用于測(cè)定樣本中的待測(cè)定成分的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于測(cè)定樣本中的待測(cè)定成分的方法和試劑盒。具體而言，本發(fā)明提供了用于測(cè)定樣本中的待測(cè)成分的方法，從而在樣本中包含的待測(cè)成分例如抗原時(shí)能夠不受反應(yīng)溫度等的影響而被準(zhǔn)確測(cè)定。用于測(cè)定待測(cè)成分的方法的特征在于包含：在脂肪酸烷醇酰胺存在下，將樣本中的待測(cè)成分與結(jié)合所述待測(cè)成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)；然后與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)以形成包含第一抗體、待測(cè)成分和標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物，其中標(biāo)記物被結(jié)合到能夠與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上；以及測(cè)量這樣形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量。在前述測(cè)定方法中使用用于測(cè)定樣本中的待測(cè)成分的測(cè)定試劑盒。
【專利說(shuō)明】用于測(cè)定樣本中的待測(cè)定成分的方法和試劑盒
[0001]本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)日為2010年10月27日、國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/JP2010/069027的PCT申請(qǐng)于2012年6月27日進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段、申請(qǐng)?zhí)枮?01080059603.9、發(fā)明名稱為“用于測(cè)定樣本中的待測(cè)定成分的方法和試劑盒”申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及用于測(cè)定樣本中的待測(cè)成分的方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0003]免疫測(cè)量方法正被用為測(cè)量樣本中成分的方法。免疫測(cè)量方法包括許多方法，例如RIA方法(放射免疫測(cè)定法)、EIA方法(酶免疫測(cè)定法)、CLIA方法(化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法)、CLEIA方法(化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定法)、LA方法(乳膠凝集法)、TIA方法(免疫透射比濁測(cè)定法)和免疫層析方法。在這些測(cè)定法中，當(dāng)通過(guò)免疫技術(shù)執(zhí)行測(cè)量時(shí)，利用了樣本中的成分(或抗體)與針對(duì)它的抗體(或抗原)之間的抗原-抗體反應(yīng)。此外，在這些免疫測(cè)定法中，通過(guò)將測(cè)量具有已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)材料所獲得的數(shù)值(吸光度)與它們的相應(yīng)測(cè)量值(濃度)之間的關(guān)系作于圖上，事先制作校準(zhǔn)曲線(標(biāo)準(zhǔn)曲線)，并獲得樣本中目標(biāo)成分的測(cè)定值?？梢源罅恐苽洳⑶以牧先菀撰@得的重組抗原，通常被用于在這些測(cè)定法中使用的標(biāo)準(zhǔn)材料。
[0004]然而，重組抗原的免疫反應(yīng)性不一定與天然抗原、即樣本中的成分匹配，并且取決于測(cè)定期間使用的緩沖液和添加劑，反應(yīng)性也可能不同。具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)抗原-抗體反應(yīng)期間的反應(yīng)溫度改變時(shí)，兩者反應(yīng)性的差異變得明顯，這引起了由于溫度而使測(cè)定值產(chǎn)生變動(dòng)的問(wèn)題(參見(jiàn)專利文獻(xiàn)I和2 )。
[0005]MxA蛋白是由I型干擾素(干擾素α/β)所誘導(dǎo)的一系列蛋白中的一種蛋白，其分子量為78kDa，屬于發(fā)動(dòng)蛋白(Dynamin)超家族，具有GTPase活性，并表達(dá)在白細(xì)胞、特別是單核細(xì)胞的胞質(zhì)中。關(guān)于其功能，由于抑制病毒增殖，已知它具有抗病毒效應(yīng)，并且據(jù)稱它在病毒感染的早期階段參與生物體抗病毒狀態(tài)的建立(參見(jiàn)非專利文獻(xiàn)I至4)。
[0006]在幾種動(dòng)物物種中發(fā)現(xiàn)的MxA蛋白在其氨基酸末端中具有特征性氨基酸序列。N-端G結(jié)構(gòu)域是抗病毒作用和作為GTPase的活性所必需的部分，C-端區(qū)域富含α -螺旋結(jié)構(gòu)并具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。已報(bào)道這兩個(gè)部分發(fā)生分子內(nèi)相互反應(yīng)，或通過(guò)分子內(nèi)相互結(jié)合引起自身聚集(參見(jiàn)非專利文獻(xiàn)5)。
[0007][現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)]
[0008][專利文獻(xiàn)]
[0009][專利文獻(xiàn)I]特開(kāi)2008-101924號(hào)公報(bào)
[0010][專利文獻(xiàn)2]冊(cè)2006/073073
[0011][非專利文獻(xiàn)]
[0012][非專利文獻(xiàn) I] J.1nterferon Res., vol.7, p.331-343 (1987).[0013][非專利文獻(xiàn) 2]Mol.Cell.B1l.，vol.9，p.5062-5072 (1989).[0014][非專利文獻(xiàn) 3] J.Virol.，vol.64，p.1171-1181 (1990).[0015][非專利文獻(xiàn)4] Traffic, vol.3，p.710-717 (2002).[0016][非專利文獻(xiàn) 5] J.B1logical Chem., vol.273，p.28365-28370 (1998).[0017]發(fā)明概述
[0018][本發(fā)明待解決的問(wèn)題]
[0019]本發(fā)明的目的是提供用于測(cè)量樣本中的待測(cè)成分的方法和試劑盒，由此可以不受反應(yīng)溫度等的影響準(zhǔn)確執(zhí)行樣本中的待測(cè)成分、例如抗原的測(cè)量。
[0020][解決問(wèn)題的手段]
[0021]為了解決所述問(wèn)題，本發(fā)明人進(jìn)行了銳意研究，并且發(fā)現(xiàn)，在樣本中的待測(cè)成分的免疫測(cè)定中，通過(guò)在脂肪酸烷醇酰胺存在下將樣本中的待測(cè)成分與結(jié)合所述待測(cè)成分相的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)，使得有可能不受反應(yīng)溫度等的影響進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在樣本中的待測(cè)成分的免疫測(cè)定中，通過(guò)將樣本中的待測(cè)成分與結(jié)合所述待測(cè)成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)，然后將待測(cè)成分在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)，使得有可能不受反應(yīng)溫度等的影響進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上；并且本發(fā)明人完成了本發(fā)明。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及下列[I]至[28]:
[0022][I] 一種用于測(cè)量待測(cè)成分的方法，其中所述方法包含在脂肪酸烷醇酰胺存在下，將樣本中的待測(cè)成分與結(jié)合所述待測(cè)成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)；然后與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)以形成包含第一抗體、待測(cè)成分和標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相 結(jié)合的第二抗體上；以及測(cè)量形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量；
[0023][2] [I]的方法，其中將標(biāo)記的第二抗體在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下進(jìn)行反應(yīng)；
[0024][3] 一種用于測(cè)量待測(cè)成分的方法，其中所述方法包含將樣本中的待測(cè)成分與結(jié)合所述待測(cè)成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)；然后在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)，以形成包含第一抗體、待測(cè)成分和標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上；以及測(cè)量形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量；
[0025][4] [I]或[2]的方法，其中脂肪酸烷醇酰胺是脂肪酸二乙醇酰胺；
[0026][5] [2]或[3]的方法，其中聚氧乙烯非離子型表面活性劑是選自聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚和乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物的聚氧乙烯非離子型表面活性劑；
[0027][6] [2]的方法，其中脂肪酸烷醇酰胺是脂肪酸二乙醇酰胺，并且聚氧乙烯非離子型表面活性劑是選自聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚和乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物的聚氧乙烯非離子型表面活性劑；
[0028][7] [I]至[6]任一項(xiàng)的方法，其中添加膽汁酸衍生物，并且將樣本中的待測(cè)成分與結(jié)合所述待測(cè)成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)；
[0029][8] [7]的方法，其中膽汁酸衍生物是具有兩性離子表面活性劑作用的膽汁酸衍生物；
[0030][9] [8]的方法，其中具有兩性離子表面活性劑作用的膽汁酸衍生物是3-[(3_膽酰胺丙基)二甲銨基]丙磺酸鹽或3-[(3-膽酰胺丙基)二甲銨基]-2-羥基丙磺酸鹽；
[0031][10] [7]的方法，其中膽汁酸衍生物是具有非離子型表面活性劑作用的膽汁酸衍生物；
[0032][11] [10]的方法，其中具有非離子型表面活性劑作用的膽汁酸衍生物是N，N-雙(3-葡萄糖酰胺丙基)膽酰胺或N，N-雙(3-D-葡萄糖酰胺丙基)脫氧膽酰胺；
[0033][12] [I]至[11]任一項(xiàng)的測(cè)量方法，其中將第一抗體固定化在不溶性載體上；
[0034][13] [I]至[12]任一項(xiàng)的方法，其中樣本是全血；
[0035][14] [I]至[13]任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)成分是MxA蛋白；
[0036][15] 一種用于測(cè)量樣本中的待測(cè)成分的試劑盒，其中所述試劑盒包含:第一試齊U，其包含與待測(cè)成分相結(jié)合的第一抗體和脂肪酸烷醇酰胺；以及包含標(biāo)記的第二抗體的第二試劑，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上；
[0037][16] [15]的試劑盒，其中第二試劑還包含聚氧乙烯非離子型表面活性劑；
[0038][17] 一種用于測(cè)量樣本中的待測(cè)成分的試劑盒，其中所述試劑盒包含:第一試齊U，其包含與待測(cè)成分相結(jié)合的第一抗體；以及第二試劑，其包含標(biāo)記的第二抗體和聚氧乙烯非離子型表面活性劑，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上；
[0039][18] [15]或[16]的試劑盒，其中脂肪酸烷醇酰胺是脂肪酸二乙醇酰胺；
[0040][19] [16]或[17]的試劑盒，其中聚氧乙烯非離子型表面活性劑是選自聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚和乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物的聚氧乙烯非離子型表面活性劑；
[0041][20] [16]的試劑盒，其中脂肪酸烷醇酰胺是脂肪酸二乙醇酰胺，并且聚氧乙烯非離子型表面活性劑是選自聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚和乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物的聚氧乙烯非離子型表面活性劑；
[0042][21] [15]至[20]任一項(xiàng)的試劑盒，其中第一試劑還包含膽汁酸衍生物；
[0043][22] [21]的試劑盒，其中膽汁酸衍生物是具有兩性離子表面活性劑作用的膽汁酸衍生物；
[0044][23] [22]的試劑盒，其中具有兩性離子表面活性劑作用的膽汁酸衍生物是
3-[(3-膽酰胺丙基)二甲銨基]丙磺酸鹽或3-[(3-膽酰胺丙基)二甲銨基]-2-羥基丙磺酸鹽；
[0045][24] [21]的試劑盒，其中膽汁酸衍生物是具有非離子型表面活性劑作用的膽汁酸衍生物；
[0046][25] [24]的試劑盒，其中具有非離子型表面活性劑作用的膽汁酸衍生物是N, N-雙(3-葡萄糖酰胺丙基)膽酰胺或N，N-雙(3-D-葡萄糖酰胺丙基)脫氧膽酰胺；
[0047][26] [15]至[25]任一項(xiàng)的試劑盒，其中第一抗體被固定化在不溶性載體上；
[0048][27] [15]至[26]任一項(xiàng)的試劑盒，其中樣本是全血；并且
[0049][28] [15]至[27]任一項(xiàng)的試劑盒，其中待測(cè)成分是MxA蛋白。
[0050][本發(fā)明的效果]
[0051]本發(fā)明提供了用于測(cè)量樣本中的待測(cè)成分的方法和試劑盒，其允許不受反應(yīng)溫度等的影響進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量。
[0052]執(zhí)行本發(fā)明的方式[0053](I)樣本
[0054]對(duì)于在本發(fā)明中使用的樣本沒(méi)有特別限制，只要它是允許由本發(fā)明進(jìn)行測(cè)量的樣本即可，其實(shí)例包括全血(血液)、血細(xì)胞、血清、血漿、脊髓液、尿液、組織和培養(yǎng)的細(xì)胞。全血包括將血漿與從全血獲得的血細(xì)胞級(jí)份相混合的樣本。全血可以是原樣從對(duì)象收集的血液，或者它可以是在對(duì)收集到的血液進(jìn)行處理后獲得的血液，并且處理過(guò)的血液是優(yōu)選的。處理的實(shí)例包括抗凝處理和溶血處理，并且可以將這些處理進(jìn)行組合。
[0055]當(dāng)成分(測(cè)量對(duì)象)是血細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)成分時(shí)，優(yōu)選將經(jīng)歷溶血處理的血液作為全血，經(jīng)歷抗凝和溶血兩種處理的血液是特別優(yōu)選的。抗凝處理的實(shí)例包括向收集到的血液加入EDTA、肝素等的處理。溶血處理的實(shí)例包括添加表面活性劑或皂角苷溶液、與低滲溶液混合、凍融、超聲處理等。
[0056](2)待測(cè)成分
[0057]對(duì)本發(fā)明中的待測(cè)成分沒(méi)有特別限制，只要它是能夠由本發(fā)明進(jìn)行測(cè)量的待測(cè)成分即可，其實(shí)例包括核酸、蛋白質(zhì)、脂類、維生素和多糖。核酸的實(shí)例包括DNA、RNA、ATP、ADP、AMP和環(huán)AMP。蛋白質(zhì)的實(shí)例包括酶、激素和各種肽。
[0058]本發(fā)明中的適合的待測(cè)成分包括細(xì)胞中包含的物質(zhì)和代謝物，優(yōu)選為由各種細(xì)胞因子例如干擾素在細(xì)胞中誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)等。待測(cè)成分的具體實(shí)例是MxA蛋白，其由I型干擾素在胞質(zhì)中誘導(dǎo)(參見(jiàn)前面提到的非專利文獻(xiàn)2至3)。
[0059](3)脂肪酸烷醇酰胺
[0060]本發(fā)明的脂肪酸烷醇酰胺的實(shí)例包括脂肪酸二乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、月旨肪酸N-甲基乙醇酰胺、脂肪酸單異丙醇酰胺和脂肪酸二異丙醇酰胺，并且脂肪酸二乙醇酰胺是優(yōu)選的。脂肪酸二乙醇酰胺的實(shí)例包括月桂酸二乙醇酰胺、羊蠟酸二乙醇酰胺、辛酸二乙醇酰胺、癸酸二乙醇酰胺、肉豆蘧酸二乙醇酰胺、棕櫚酸二乙醇酰胺、硬脂酸二乙醇酰胺、異硬脂酸二乙醇酰胺、油酸二乙醇酰胺、亞油酸二乙醇酰胺、辛基癸酸二乙醇酰胺、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、椰子脂肪酸二乙醇酰胺、牛油脂肪酸二乙醇酰胺、烷基烷醇酰胺和棕櫚仁油脂肪酸二乙醇酰胺。其中，油酸二乙醇酰胺、椰子脂肪酸二乙醇酰胺和棕櫚仁油脂肪酸二乙醇酰胺是優(yōu)選的。油酸二乙醇酰胺的具體實(shí)例(市售品)包括Stafoam DO和StafoamDOS(上述產(chǎn)品由日油社制造)；椰子脂肪酸二乙醇酰胺的具體實(shí)例(市售品)包括StafoamF、Stafoam DFC和Stafoam DF4(上述產(chǎn)品由日油社制造)；棕櫚仁油脂肪酸二乙醇酰胺的具體實(shí)例(市售品)包括Aminon PK-02S和Aminon PK-03S (上述產(chǎn)品由花王社制造)。
[0061]對(duì)脂肪酸烷醇酰胺在抗原-抗體反應(yīng)中的濃度沒(méi)有特別限制，只要它是能夠執(zhí)行本發(fā)明的測(cè)量方法的濃度即可，并且為例如0.1%至1.4%。在本發(fā)明中，脂肪酸烷醇酰胺可以單獨(dú)(一種)或以兩種以上的組合使用。
[0062](4)聚氧乙烯非離子型表面活性劑
[0063]對(duì)本發(fā)明中的聚氧乙烯非離子型表面活性劑沒(méi)有特別限制，只要它能夠使本發(fā)明的測(cè)量方法執(zhí)行即可，其實(shí)例包括聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物(在后文中寫(xiě)成POE -POP共聚物)、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(在后文中寫(xiě)成POE -POP烷基醚)、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基苯基醚(在后文中寫(xiě)成POE.POP烷基苯基醚)、聚氧乙烯聚環(huán)苯基醚(在后文中寫(xiě)成POE聚環(huán)苯基醚)、聚氧乙烯聚氧丙烯聚環(huán)苯基醚(在后文中寫(xiě)成POE.POP聚環(huán)苯基醚)或乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物(在后文中寫(xiě)成乙二胺POE.POP縮合物)。POE.POP共聚物、POE.POP烷基醚和乙二胺POE.POP縮合物是優(yōu)選的，POE.POP共聚物是特別優(yōu)選的。
[0064]POE.POP共聚物可以是嵌段共聚物或無(wú)規(guī)共聚物。POE.POP共聚物的具體實(shí)例(市售品)包括 PrononlO2、Prononl04> Pronon201> Pronon202B> Pronon204> Pronon208>Pronon403 (上述產(chǎn)品由日油社制造)、Emulgen PP-230、Emulgen PP-250、EmulgenPP-290(上述產(chǎn)品由花王社制造)、Pluronic L-1OU Pluronic L-103、Pluronic L-121、Pluronic L-122和Pluronic F-108 (上述產(chǎn)品由旭電化工業(yè)社制造)。
[0065]POE.Ρ0Ρ 烷基醚的具體實(shí)例(市售品)包括 Unilube50MB-l68、Unilube7roE_25、Unilube75DE-3800、Unilube MT-0620B(上述產(chǎn)品由日油社制造)、Unisafe PKA-5015、Unisafe PKA-5016 (上述產(chǎn)品由日油社制造)、EMALEX DAPE-220、EMALEX DAPE-230 (上述產(chǎn)品由 Nihon Emuls1n C0., Ltd.制造)、Noigen XL-400 和 Noigen XL-1000F (上述產(chǎn)品由第一工業(yè)制藥社制造)。
[0066]POE.POP烷基苯基醚的具體實(shí)例(市售品)包括Emulgen L40 (由花王社制造)、Dispanol KP189-40 和 Dispanol KP189R-40 (上述產(chǎn)品由日油社制造)。
[0067]POE聚環(huán)苯基醚的具體實(shí)例(市售品)包括Newcol714、Newcol707, Newcol2609,Newcol2614(上述產(chǎn)品由日本乳化劑社制造)、Emulgen A-60、Emulgen A-90、EmulgenB-66 (上述產(chǎn)品由花王社制造)、BLAUN0N DSP-9、BLAUN0N DSP-12.5、BLAUN0N TSP-5 和BLAUN0N TSP-16 (上述產(chǎn)品由青木油脂社制造)。
[0068]POE.POP聚環(huán)苯基醚的具體實(shí)例(市售品)包括Newcol26l6F、Newcol710-F,Newcol2608F、Newcol707_F(上述產(chǎn)品由日本乳化劑社制造)、Newkalgen CP-160和Newkalgen GP-120 (上述產(chǎn)品由竹本油脂社制造)。
[0069]乙二胺POE.POP縮合物的具體實(shí)例(市售品)包括乙二胺P040E040 (由日油社制造)和Pluronic TR-704 (由旭電化工業(yè)社制造)。
[0070]對(duì)聚氧乙烯非離子型表面活性劑在本發(fā)明的測(cè)量方法中的濃度沒(méi)有特別限制，只要它是能夠執(zhí)行本發(fā)明的測(cè)量方法的濃度即可，并且它是例如0.01%至1%，優(yōu)選為
0.05%至0.2%。在本發(fā)明中，聚氧乙烯非離子型表面活性劑可以單獨(dú)(一種)或以兩種以上的組合使用。
[0071](5)膽汁酸衍生物
[0072]對(duì)本發(fā)明中的膽汁酸衍生物沒(méi)有特別限制，只要它能夠執(zhí)行本發(fā)明的測(cè)量即可，其實(shí)例包括具有兩性離子表面活性劑作用的膽汁酸衍生物和具有非離子型表面活性劑作用的膽汁酸衍生物。具有兩性離子表面活性劑作用的膽汁酸衍生物的實(shí)例包括3-[(3_膽酰胺丙基)二甲銨基]丙磺酸(在后文中縮寫(xiě)為CHAPS)和3-[(3_膽酰胺丙基)二甲銨基]-2-羥基丙磺酸(在后文中縮寫(xiě)為CHAPS0)。
[0073]具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物的實(shí)例包括N，N-雙(3-D-葡萄糖酰胺丙基)膽酰胺(在后文中縮寫(xiě)為BIGCHAP)和N，N-雙(3-D-葡萄糖酰胺丙基)脫氧膽酰胺(在后文中縮寫(xiě)為脫氧-BIGCHAP)。
[0074]膽汁酸衍生物在本發(fā)明的測(cè)量方法中的使用濃度在I至50倍臨界膠束濃度(cmc)的范圍內(nèi)，具體來(lái)說(shuō)，I至10倍cmc濃度是優(yōu)選的。在本發(fā)明中，膽汁酸衍生物可以單獨(dú)(一種)或以兩種以上的組合使用。
[0075](6)抗體和標(biāo)記的抗體[0076]對(duì)本發(fā)明中的抗體沒(méi)有特別限制，只要它們是與待測(cè)成分特異性結(jié)合的抗體即可，并且盡管多克隆抗體和單克隆抗體兩者都可以使用，但優(yōu)選為單克隆抗體。此外，在本發(fā)明中使用的抗體可以是Fe部分被移除的抗體片段，例如通過(guò)抗體的木瓜蛋白酶處理而獲得的Fab、通過(guò)抗體的胃蛋白酶處理而獲得的F(ab’ )2以及通過(guò)抗體的胃蛋白酶處理和還原處理而獲得的Fab’。作為抗體片段，F(xiàn)(ab’)2是優(yōu)選的。
[0077]本發(fā)明中的抗體可以使用待測(cè)成分或與其表位相對(duì)應(yīng)的肽作為抗原，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)獲得，并且它也可以商購(gòu)。
[0078]在待測(cè)成分時(shí)MxA蛋白的情況下，與MxA蛋白特異性結(jié)合的抗體的實(shí)例包括分別由雜交瘤細(xì)胞系 KMl 122、KMl 123、KMl 124 (FERM BP-4729)、KM1125、KM1126、KM1127、KM1128、KMl 129、KMl 130、KMl 131、KMl 132 (FERM BP-4730)、KM1133、KM1134 和 KM1135(FERM BP-4731)產(chǎn)生的抗人類 MxA 蛋白單克隆抗體 KM1122、KM1123、KMl 124, KM1125、KMl 126, KM1127、KMl 128, KMl 129, KMl 130, KM1131、KM1132、KM1133、KMl 134 和 KM1135，其描述在國(guó)際公布W096/05230 號(hào)中。
[0079]本發(fā)明中的標(biāo)記的抗體是可在本發(fā)明的測(cè)量方法中使用，并且可以通過(guò)后面描述的方法，使用前面提到的抗體和下面描述的標(biāo)記物質(zhì)產(chǎn)生的抗體。
[0080](7)測(cè)量方法
[0081]本發(fā)明的測(cè)量方法是用于測(cè)量待測(cè)成分的方法，所述方法包含在脂肪酸烷醇酰胺存在下，將樣本中的待測(cè)成分與結(jié)合所述待測(cè)成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)；然后與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)以形成包含第一抗體、待測(cè)成分和標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上；并且測(cè)量形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量。此外，本發(fā)明的測(cè)量方法是用于測(cè)量待測(cè)成分的方法，所述方法包含將樣本中的待測(cè)成分與結(jié)合所述待測(cè)成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)；然后在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)，以形成包含第一抗體、待測(cè)成分和標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上；并且測(cè)量形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量。本發(fā)明的測(cè)量方法的具體實(shí)施方案如下所述。
[0082](I) 一種方法，其包含:在脂肪酸烷醇酰胺存在下，將待測(cè)成分與結(jié)合所述待測(cè)成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)(第一反應(yīng)步驟)；然后與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)(第二反應(yīng)步驟)，以形成包含第一抗體、待測(cè)成分和標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上；以及測(cè)量形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量(檢測(cè)步驟)。
[0083](2) 一種方法，其包含:將待測(cè)成分與結(jié)合所述待測(cè)成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)(第一反應(yīng)步驟)；然后在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下，與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)(第二反應(yīng)步驟)，以形成包含第一抗體、待測(cè)成分和標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上；以及測(cè)量形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量(檢測(cè)步驟)。
[0084](3) 一種方法，其包含:在脂肪酸烷醇酰胺存在下將待測(cè)成分與結(jié)合所述待測(cè)成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)(第一反應(yīng)步驟)；然后在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)(第二反應(yīng)步驟)，以形成包含第一抗體、待測(cè)成分和標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上；以及測(cè)量形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量(檢測(cè)步驟)。
[0085]在上面提到的(I)至(3)中，第一反應(yīng)步驟可以在添加膽汁酸衍生物下執(zhí)行。
[0086]在上面提到的(I)至(3)中，在第一反應(yīng)步驟中形成待測(cè)成分與第一抗體的免疫復(fù)合物。在第二反應(yīng)步驟中，標(biāo)記的第二抗體與第一反應(yīng)步驟中形成的第一抗體與待測(cè)成分的免疫復(fù)合物反應(yīng)，并形成第一抗體、待測(cè)成分與標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物。在檢測(cè)步驟中，測(cè)量在第二反應(yīng)步驟中形成的第一抗體、待測(cè)成分與標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量?？梢酝ㄟ^(guò)使用作為具有已知濃度的待測(cè)成分的標(biāo)準(zhǔn)材料來(lái)執(zhí)行類似測(cè)量，產(chǎn)生顯示出濃度與源自于標(biāo)記物的信息的量之間的關(guān)系的校準(zhǔn)曲線，并將檢測(cè)步驟中測(cè)定的標(biāo)記物的量與產(chǎn)生的校準(zhǔn)曲線相關(guān)聯(lián)，來(lái)確定所用樣本中待測(cè)成分的濃度。
[0087]標(biāo)準(zhǔn)材料可以從生物樣品制備，它也可以使用通過(guò)遺傳重組方法生產(chǎn)的重組抗原來(lái)制備。標(biāo)準(zhǔn)材料可以采取任何形式，例如溶液形式或冷凍干燥形式，并且取決于形式，它可以在使用時(shí)將其溶解在下面所述的水性介質(zhì)等中之后使用。此外，當(dāng)制備標(biāo)準(zhǔn)材料時(shí)，可以使用下面描述的水性介質(zhì)、金屬離子、鹽、糖、表面活性劑、蛋白、蛋白穩(wěn)定劑等。
[0088]在上面提到的(I)和(3)的測(cè)量方法中，可以通過(guò)預(yù)先將樣本與脂肪酸烷醇酰胺混合、或?qū)颖九c脂肪酸烷醇酰胺和膽汁酸衍生物混合，對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，然后將預(yù)處理的樣本與第一抗體進(jìn)行反應(yīng)。在上面提到的(2)的測(cè)量方法中，可以通過(guò)預(yù)先將樣本與膽汁酸衍生物混合，對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，然后將預(yù)處理的樣本與第一抗體進(jìn)行反應(yīng)。
[0089]本發(fā)明的測(cè)量方法可以適用于干化學(xué)或溶液中的反應(yīng)。對(duì)第一反應(yīng)步驟和第二反應(yīng)步驟中的反應(yīng)溫度沒(méi)有特別限制，只要它是能夠執(zhí)行本發(fā)明的測(cè)量方法的反應(yīng)溫度即可，并且是例如0°c至50°C，優(yōu)選為4°C至40°C。對(duì)反應(yīng)時(shí)間沒(méi)有特別限制，只要它是能夠執(zhí)行本發(fā)明的測(cè)量方法的反應(yīng)時(shí)間即可，并可以是例如I分鐘至72小時(shí)，優(yōu)選為5分鐘至20小時(shí)。
[0090]在第一反應(yīng)步驟與第二反應(yīng)步驟之間可以設(shè)置或可以不設(shè)置清洗步驟，并優(yōu)選設(shè)置清洗步驟。此外，在第二反應(yīng)步驟與檢測(cè)步驟之間可以設(shè)置或可以不設(shè)置清洗步驟，并優(yōu)選設(shè)置清洗步驟。第一抗體可以被固定化不動(dòng)化)或可以不被固定化(不動(dòng)化)在不溶性載體上，并且它優(yōu)選被固定化(不動(dòng)化)。如果第一抗體被固定化(不動(dòng)化)在不溶性載體上，在第一反應(yīng)步驟后清洗不溶性載體，能夠?qū)⒌谝环磻?yīng)步驟中形成的第一抗體與待測(cè)成分的免疫復(fù)合物與未反應(yīng)的成分(源自于樣本的成分、過(guò)量的第一抗體等)分離開(kāi)。同樣地，在第二反應(yīng)步驟后清洗不溶性載體，能夠?qū)⒌诙磻?yīng)步驟中形成的第一抗體、待測(cè)成分與標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物與未反應(yīng)成分(過(guò)量的標(biāo)記的第二抗體等)分離開(kāi)。清洗溶液的實(shí)例包括磷酸鹽緩沖鹽水[含有0.15mol/L氯化鈉的lOmmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.2 (在后文中標(biāo)為PBS)]、含有表面活性劑的PBS以及下面描述的水性介質(zhì)。表面活性劑的實(shí)例包括非離子型表面活性劑例如TWeen20。
[0091]對(duì)不溶性載體沒(méi)有特別限制，只要它能夠固定化(不動(dòng)化)第一抗體并能夠執(zhí)行抗原-抗體反應(yīng)和檢測(cè)反應(yīng)即可。用于不溶性載體的優(yōu)選材料的實(shí)例包括聚合物材料例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龍、聚甲基丙烯酸酯、明膠、瓊脂糖、纖維素、硝酸纖維素、醋酸纖維素、乙酰纖維素和聚對(duì)苯二甲酸乙二酯；玻璃；陶瓷；磁性粒子和金屬。不溶性載體的優(yōu)選形狀的實(shí)例包括管、珠子、板、微粒例如膠乳、棒等，優(yōu)選的是每塊板具有96個(gè)孔的聚苯乙烯微量滴定板等。[0092]將第一抗體固定化(不動(dòng)化)于不溶性載體的方法包括已知方法，例如使用物理鍵的方法、使用化學(xué)鍵的方法或其組合。物理鍵的實(shí)例包括靜電鍵、氫鍵和疏水鍵?；瘜W(xué)鍵的實(shí)例包括共價(jià)鍵和配位鍵。當(dāng)使用聚苯乙烯微量滴定板作為不溶性載體時(shí)，實(shí)例包括向板的孔加入第一抗體的溶液、然后在4°C至30°C下溫育I小時(shí)至I天以進(jìn)行物理吸附的固定方法。
[0093]第一抗體可以被直接或間接固定化(不動(dòng)化)在不溶性載體上。間接固定化(不動(dòng)化)的實(shí)例包括向固定有親和素的不溶性載體添加生物素化第一抗體的溶液、并將第一抗體通過(guò)生物素與親和素之間的特異性結(jié)合固定在不溶性載體上的方法。此外，可以將與第一抗體特異性結(jié)合的抗體固定在不溶性載體上，并可以通過(guò)該抗體將第一抗體固定在不溶性載體上?；蛘?，可以將第一抗體經(jīng)接頭通過(guò)共價(jià)鍵固定在不溶性載體上。接頭是例如能夠與第一抗體上的官能團(tuán)和不溶性載體表面上的官能團(tuán)兩者共價(jià)結(jié)合的分子。優(yōu)選的是在同一分子內(nèi)帶有能夠與第一抗體的官能團(tuán)反應(yīng)的第一反應(yīng)性基團(tuán)和能夠與不溶性載體表面上的官能團(tuán)反應(yīng)的第二反應(yīng)性基團(tuán)的分子，其中特別優(yōu)選的是第一反應(yīng)性基團(tuán)和第二反應(yīng)性基團(tuán)是不同基團(tuán)的分子。第一抗體的官能團(tuán)和不溶性載體表面上的官能團(tuán)的實(shí)例包括羧基、氨基、縮水甘油基、巰基、羥基、酰胺基、亞氨基、N-羥基琥珀?；婉R來(lái)酰亞胺基。接頭上的反應(yīng)性基團(tuán)的實(shí)例包括基團(tuán)例如芳基疊氮化物、碳二亞胺、酰肼、醛、羥甲基膦、酰亞胺酯、異氰酸酯、馬來(lái)酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯、五氟苯基(PFP)酯、補(bǔ)骨脂、批唳基二硫化物和乙烯砜。
[0094]當(dāng)?shù)谝豢贵w不被固定化(不動(dòng)化)在不溶性載體上時(shí)，可以將第一反應(yīng)步驟后的反應(yīng)溶液流過(guò)其上固定化(不動(dòng)化)有能夠與第一抗體反應(yīng)的物質(zhì)的不溶性載體，然后可以通過(guò)清洗不溶性載體將包含第一抗體和待測(cè)成分的免疫復(fù)合物與未反應(yīng)的成分(源自于樣本的成分、過(guò)量的第一抗體等)分離開(kāi)?？梢酝ㄟ^(guò)與前面提到的用于將第一抗體固定化(不動(dòng)化)于不溶性載體的方法類似的方法，將能夠與第一抗體反應(yīng)的物質(zhì)固定化(不動(dòng)化)在不溶性載體上。
[0095]用于標(biāo)記第二抗體的標(biāo)記物質(zhì)的實(shí)例包括酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、放射性同位素、生物素、洋地黃毒甙、含有標(biāo)簽序列的多肽、金屬膠體粒子和著色乳膠粒子。酶的實(shí)例包括堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酸酶和螢光素酶。熒光物質(zhì)的實(shí)例包括熒光素異硫氰酸酯(FITC)和羅丹明B-異硫氰酸酯(RITC)。其他熒光物質(zhì)的實(shí)例包括量子點(diǎn)(Science，281，2016-2018，1998)、藻膽蛋白類例如藻紅蛋白，以及發(fā)射熒光的蛋白例如綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)和藍(lán)色熒光蛋白(BFP)。發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括吖啶及其衍生物、釕絡(luò)合化合物和洛粉堿。對(duì)于釕絡(luò)合化合物來(lái)說(shuō)，優(yōu)選的是在Clin.Chem.37，9，1534-1539，1991中描述的與電子供體一起電化學(xué)發(fā)光的化合物。放射性同位素的實(shí)例包括3H、14C、35S、32P、125I和13110
[0096]含有標(biāo)簽序列的多肽的實(shí)例包括FLAG肽(FLAG標(biāo)簽,Asp Tyr Lys Asp Asp Asp AspLys)、聚組氨酸(His 標(biāo)簽，His His His His His His)、myc 表位肽(myc 標(biāo)簽，Glu Gln LysLeu He Ser Glu Glu Asp Leu)和凝血素表位妝(HA 標(biāo)簽，Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp TyrAla)。
[0097]可以通過(guò)在第二抗體的官能團(tuán)與標(biāo)記物質(zhì)的官能團(tuán)之間使用或不使用接頭進(jìn)行形成共價(jià)鍵的反應(yīng)，來(lái)執(zhí)行第二抗體的標(biāo)記。官能團(tuán)的實(shí)例包括羧基、氨基、縮水甘油基、巰基、羥基、酰胺基、亞氨基、羥基琥珀酰酯基、馬來(lái)酰亞胺基和異硫氰酸酯基?？梢栽谶@些官能團(tuán)之間執(zhí)行縮合反應(yīng)。
[0098]不使用接頭的連接方法的實(shí)例包括使用碳二亞胺化合物例如EDC的方法。在這種情形中，可以使用活性酯例如NHS或其衍生物。優(yōu)選的是異硫氰酸酯基團(tuán)與氨基之間的縮合反應(yīng)，因?yàn)樗恍杵渌噭?，并且通過(guò)在中性至弱堿性條件下進(jìn)行混合而簡(jiǎn)單進(jìn)行。
[0099]接頭的實(shí)例包括具有與第二抗體的官能團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)和與標(biāo)記物質(zhì)的官能團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)兩者的分子。接頭優(yōu)選為在同一分子內(nèi)具有與第二抗體的氨基酸殘基反應(yīng)的第一官能團(tuán)和與標(biāo)記物質(zhì)的官能團(tuán)反應(yīng)的第二官能團(tuán)的分子。其中特別優(yōu)選的是第一官能團(tuán)是與第二官能團(tuán)不同的基團(tuán)的分子。接頭的官能團(tuán)的實(shí)例包括上面描述的官能團(tuán)。
[0100]用于化學(xué)連接放射性同位素的方法的實(shí)例,包括在文獻(xiàn)(Antibody Immunoconj.Radiopharm., 3, 60, 1990)中描述的方法。
[0101]在標(biāo)記物質(zhì)是多肽例如酶、親和素、發(fā)射熒光的蛋白、藻膽蛋白和含有標(biāo)簽序列的多肽的情形中，可以按照已知的遺傳重組技術(shù)(《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual),第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001),通過(guò)產(chǎn)生含有標(biāo)記物質(zhì)與抗體的融合蛋白的編碼DNA的表達(dá)載體，將表達(dá)載體導(dǎo)入適合的宿主并對(duì)宿主進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)?？梢酝ㄟ^(guò)使用PCR等克隆各種編碼抗體的DNA和編碼標(biāo)記物質(zhì)的DNA,并通過(guò)連接酶反應(yīng)將每個(gè)DNA連接，來(lái)獲得編碼融合蛋白的DNA。
[0102]在檢測(cè)步驟中，測(cè)量在第二反應(yīng)步驟中形成的第一抗體、待測(cè)成分與標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量?？梢愿鶕?jù)用于測(cè)量標(biāo)記物量的標(biāo)記物質(zhì)來(lái)選擇適合的方法。在標(biāo)記物質(zhì)是著色物質(zhì)、即吸收某種波長(zhǎng)的光的物質(zhì)的情形中，可以使用分光光度計(jì)、多孔板讀板器等。在標(biāo)記物質(zhì)是熒光物質(zhì)的情形中，可以使用熒光分光光度計(jì)、熒光多孔板讀板器等。當(dāng)標(biāo)記物質(zhì)是發(fā)光物質(zhì)時(shí)，可以使用發(fā)光光度計(jì)、發(fā)光多孔板讀板器等。在標(biāo)記物質(zhì)是放射性同位素的情形中，，可以通過(guò)使用閃爍計(jì)數(shù)器、Y-孔計(jì)數(shù)器等測(cè)量放射活性來(lái)測(cè)定放射性同位素的量。
[0103]在標(biāo)記物是酶的情形中，測(cè)量標(biāo)記物的量意味著測(cè)量酶活性。可以通過(guò)將酶的底物與酶進(jìn)行反應(yīng)并測(cè)量形成的產(chǎn)物，來(lái)測(cè)量標(biāo)記物的量。在酶是過(guò)氧化物酶的情形中，可以通過(guò)例如吸光度方法、熒光方法、發(fā)光方法等來(lái)測(cè)量過(guò)氧化物酶活性。通過(guò)吸光度方法測(cè)量過(guò)氧化物酶活性的方法的實(shí)例，包括將過(guò)氧化物酶與過(guò)氧化物酶底物組合過(guò)氧化氫和氧化性著色發(fā)色團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)并使用分光光度計(jì)、多孔板讀板器等來(lái)測(cè)量反應(yīng)溶液的吸光度的方法。氧化性著色發(fā)色團(tuán)的實(shí)例包括隱色體類型的發(fā)色團(tuán)和氧化偶聯(lián)產(chǎn)色的發(fā)色團(tuán)。
[0104]隱色體類型的發(fā)色團(tuán)是在過(guò)氧化氫和過(guò)氧化物質(zhì)例如過(guò)氧化物酶存在下自身轉(zhuǎn)變成染料的物質(zhì)。其具體實(shí)例包括四甲基聯(lián)苯胺、鄰苯二胺、IO-N-羧甲基氨甲?；?3，7-雙(二甲基氨基)-1OH-吩噻嗪(CCAP)UO-N-甲基氨甲?；鵢3，7-雙(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’ -雙(二甲基氨基)二苯胺鈉鹽(DA-64)、4，4’-雙(二甲基氨基)二苯胺和雙[3-雙(4-氯苯基)甲基-4- 二甲基氨基苯基]胺(BCMA)。
[0105]氧化偶聯(lián)產(chǎn)色的發(fā)色團(tuán)是在過(guò)氧化氫和過(guò)氧化物質(zhì)例如過(guò)氧化物酶存在下通過(guò)兩種化合物的氧化偶聯(lián)形成染料的物質(zhì)。兩種化合物的組合的實(shí)例包括成色劑與苯胺化合物的組合(Trinder試劑)、以及成色劑與苯酹化合物的組合。成色劑的實(shí)例包括4-氨基安替比林(4-AA)和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙。苯胺化合物的實(shí)例包括N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基_N_(2_羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基_N_(2_羥基-3-磺丙基)_3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N，N-二甲基-3-甲基苯胺、N，N-二(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’ -琥珀?；叶?EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’ -乙?；叶泛蚇-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-4_氟_3，5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)。苯酚化合物的實(shí)例包括苯酚、4-氯苯酚、3-甲酚和3-羥基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)。
[0106]通過(guò)熒光方法測(cè)量過(guò)氧化物酶活性的方法的實(shí)例，包括將過(guò)氧化物酶與過(guò)氧化物酶底物組合過(guò)氧化氫和熒光物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)并使用熒光分光光度計(jì)、熒光多孔板讀板器等來(lái)測(cè)量產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的方法。熒光物質(zhì)的實(shí)例包括4-羥基苯基乙酸、3-(4-羥基苯基)丙酸和香豆素。
[0107]通過(guò)發(fā)光方法測(cè)量過(guò)氧化物酶活性的方法的實(shí)例，包括將過(guò)氧化物酶與過(guò)氧化物酶的底物組合過(guò)氧化氫和發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)并使用發(fā)光強(qiáng)度計(jì)、發(fā)光多孔板讀板器等來(lái)測(cè)量產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度的方法。發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括魯米諾化合物和光澤精化合物。
[0108]在酶是堿性磷酸酶的情形中，可以通過(guò)例如發(fā)光方法來(lái)測(cè)量堿性磷酸酶活性。通過(guò)發(fā)光方法測(cè)量堿性磷酸酶活性的方法的實(shí)例，包括將堿性磷酸酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)，并使用發(fā)光強(qiáng)度計(jì)、發(fā)光多孔板讀板器等來(lái)測(cè)量產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度的方法。堿性磷酸酶的底物的實(shí)例包括3-(2’ -螺金剛烷)-4-甲氧基_4-(3’ -磷酰氧基)苯基-1，2-二氧雜環(huán)丁燒二納鹽(AMPPD)、2_氣_5_{4_甲氧基螺[1，2- 二氧雜環(huán)丁燒-3，2’ _(5’ -氣)二環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷]-4-基}苯基磷酸二鈉鹽(CDP-Star?)、3_{4_甲氧基螺[1，2- 二氧雜環(huán)丁烷-3，2’ -(5，-氯)三環(huán)[3.3.1.13，7]癸]_4_基}苯基磷酸二鈉鹽(CSPD?)和[10-甲基-9 (1H)-亞吖啶基]苯氧基甲基磷酸二鈉鹽(Lumigen? APS-5)。
[0109]在酶是β -D-半乳糖苷酶的情形中，可以通過(guò)例如吸光度方法(比色方法)、發(fā)光方法或熒光方法來(lái)測(cè)量β -D-半乳糖苷酶活性。通過(guò)吸光度方法(比色方法)測(cè)量β -D-半乳糖苷酶活性的方法的實(shí)例，包括使用鄰硝基苯基_β-D-吡喃半乳糖苷的方法。通過(guò)發(fā)光方法測(cè)量β-D-半乳糖苷酶活性的方法的實(shí)例，包括將β-D-半乳糖苷酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)并使用發(fā)光強(qiáng)度計(jì)、發(fā)光多孔板讀板器等來(lái)測(cè)量反應(yīng)溶液的發(fā)光的方法。β -D-半乳糖苷酶的底物的實(shí)例包括Galacton-Plus (由Applied B1systems制造)及其類似物。通過(guò)突光方法測(cè)量β-D-半乳糖苷酶的方法的實(shí)例，包括將β-D-半乳糖苷酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)并使用熒光分光光度計(jì)、熒光多孔板讀板器等來(lái)測(cè)量反應(yīng)溶液的熒光的方法。β -D-半乳糖苷酶的底物的實(shí)例包括4-甲基傘形酮基-β -D-吡喃半乳糖苷。
[0110]在酶是螢光素酶的情形中，可以通過(guò)例如發(fā)光方法來(lái)測(cè)量螢光素酶活性。通過(guò)發(fā)光方法測(cè)量螢光素酶活性的方法的實(shí)例，包括將螢光素酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)并使用發(fā)光強(qiáng)度計(jì)、發(fā)光多孔板讀板器等來(lái)測(cè)量反應(yīng)溶液的發(fā)光的方法。螢光素酶底物的實(shí)例包括螢光素和腔腸素。
[0111]當(dāng)標(biāo)記物質(zhì)是熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、放射性同位素或酶之外的物質(zhì)(被稱為物質(zhì)A)時(shí)，標(biāo)記的物質(zhì)B是與物質(zhì)A特異性結(jié)合并用熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、放射性同位素、酶等標(biāo)記的物質(zhì)(物質(zhì)B)，將其與在第二反應(yīng)步驟中形成的第一抗體、待測(cè)成分與標(biāo)記的第二抗體(即用物質(zhì)A標(biāo)記的第二抗體)的免疫復(fù)合物進(jìn)行反應(yīng)，以形成第一抗體、待測(cè)成分、標(biāo)記的第二抗體(即用物質(zhì)A標(biāo)記的第二抗體)與標(biāo)記的物質(zhì)B的免疫復(fù)合物；然后可以通過(guò)用上面提到的方法測(cè)量該形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量，來(lái)測(cè)量樣本中的待測(cè)成分。物質(zhì)B的實(shí)例包括針對(duì)物質(zhì)A的抗體、親和素(當(dāng)物質(zhì)A是生物素時(shí))、鏈親合素(當(dāng)物質(zhì)A是生物素時(shí))和生物素(當(dāng)物質(zhì)A是親和素或鏈親合素時(shí))。針對(duì)物質(zhì)A的抗體可以是抗體片段，抗體片段的實(shí)例包括上面提到的Fab、F(ab’ )2和Fab’。
[0112]同時(shí)，本發(fā)明的測(cè)量方法(I)和(2)的第一反應(yīng)步驟也可應(yīng)用于競(jìng)爭(zhēng)方法。具體來(lái)說(shuō)，可以提出下面的實(shí)施方案作為競(jìng)爭(zhēng)方法的實(shí)例:
[0113](4) 一種方法，其包含:在脂肪酸烷醇酰胺存在下，將待測(cè)成分與標(biāo)記物結(jié)合于競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)上的標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和結(jié)合待測(cè)成分和標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)兩者的抗體進(jìn)行反應(yīng)(競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)步驟)；并測(cè)量形成的標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)與抗體的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量(檢測(cè)步驟)。
[0114](5) 一種方法，其包含:在脂肪酸烷醇酰胺存在下，將待測(cè)成分與競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和標(biāo)記的抗體進(jìn)行反應(yīng)，其中標(biāo)記物被結(jié)合于與待測(cè)成分和競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)兩者相結(jié)合的抗體(競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)步驟)；并測(cè)量形成的競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)與標(biāo)記抗體的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量(檢測(cè)步驟)。
[0115]競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)步驟可以在添加膽汁酸衍生物下執(zhí)行。在競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)步驟與檢測(cè)步驟之間可以設(shè)置或可以不設(shè)置清洗步驟，并優(yōu)選設(shè)置清洗步驟。清洗步驟的實(shí)例包括在上面提到的測(cè)定方法(I)至(3)中的清洗步驟。
[0116]在上面提到的(4)的方法中，與待測(cè)成分和標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)兩者相結(jié)合的抗體可以被或可以不被固定化(不動(dòng)化)在不溶性載體上，并且它優(yōu)選被固定化(不動(dòng)化)。此夕卜，在上面提到的(5)的方法中，競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)可以被或可以不被固定化(不動(dòng)化)在不溶性載體上，并且它優(yōu)選被固定化(不動(dòng)化)。
[0117]競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)步驟可以在存在或不存在水性介質(zhì)下執(zhí)行，并優(yōu)選在存在水性介質(zhì)下執(zhí)行。水性介質(zhì)的實(shí)例包括下面描述的水性介質(zhì)等。在這里，競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)是指能夠與“結(jié)合待測(cè)成分的抗體”結(jié)合并且其結(jié)合與待測(cè)成分是競(jìng)爭(zhēng)性的物質(zhì)，包括待測(cè)成分本身。當(dāng)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)方法測(cè)量樣本中的待測(cè)成分時(shí)，使用競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)。因此，在競(jìng)爭(zhēng)方法中使用的與待測(cè)成分結(jié)合的抗體，是與待測(cè)成分和競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)結(jié)合的抗體，并且盡管它通過(guò)與待測(cè)成分結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，但它也通過(guò)與競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)結(jié)合而形成免疫復(fù)合物。
[0118]競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)優(yōu)選為具有與結(jié)合于所述成分的抗體所識(shí)別的表位一致的結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。此外，優(yōu)選競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)對(duì)結(jié)合于待測(cè)成分的抗體的結(jié)合強(qiáng)度，與所述成分對(duì)抗體的結(jié)合強(qiáng)度相當(dāng)。待測(cè)成分自身優(yōu)選作為競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)?？梢允褂酶?jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和前面提到的標(biāo)記物質(zhì)，通過(guò)與用于前面提到的標(biāo)記的第二抗體相似的方法來(lái)制備標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)。
[0119]在本發(fā)明中使用的水性介質(zhì)的實(shí)例包括去離子水、蒸餾水和緩沖液，優(yōu)選為緩沖液。對(duì)用于制備緩沖液的緩沖劑沒(méi)有特別限制，只要它具有緩沖能力即可。緩沖劑的實(shí)例包括具有PHl至11的緩沖劑，例如乳酸緩沖劑、檸檬酸緩沖劑、乙酸緩沖劑、琥珀酸緩沖劑、鄰苯二甲酸緩沖劑、磷酸緩沖劑、三乙醇胺緩沖劑、二乙醇胺緩沖劑、賴氨酸緩沖劑、巴比妥酸緩沖劑、咪唑緩沖劑、蘋(píng)果酸緩沖劑、草酸緩沖劑、甘氨酸緩沖劑、硼酸緩沖劑、碳酸緩沖劑、甘氨酸緩沖劑或Good’ s緩沖劑。
[0120]Good’ s緩沖劑的實(shí)例包括2-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖劑、雙(2_羥基乙基)亞氨基三(羥基甲基)甲烷(Bis-Tris)緩沖劑、三(羥基甲基)氨基甲烷(Tris)緩沖劑、N-(2-乙酰胺基)亞氨基二乙酸(ADA)緩沖劑、哌嗪-N，N’ -雙(2-乙磺酸)(PIPES)緩沖劑、2-[N-(2-乙酰胺基)氨基]乙磺酸(ACES)緩沖劑、3-嗎啉-2-羥基丙磺酸(MOPSO)緩沖劑、2-[N，N-雙(2-羥基乙基)氨基]乙磺酸(BES)緩沖劑、3-嗎啉丙磺酸(MOPS)緩沖劑、
2-{N-[三(羥基甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)緩沖劑、N-(2-羥基乙基)-N’-(2-磺乙基)哌嗪(HEPES)緩沖劑、3-[N，N-雙(2-羥基乙基)氨基]_2_羥基丙磺酸(DIPSO)緩沖齊U、2-羥基-3-{[N-三(羥基甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPSO)緩沖劑、哌嗪-N，N’-雙(2-羥基丙-3-磺酸)(POPSO)緩沖劑、N-(2-羥基乙基)-N’ -(2-羥基-3-磺丙基)哌嗪(HEPPSO)緩沖劑、N-(2-羥基乙基)-N’ _(3_磺丙基)哌嗪(EPPS)緩沖劑、tricine [N-三(羥基甲基)甲基甘氨酸]緩沖劑、vicine[N，N-雙(2-羥基乙基)甘氨酸]緩沖劑、3_[N_三(羥基甲基)甲基]氨基丙磺酸(TAPS)緩沖劑、2-(N-環(huán)己基氨基)乙磺酸(CHES)緩沖劑、
3-(N-環(huán)己基氨基)-2-羥基丙磺酸(CAPSO)緩沖劑和3-(N-環(huán)己基氨基)丙磺酸(CAPS)緩沖劑。
[0121]對(duì)緩沖液的濃度沒(méi)有特別限制，只要它是適合于測(cè)量的濃度即可，并優(yōu)選為0.001至2.0mol/L，更優(yōu)選為0.005至1.0mol/L，特別優(yōu)選為0.01至0.lmol/L。
[0122]在本發(fā)明的測(cè)量方法中，可以共同存在金屬離子、鹽、糖、防腐劑、蛋白質(zhì)、蛋白穩(wěn)定劑等。金屬離子的實(shí)例包括鎂離子、錳離子和鋅離子。鹽的實(shí)例包括氯化鈉和氯化鉀。糖的實(shí)例包括甘露糖醇和山梨糖醇。防腐劑的實(shí)例包括疊氮化鈉、抗生素(鏈霉素、青霉素、慶大霉素等)、BioAce、Proclin300和Proxel GXL。蛋白質(zhì)的實(shí)例包括牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FBS)、酪蛋白和 BlockAce (由 Dainippon Pharmaceutical C0., Ltd.制造)。蛋白穩(wěn)定劑的實(shí)例包括過(guò)氧化物酶穩(wěn)定化緩沖液(Peroxidase Stabilizing Buffer,由 DakoCytomation 制造)。
[0123](8)用于測(cè)量的試劑盒
[0124]本發(fā)明的用于測(cè)量的試劑盒是用于免疫測(cè)量樣本中的待測(cè)成分的試劑盒，并且可用于本發(fā)明的測(cè)量方法。
[0125]本發(fā)明的測(cè)量用試劑盒是包含如下物質(zhì)的測(cè)量用試劑盒:包含與待測(cè)成分相結(jié)合的第一抗體和脂肪酸烷醇酰胺的第一試劑；以及包含標(biāo)記的第二抗體的第二試劑，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上。此外，本發(fā)明的測(cè)量用試劑盒是包含如下物質(zhì)的測(cè)量用試劑盒:包含與待測(cè)成分相結(jié)合的第一抗體的第一試劑；以及包含標(biāo)記的第二抗體和聚氧乙烯非離子型表面活性劑的第二試劑，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上。本發(fā)明的測(cè)量用試劑盒的具體實(shí)施方案如下所示。
[0126](I) 一種用于測(cè)量樣本中的待測(cè)成分的試劑盒，其包含:包含與待測(cè)成分相結(jié)合的第一抗體和脂肪酸烷醇酰胺的第一試劑；以及包含標(biāo)記的第二抗體的第二試劑，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上。[0127](2) 一種用于測(cè)量樣本中的待測(cè)成分的試劑盒，其包含:包含與待測(cè)成分相結(jié)合的第一抗體的第一試劑；以及包含標(biāo)記的第二抗體和聚氧乙烯非離子型表面活性劑的第二試劑，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上。
[0128](3 一種用于測(cè)量樣本中的待測(cè)成分的試劑盒，其包含:包含與待測(cè)成分相結(jié)合的第一抗體和脂肪酸烷醇酰胺的第一試劑；以及包含標(biāo)記的第二抗體和聚氧乙烯非離子型表面活性劑的第二試劑，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上。
[0129]第一試劑可以含有膽汁酸衍生物。
[0130]在上面提到的⑴和(3)的試劑盒中，第一試劑可以采取將包含脂肪酸烷醇酰胺的試劑[第一試劑(A)]與包含與待測(cè)成分相結(jié)合的第一抗體的試劑[第一試劑(B)]分開(kāi)儲(chǔ)存的形式。在上面提到的(I)和(3)的試劑盒中，當(dāng)?shù)谝辉噭┲邪懼嵫苌飼r(shí)，第一試劑可以采取將包含脂肪酸烷醇酰胺和膽汁酸衍生物的試劑[第一試劑(A)]與包含與待測(cè)成分相結(jié)合的第一抗體的試劑[第一試劑(B)]分開(kāi)儲(chǔ)存的形式。在上面提到的(2)的試劑盒中，當(dāng)?shù)谝辉噭┲邪懼嵫苌飼r(shí)，第一試劑可以采取將包含膽汁酸衍生物的試劑[第一試劑(A)]與包含與待測(cè)成分相結(jié)合的第一抗體的試劑[第一試劑(B)]分開(kāi)儲(chǔ)存的形式。在這里，第一試劑(A)可以用作樣本預(yù)處理溶液。
[0131]本發(fā)明的試劑盒的形式可以是任何形式，例如溶液形式或冷凍干燥形式。本發(fā)明的試劑盒的各第一抗體、標(biāo)記的第二抗體、脂肪酸烷醇酰胺、聚氧乙烯非離子型表面活性劑和膽汁酸衍生物的實(shí)例，包括上文提到的那些。此外，如果需要，本發(fā)明的試劑盒可以包括前面提到的水性介質(zhì)、金屬離子、鹽、糖、防腐劑、蛋白質(zhì)、蛋白穩(wěn)定劑等。
[0132]在下文中，將參考實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，所述實(shí)施例不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。
[0133][實(shí)施例1]
[0134][I]抗MxA蛋白單克隆抗體的制備
[0135]如下所述，制備了兩種類型的具有不同表位的抗人類MxA蛋白單克隆抗體KMl 124 (W096/05230)和 KMl 135 (W096/05230)。KMl 124 是與人類 MxA 蛋白從氨基端算起 220至297位殘基中存在的表位相結(jié)合的小鼠單克隆抗體，KM1135是與人類MxA蛋白從氨基端算起10至220位殘基中存在的表位相結(jié)合的小鼠單克隆抗體。
[0136]將產(chǎn)生單克隆抗體KM1124的雜交瘤細(xì)胞系KM1124(FERMBP-4729)和產(chǎn)生單克隆抗體KM1135的雜交瘤細(xì)胞系KM1135 (FERM BP-4731)，以5至20xl06個(gè)細(xì)胞/動(dòng)物的量分別腹膜內(nèi)注射到降植烷處理過(guò)的8周齡雌性裸小鼠(Balb/c)中。在10至21天后，雜交瘤細(xì)胞系在腹水中成癌，并從蓄積腹水液的小鼠收集腹水液。將收集的腹水液以3000rpm離心5分鐘以除去固形物，并收集上清液。將從這些上清液通過(guò)辛酸沉淀方法(《抗體實(shí)驗(yàn)指南》(Antibodies-A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)純化的單克隆抗體，用于免疫測(cè)量MxA蛋白的方法中。
[0137][2]重組MxA蛋白的制備
[0138]使用通過(guò)在pET_14b 載體(由 Novagen, EMD Biosciences 制造)的 NdeI 和 BamHI之間插入含有編碼人類MxA蛋白的cDNA(基于Genbank中登記為BC032602的核苷酸序列制備)的Nde1-BamHI片段而產(chǎn)生的人類MxA蛋白表達(dá)載體pET14b_MxA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)pLysS株。該轉(zhuǎn)化體表達(dá)N-端添加有His標(biāo)簽的MxA蛋白。[0139]將獲得的轉(zhuǎn)化體接種在5mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C下執(zhí)行振搖培養(yǎng)，直到600nm處的光密度(0D600)達(dá)到0.5。將該培養(yǎng)液接種到250mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，并在37°C下執(zhí)行振搖培養(yǎng)，直到600nm處的光密度達(dá)到0.3至0.5。向該培養(yǎng)液加入終濃度為0.4mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，并將培養(yǎng)在37°C振搖下繼續(xù)執(zhí)行2小時(shí)。將獲得的培養(yǎng)液在4°C以3000rpm離心10分鐘，以收集細(xì)菌細(xì)胞。在MxA蛋白制備之前將細(xì)菌細(xì)胞儲(chǔ)存在_80°C。
[0140]由于MxA蛋白以包含體形式存在于細(xì)菌細(xì)胞中，因此將細(xì)菌細(xì)胞在冰上融化，并加入20mL冰冷的結(jié)合緩沖液(5mmol/L咪唑，0.5mol/L氯化鈉，20mmol/L Tris-HCl,pH7.9)以得到懸液。對(duì)細(xì)菌細(xì)胞懸液進(jìn)行5次30秒的超聲處理以破碎細(xì)胞，然后在4°C以4000rpm離心10分鐘。除去上清液，并將沉淀懸浮在20mL添加的冰冷的結(jié)合緩沖液中。同樣地再次執(zhí)行超聲處理和離心。除去上清液，向沉淀加入20mL含有6mol/L尿素的結(jié)合緩沖液，以得到懸液。在同樣的超聲處理后，將混合物留置冰上30分鐘以溶解包含體，然后在4°C以10，OOOrpm離心30分鐘。收集上清液,然后通過(guò)0.45-nm mi I Iipore濾器過(guò)濾。
[0141]向獲得的溶液加入 0.5mL N1-NTA His.Bind 樹(shù)脂(由 Novagen, EMD Biosciences制造)，然后在4V旋轉(zhuǎn)2小時(shí)下整體混合，使MxA蛋白通過(guò)His標(biāo)簽與樹(shù)脂結(jié)合。將該混合物在4°C以3000rpm離心2分鐘以回收樹(shù)脂。在向樹(shù)脂添加IOmL冰冷的含6mol/L尿素的結(jié)合緩沖液后，整體在4°C以3000rpm離心2分鐘以回收樹(shù)脂。在重復(fù)該清洗操作后，進(jìn)一步向樹(shù)脂添加IOmL冰冷的清洗緩沖液(6mol/L尿素，60mmol/L咪唑,0.5mol/L氯化鈉，20mmol/L Tris-HCl, pH7.9)，并整體在4°C以3000rpm離心2分鐘以回收樹(shù)脂。
[0142]向樹(shù)脂添加IOmL冰冷的洗脫緩沖液(6mol/L尿素，lmol/L咪唑,0.5mol/L氯化鈉，20mmol/L Tris-HCl, pH7.9)，在4°C旋轉(zhuǎn)2小時(shí)下整體混合，以從樹(shù)脂洗脫MxA蛋白。將該含有樹(shù)脂的混合物在4°C以3000rpm離心2分鐘，并收集上清MxA蛋白溶液。使用收集到的MxA蛋白溶液來(lái)制備測(cè)量MxA蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0143][3]天然MxA蛋白的制備
[0144]將黏附性人類成膠質(zhì)細(xì)胞瘤來(lái)源的細(xì)胞系T98G(購(gòu)自DSPharmaBiomedicalC0.，Ltd.，J.Cell.Physiol.，99，43-54，1979)，在添加 了用 10 % 胎牛血清(FBS)、I % 非必需氨基酸(由Invitrogen制造)和lmmol/L丙酮酸鈉(由Invitrogen制造)增補(bǔ)的IOmLE-MEM 培養(yǎng)基(由 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造)的 10-mL 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使用二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)箱(5% C02，37°C )培養(yǎng)2至3天，直到達(dá)到合生。當(dāng)細(xì)胞變得合生時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到150-cm2培養(yǎng)瓶并進(jìn)行同樣的培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞在150-cm2培養(yǎng)瓶中變得合生時(shí)，通過(guò)吸取除去培養(yǎng)基，并使用PBS (-)(既不含鈣也不含鎂的磷酸緩沖液)清洗細(xì)胞，然后通過(guò)添加0.02% EDTA進(jìn)行清洗。接下來(lái)，在通過(guò)添加0.25%胰蛋白酶溶液除去細(xì)胞后，通過(guò)添加等量培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的作用。收集細(xì)胞并在25°C下離心(l，400rpm)三次。對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞以約IxlO5個(gè)細(xì)胞/mL懸浮在含有新鮮培養(yǎng)基的150-cm2培養(yǎng)瓶中，并加入干擾素a A蛋白(Funakoshi)以獲得2，000U/mL的干擾素a A蛋白溶液。使用二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)箱將細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，通過(guò)吸取除去培養(yǎng)基，使用PBS(-)清洗細(xì)胞，然后通過(guò)添加0.02% EDTA進(jìn)行清洗。接下來(lái)，在通過(guò)添加0.25%胰蛋白酶溶液除去細(xì)胞后，通過(guò)添加等量培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的作用。收集細(xì)胞并在25°C下離心(l，400rpm)三次。。除去上清液，加入 0.5mL 低滲緩沖液(10mmol/L HEPES, 1.5mmol/L MgCl2,10mmol/L KCl)并將細(xì)胞懸浮，收集溶液并將其儲(chǔ)存在_80°C直至使用。
[0145][4]抗MxA蛋白抗體固定化板的制備
[0146]將[I]中制備的抗MxA蛋白單克隆抗體KM1135用含有100mmol/L氯化鈉的100mmol/L磷酸緩沖液(pH7.5)稀釋至5 μ g/mL的濃度，并將混合物以100 μ L/孔分配到96孔微量滴定板(由Nalge Nunc Internat1nal制造)中。在將板放置3天后,通過(guò)吸取除去上清液，在每個(gè)孔中分配300 μ L含有I % BlockAce (由大日本制藥社制造)和50mmol/L氯化鈉的PH7.2的磷酸緩沖液，并通過(guò)將板放置過(guò)夜在室溫下進(jìn)行阻斷。在除去阻斷溶液后，使用PBS進(jìn)行清洗。在使用真空干燥器干燥三天后，將板用作抗MxA蛋白單克隆抗體固定化板。
[0147][5]過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗MxA蛋白抗體的制備
[0148]通過(guò)如下所述的馬來(lái)酰亞胺方法，使[I]中制備的抗MxA蛋白單克隆抗體KM1124與過(guò)氧化物酶(在后文中縮寫(xiě)為P0D)結(jié)合，以得到POD標(biāo)記的抗MxA蛋白抗體。
[0149]首先，將含有2mg[l]中制備的KM1124的磷酸緩沖液用0.lmol/L硼酸緩沖液(pH8.0)替換,并使用Amicon攪拌式超濾裝置(由Millipore制造)將其濃縮至ImL體積。向濃縮溶液加入40 μ L含有2.15mg/mL2-亞氨基硫燒鹽酸鹽(由Pierce制造)的0.1mol/L硼酸緩沖液(pH8.0)，并在攪拌后在30°C執(zhí)行30分鐘溫育。在上面提到的反應(yīng)中，2-亞氨基硫烷鹽酸鹽以相對(duì)于KMl 12450倍的摩爾比率使用。使用以增補(bǔ)了 5mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA.2Na)的 0.lmol/L 憐酸緩沖液(pH6.0)平衡的 Sephadex G25 (由 AmershamB1science制造)柱(1.5_cm直徑x30cm),對(duì)反應(yīng)過(guò)的溶液進(jìn)行凝膠過(guò)濾，以除去未反應(yīng)的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽，并收集巰基化的KM1124。使用Amicon攪拌式超濾裝置將收集到的溶液濃縮至5mL體積。
[0150]另一方面，將相當(dāng)于KM1124的5倍摩爾比率的2.5mg POD (由東洋紡織社制造，過(guò)氧化物酶1-C)溶解在250 μ L0.lmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)中。在將該溶液在30°C加溫5分鐘后，加入36μ L的20mg/mL N-(6-馬來(lái)酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺(EMCS，由同仁化學(xué)研究所社制造)在N, N-二甲基甲酰胺(由Nacalai Tesque制造)中的溶液并攪拌,在30°C進(jìn)行30分鐘溫育。在上面提到的反應(yīng)中，EMCS以相對(duì)于P0D40倍的摩爾比率使用。使用以0.lmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)平衡的Sephadex G25柱(1.5_cm直徑x30cm)對(duì)反應(yīng)過(guò)的溶液進(jìn)行凝膠過(guò)濾，以除去未反應(yīng)的EMCS，并收集馬來(lái)酰亞胺化的P0D。使用Amicon攪拌式超濾裝置將收集到的溶液濃縮。
[0151 ] 將如上所述獲得的巰基化的KMl 124的溶液和馬來(lái)酰亞胺化的POD的溶液混合，使用Amicon攪拌式超濾裝置將其濃縮至2mL體積，然后在30°C執(zhí)行I小時(shí)溫育。將獲得的標(biāo)記的抗體儲(chǔ)存在_80°C直至使用。
[0152][6]樣本稀釋液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
[0153]制備了具有下列組成的樣本稀釋液。
[0154]HEPES (由同仁化學(xué)研究所社制造)(pH 8.0)0.1 mol/L
CHAPS (由同仁化學(xué)研究所社制造)4.9%
表面活性劑(類型和濃度描述在表1中)
氯化鈉].5mol/L
BSA (由 InterGen 制造)0.1 %
疊氮化鈉0.1%
[0155]將在上述[2]中制備的重組MxA蛋白溶液用上述樣本稀釋液稀釋，以制備0(只含樣本稀釋液)、0.375、0.75、1.5、3、6、12和24ng/mL每種濃度的MxA蛋白溶液，并將這些溶液用作標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0156][7]校準(zhǔn)曲線的產(chǎn)生
[0157]向在上述[4]中產(chǎn)生的抗MxA蛋白抗體(KM1135)固定化板加入100 μ L在[6]中產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)溶液并溫育I小時(shí)，使MxA蛋白與抗體結(jié)合。在除去反應(yīng)溶液后，將添加400 μ L清洗溶液[含0.05% Tween20 (由關(guān)東化學(xué)社制造)的PBS]然后除去它的清洗操作執(zhí)行5次。接下來(lái)，將在[5]中產(chǎn)生的POD標(biāo)記的抗MxA蛋白抗體(KM1124)用POD標(biāo)記的抗體稀釋液(液體組合物)緩沖液[50mmol/L Bis-Tris (由同仁化學(xué)研究所社制造)，0.1%BSA(由InterGen制造)，0.01% 4-氨基安替比林(4-AA ;由埼京化成社制造)，0.035 %Proclin300(由 Sigma 制造)和 0.1 % Nonidet P40]稀釋 800 倍，加入 100 μ L 該溶液并執(zhí)行30分鐘的溫育。除去反應(yīng)溶液，將添加400 μ L上面提到的清洗溶液清洗板然后除去清洗溶液的清洗操作執(zhí)行5次。在暗處加入100μ L含0.05%四甲基聯(lián)苯胺和過(guò)氧化氫的POD產(chǎn)色底物TMBlue (由Serological制造)，并在室溫執(zhí)行10分鐘的溫育。通過(guò)加入100 μ L0.5mol/L硫酸并在室溫溫育10分鐘來(lái)終止反應(yīng)。使用讀板器在450nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。通過(guò)一系列這樣的操作，產(chǎn)生了顯示出MxA蛋白濃度與吸光度之間的關(guān)系的校準(zhǔn)曲線。
[0158]接下來(lái)，使用培養(yǎng)的細(xì)胞或全血樣品代替上面提到的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣本執(zhí)行類似操作。獲得每個(gè)樣本的測(cè)量值，并將獲得的測(cè)定值與事先產(chǎn)生的校準(zhǔn)曲線相關(guān)聯(lián)，以確定每個(gè)樣本中的MxA蛋白濃度。
[0159][8]檢測(cè)MxA蛋白測(cè)量中測(cè)定值的變動(dòng)-1 ( 一次反應(yīng))
[0160]將在上述[3]中使用的黏附性人類成膠質(zhì)細(xì)胞瘤來(lái)源的細(xì)胞系T98G用干擾素刺激以誘導(dǎo)MxA蛋白，并獲得天然MxA蛋白。通過(guò)將獲得的天然MxA蛋白的反應(yīng)性與重組MxA蛋白的反應(yīng)性進(jìn)行比較，檢測(cè)了抗體針對(duì)重組MxA蛋白的反應(yīng)性與抗體針對(duì)天然MxA蛋白的反應(yīng)性的差異。
[0161]使用[6]的樣本稀釋液將上述[3]中產(chǎn)生的天然MxA蛋白稀釋20倍，將其靜置30分鐘以溶解細(xì)胞，然后用樣本稀釋液將其進(jìn)一步稀釋8倍，得到測(cè)量用樣品。[0162]使用該樣品和實(shí)施例的[6]中制備的各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣本，遵照[7]中描述的操作執(zhí)行測(cè)量。具體來(lái)說(shuō)，一次反應(yīng)在25°C和37°C兩種溫度下執(zhí)行，二次反應(yīng)和產(chǎn)色反應(yīng)在25°C執(zhí)行。在這里，通過(guò)下列方程(I)來(lái)計(jì)算天然MxA蛋白在25°C反應(yīng)時(shí)和在37°C反應(yīng)時(shí)的測(cè)量變動(dòng)率。結(jié)果顯示在表1中。[0163][方程I]
[0164]變動(dòng)率(％ )=[(在37°C下反應(yīng)時(shí)的天然MxA蛋白濃度)/(在25°C下反應(yīng)時(shí)的天然MxA蛋白濃度)-1]*100 (I)
[0165][比較例I]
[0166]使用與實(shí)施例1中[6]的樣本稀釋液具有相同組成的樣本稀釋液，區(qū)別在于在組成中使用1.2% Nonidet P40 (聚氧乙烯烷基苯基醚)作為表面活性劑，通過(guò)與實(shí)施例1中相似的方法來(lái)計(jì)算由反應(yīng)溫度引起的測(cè)量變動(dòng)率。結(jié)果顯示在表1中。
[0167]表1
【權(quán)利要求】
1.一種用于測(cè)量待測(cè)成分的方法，其中所述方法包含將樣本中的待測(cè)成分與結(jié)合所述待測(cè)成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)；然后在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)，以形成包含第一抗體、待測(cè)成分和標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上；以及測(cè)量形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中聚氧乙烯非離子型表面活性劑是選自聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚和乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物的聚氧乙烯非離子型表面活性劑。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中添加膽汁酸衍生物，并且將樣本中的待測(cè)成分與結(jié)合所述待測(cè)成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中膽汁酸衍生物是具有兩性離子表面活性劑作用的膽汁酸衍生物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中具有兩性離子表面活性劑作用的膽汁酸衍生物是3-[(3_膽酰胺丙基)二甲銨基]丙磺酸鹽或3-[(3-膽酰胺丙基)二甲銨基]-2-羥基丙磺酸鹽。
6.權(quán)利要求3的方法，其中膽汁酸衍生物是具有非離子型表面活性劑作用的膽汁酸衍生物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中具有非離子型表面活性劑作用的膽汁酸衍生物是N，N-雙(3-葡萄糖酰胺丙基)膽酰胺或N，N-雙(3-D-葡萄糖酰胺丙基)脫氧膽酰胺。
8.權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的測(cè)量方法，其中將第一抗體固定化在不溶性載體上。
9.權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的方法，其中樣本是全血。
10.權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)成分是MxA蛋白。
11.一種用于測(cè)量樣本中的待測(cè)成分的試劑盒，其中所述試劑盒包含:第一試劑，其包含與待測(cè)成分相結(jié)合的第一抗體；以及第二試劑，其包含標(biāo)記的第二抗體和聚氧乙烯非離子型表面活性劑，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測(cè)成分相結(jié)合的第二抗體上。
12.權(quán)利要求11的試劑盒，其中聚氧乙烯非離子型表面活性劑是選自聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚和乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物的聚氧乙烯非離子型表面活性劑。
13.權(quán)利要求11或12的試劑盒，其中第一試劑還包含膽汁酸衍生物。
14.權(quán)利要求13的試劑盒，其中膽汁酸衍生物是具有兩性離子表面活性劑作用的膽汁酸衍生物。
15.權(quán)利要求14的試劑盒，其中具有兩性離子表面活性劑作用的膽汁酸衍生物是3-[(3-膽酰胺丙基)二甲銨基]丙磺酸鹽或3-[(3-膽酰胺丙基)二甲銨基]-2-羥基丙磺酸鹽。
16.權(quán)利要求13的試劑盒，其中膽汁酸衍生物是具有非離子型表面活性劑作用的膽汁酸衍生物。
17.權(quán)利要求16的試劑盒，其中具有非離子型表面活性劑作用的膽汁酸衍生物是N，N-雙(3-葡萄糖酰胺丙基)膽酰胺或N，N-雙(3-D-葡萄糖酰胺丙基)脫氧膽酰胺。
18.權(quán)利要求11至17任一項(xiàng)的試劑盒，其中第一抗體被固定化在不溶性載體上。
19.權(quán)利要求11至18任一項(xiàng)的試劑盒，其中樣本是全血。
20.權(quán)利要求11 至19任一項(xiàng)的試劑盒，其中待測(cè)成分是MxA蛋白。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104034882SQ201410235359
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2009年10月30日
【發(fā)明者】川村瑞穗 申請(qǐng)人:協(xié)和梅迪克斯株式會(huì)社