心法來(lái)檢測(cè)豬血清中的HEV總抗體，利用連接于固相載體上的抗原和酶標(biāo)抗原分別與樣品中被檢測(cè)抗體分子上兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)抗原免疫復(fù)合物，由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗原和酶標(biāo)抗原的量相對(duì)于待測(cè)抗體是過(guò)量的，因此復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗體的含量成正比(在方法可檢測(cè)范圍內(nèi))，測(cè)定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(0D值)，即可確定待測(cè)抗體含量。本發(fā)明可以用于豬戊型肝炎病毒總抗體的檢測(cè)，診斷操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，攜帶方便；為戊型肝炎病毒流行病學(xué)大規(guī)模調(diào)查提供相應(yīng)的研究基礎(chǔ)和一定的技術(shù)保障，更好的預(yù)防和控制HEV疾病的流行；采用雙抗原夾心法原理，包被抗原與血清中抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合，結(jié)合抗原抗體復(fù)合物與標(biāo)記抗原再次產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，兩個(gè)抗原結(jié)合不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，特異性好，靈敏度高。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0043]圖中:1、硝酸纖維素膜；2、檢測(cè)線；3、質(zhì)控線；4、樣本墊；5、吸水墊；6、金標(biāo)墊；7、PVC 板；
[0044]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的制備方法流程圖；
[0045]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的S基因的PCR擴(kuò)增示意圖；
[0046]圖中:M:DL2000marker;1: S 基因擴(kuò)增片段；
[0047]圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的P12基因的PCR擴(kuò)增示意圖；
[0048]圖中:Μ:λ-EcoT14 I digest marker ;1:P12 基因擴(kuò)增片段;
[0049]圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的S基因的酶切鑒定示意圖；
[0050]圖中:M:DL2000marker ;1: S基因酶切鑒定片段；
[0051]圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的P12基因的酶切鑒定示意圖；
[0052]圖中:M:DL2000marker ；1:P12基因酶切鑒定片段；
[0053]圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的His-S蛋白的SDS-PAGE分析示意圖；
[0054]圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的His-S蛋白純化示意圖；
[0055]圖9是本發(fā)明實(shí)施例提供的His_P12蛋白的SDS-PAGE分析示意圖；
[0056]圖10是本發(fā)明實(shí)施例提供的His_P12蛋白純化示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0057]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0058]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。[0059]如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條主要由吸水玻璃纖維層、硝酸纖維素膜層、吸水濾紙層和白色塑料墊板組成；硝酸纖維素膜1、檢測(cè)線2、質(zhì)控線3、樣本墊4、吸水墊5、金標(biāo)墊6、PVC板7組成；
[0060]檢測(cè)線2和質(zhì)控線3設(shè)置在硝酸纖維素膜I的左右兩側(cè)，吸水墊5和金標(biāo)墊6設(shè)置在硝酸纖維素膜I上方的兩側(cè)，樣本墊4設(shè)置在金標(biāo)墊6上，PVC板7設(shè)置在硝酸纖維素膜I的下方；
[0061]P12抗原和陽(yáng)性樣本包被硝酸纖維素膜產(chǎn)生的T線(檢測(cè)線)和C線(質(zhì)控線)；硝酸纖維素膜上方為抗原標(biāo)金后鋪布的無(wú)紡布，即金標(biāo)墊，金標(biāo)墊上方為樣本墊；硝酸纖維素膜下方為吸水墊，從左至右樣本墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水墊緊密的排列在PVC板上；
[0062]本發(fā)明的使用方法:
[0063]首先在樣本墊上的反應(yīng)孔處加入10 μ I的全血、血清或血漿，讓樣品完全吸收融入圓孔里的樣品墊內(nèi)，在方孔上方Icm處垂直地拿著緩沖瓶，在試劑盒底部的方孔內(nèi)加入2滴緩沖液，加緩沖液15分鐘內(nèi)讀結(jié)果，在測(cè)試區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)粉紅色線的痕跡就表明陽(yáng)性結(jié)果，超過(guò)15分鐘后讀取的結(jié)果將認(rèn)為是無(wú)效的，必須要重做。
[0064]檢測(cè)結(jié)果判斷:
[0065]陽(yáng)性:反應(yīng)板孔中質(zhì)控線端出現(xiàn)粉紅色線，檢測(cè)線端出現(xiàn)粉紅色線，為豬HEV總抗體陽(yáng)性；
[0066]陰性:反應(yīng)板孔中質(zhì)控線端出現(xiàn)粉紅色線，檢測(cè)線端不出現(xiàn)粉紅色線，為豬HEV總抗體陰性。
[0067]失效:反應(yīng)板孔中質(zhì)控線端不出現(xiàn)粉紅色線，或質(zhì)控線端、檢測(cè)線端均不出現(xiàn)粉紅色線,為試劑盒失效。
[0068]如圖2所示，本發(fā)明實(shí)施例的豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的制備方法包括以下步驟:
[0069]SlOl:制備HEV包被抗原；
[0070]S102:制備HEV標(biāo)記抗原；
[0071]S103:制備膠體金；
[0072]S104:HEV抗原-膠體金標(biāo)記物的制備；
[0073]S105:組裝膠體金快速診斷試紙條。
[0074]以下結(jié)合本發(fā)明的具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明:
[0075]第一步，HEV包被抗原的制備:
[0076]首先PCR擴(kuò)增豬源SWCH189株HEV 0RF2 (蘭州獸醫(yī)研究所傳染病室保存)基因部分的兩個(gè)片段，上下游引物設(shè)計(jì)如表I和表2所示，分別帶有BamH I和Not I酶切位點(diǎn)；
[0077]表1:swCH189株S片段設(shè)計(jì)引物為:
【權(quán)利要求】
1.一種豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的制備方法，其特征在于，該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的制備方法包括以下步驟: 第一步，HEV包被抗原的制備: 首先PCR擴(kuò)增豬源SWCH189株HEV 0RF2基因部分的兩個(gè)片段，上下游引物分別帶有BamH I和Not I酶切位點(diǎn)；FS為S片段上游引物，帶有BamH I酶切位點(diǎn)，RS為片段下游引物，帶有Not I酶切位點(diǎn)；FP12為P12片段上游引物，帶有BamH I酶切位點(diǎn)，RP12為片段下游引物，帶有Not I酶切位點(diǎn)； PCR片段擴(kuò)增后回收，采用BamH I和Not I雙酶切，連接到pMD18_T載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取轉(zhuǎn)化子，小提質(zhì)粒，用BamH I和Not I酶切鑒定，鑒定陽(yáng)性克隆分別命名為T-S和T-P12; 將pET32a ( + )與鑒定的克隆質(zhì)粒分別以BamH I /Not I進(jìn)行消化，進(jìn)行瓊脂糖電泳，膠回收目的片段后進(jìn)行連接，構(gòu)建可在大腸桿菌中表達(dá)的重組質(zhì)粒，命名PET-S和PET-P12，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取轉(zhuǎn)化子，小提質(zhì)粒，用BamH I和Not I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定； 陽(yáng)性重組質(zhì)粒PET-S和pET-P12轉(zhuǎn)化Rossetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆菌落于氨節(jié)西林鈉LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)IOh,菌液以1:100的比例加入到IL含100yg/ml氨節(jié)西林鈉的LB培養(yǎng)基37°C振蕩培養(yǎng)至0D600=0.8，加入的終濃度為0.5mmol/L的IPTG，25°C誘導(dǎo)5h，4°C 6000r/min離心15分鐘收集菌體，菌體采用20mll%Triton-X_100的PBS懸浮，超聲波破碎，4°C 12000r/min離心30分鐘，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，分析確定表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌的存在形式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白以包涵體的形式存在； 目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，命名為S蛋白，純化的S蛋白為包被抗原； 第二步，HEV標(biāo)記抗原的制備: 將陽(yáng)性克隆PET-P12于Amp+LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)10h，菌液以1:100的比例加入到IL含,100 μ g/ml氨芐西林鈉的LB培養(yǎng)基37°C振蕩培養(yǎng)至0D600=0.8，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，25°C誘導(dǎo)5h，4°C 6000r/min離心15分鐘收集菌體，菌體采用20mll%Triton X-100的PBS懸浮，超聲波破碎，4°C 12000r/min離心30分鐘，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS_PAGEJ；|定表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在于沉淀，通過(guò)蛋白的純化得到的蛋白命名為P12蛋白，為標(biāo)記蛋白； 第三步，膠體金的制備，具體包括以下步驟: 首先將HauC14先配制成0.01%水溶液，取100ml于磁力加熱攪拌器上加熱至沸騰，加入Iml 1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2Η20)水溶液，邊加熱邊攪拌，繼續(xù)加熱煮沸15min，觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色，全過(guò)程2~3min，冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積； 第四步，HEV抗原-膠體金標(biāo)記物的制備，具體包括以下步驟: 首先采用紫外分光光度計(jì)在0D595測(cè)定標(biāo)記抗原P12的蛋白濃度； 取IOml膠體金，邊攪拌邊緩慢加入100 μ I的0.lMCBpHIO調(diào)節(jié)pH至7.6，繼續(xù)攪拌至完全混勻；標(biāo)記抗原P12按10 μ g/ml進(jìn)行標(biāo)記,繼續(xù)攪拌至完全混勻，靜置20min ;加入,0.5ml封閉液，室溫下封閉15分鐘，封閉液為0.5%BSA, 20mM PB, 150Mm NaCl，0.1%穩(wěn)定劑Τ，0.01%Proclin300, ；1 2000r/min離心20分鐘，吸出上清，收集沉淀；沉淀中加入1/2體積的金標(biāo)洗液，超聲混勻；12000r/min離心20min,棄上清,收集沉淀,金標(biāo)洗液為20mM PB,.150mM NaCl, 1%BSA，0.01%NaN3 ;超聲混勻三次，最后收集的沉淀采用pH7.4的膠體金懸浮液懸浮，超聲混勻后于4°C保存，膠體金懸浮液為20mM PB, 150mM NaCl，1%BSA, 2%Twee_20，.0.2%Sucrose,0.01%Proclin300 ； 第五步，試紙條的組裝: 膠體金懸浮液將金標(biāo)P12抗原標(biāo)記物6倍稀釋，均勻的鋪于普通無(wú)紡布，加入量以加入液體開(kāi)始向外流出為止，于55度烘箱干燥2小時(shí)后4°C存放； 金標(biāo)懸浮液將S抗原稀釋至1.2mg/ml,將對(duì)照抗體稀釋至0.6mg/ml后用噴膜機(jī)噴涂在NC膜上形成檢測(cè)線和控制線，置37°C烘箱烘烤20~30min。
2.如權(quán)利要求1所述的豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的制備方法，其特征在于，在第一步中，蛋白純化采用Invitrogene clonetech蛋白純化柱,具體步驟如下: 步驟一，準(zhǔn)備IL表達(dá)菌體細(xì)胞，取5ml菌液12000r/min離心2min，棄去上清，加入lmmol/L PH7.4的PBS充分懸浮,4°C 6000r/min離心15min,保留沉淀,如此反復(fù)離心3次；步驟二，沉淀于_70°C放置5min，之后取出溶化；如此反復(fù)凍融循環(huán)3~5次，以實(shí)現(xiàn)最大的裂解； 步驟三,加入100 μ I的I XFastBreakTMcellLysisReagent溶液于沉淀中，充分懸??； 步驟四，加入I μ I的DNase I ,室溫下200r/min/min搖震30min ； 步驟五，加入30μ I的N1-Particles或加入0.03g的NaCl固體； 步驟六，采用移液器反復(fù)吸吹混合10次后，室溫靜置孵育30min ； 步驟七，加EP管放入碳磁力架上30s，鎳柱被吸附到靠近磁力架的一邊，用移液器將剩余的液體吸出來(lái)； 步驟八，加入150 μ I的Bind/Wash Buffer,反復(fù)吸吹混合10次，室溫靜置孵育lOmin，之后放入磁力架30s，將剩余的液體吸出來(lái)，采用同樣的液體反復(fù)洗兩遍，最后一次的液體務(wù)必吸干凈，不要有殘留； 步驟九，加入100 μ I的Elution Buffer,多次混合吹打后于磁力架上作用30s后保留不同菌體蛋白的液體并分別標(biāo)號(hào)，同時(shí)將純化的蛋白和各自的鎳柱進(jìn)行蛋白電泳分析結(jié)果O
3.一種豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條，其特征在于，該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條包括:硝酸纖維素膜、檢測(cè)線、質(zhì)控線、樣本墊、吸水墊、金標(biāo)墊、PVC板； 檢測(cè)線和質(zhì)控線設(shè)置在硝酸纖維素膜的左右兩側(cè)，吸水墊和金標(biāo)墊設(shè)置在硝酸纖維素膜上方的兩側(cè)，樣本墊設(shè)置在金標(biāo)墊上，PVC板設(shè)置在硝酸纖維素膜的下方。
4.如權(quán)利要求3所述的豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條，其特征在于，該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的使用方法: 首先在樣本墊上的反應(yīng)孔處加入10 μ I的全血、血清或血漿，讓樣品完全吸收融入圓孔里的樣品墊內(nèi)，在方孔上方Icm處垂直地拿著緩沖瓶，在試劑盒底部的方孔內(nèi)加入2滴緩沖液，加緩沖液15分鐘內(nèi)讀結(jié)果，在測(cè)試區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)粉紅色線的痕跡就表明陽(yáng)性結(jié)果，超過(guò)15分鐘后讀取的結(jié)果將認(rèn)為是無(wú)效的，必須要重做。
5.如權(quán)利要求3所述的豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條，其特征在于，該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條檢測(cè)300份豬血清，靈敏度為98.1%，特異性為98.5%，準(zhǔn)確率為96.6%。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK103823057SQ201410083353
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】蘭喜, 楊彬, 常曉依, 柳紀(jì)省, 張韻, 殷相平, 李寶玉, 李學(xué)瑞, 李志勇, 方玉萍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所