基于酞菁鈷標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)有機(jī)小分子的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及電化學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，特別涉及一種基于酞菁鈷標(biāo)記檢測(cè)有機(jī)小分子的電化學(xué)方法。該基于酞菁鈷標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)有機(jī)小分子的方法，包括以下步驟：a)、以一種具有類(lèi)過(guò)氧化氫酶催化活性的酞菁鈷標(biāo)記待測(cè)物的類(lèi)似物作為標(biāo)記待測(cè)物分子；b)、通過(guò)聚合反應(yīng)，將分子印跡聚合物包覆在磁性納米粒子表面，并將其分散在反應(yīng)液中；形成競(jìng)爭(zhēng)性特異結(jié)合反應(yīng)以及電化學(xué)檢測(cè)步驟等。本發(fā)明特別適合于抗體難于制備的小分子檢測(cè)，且由于采用的材料均為人工化學(xué)合成的仿生材料，大大降低了成本，擴(kuò)大了檢測(cè)反應(yīng)的適宜范圍，較傳統(tǒng)免疫分析方法具有很大的優(yōu)勢(shì)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】基于酞菁鈷標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)有機(jī)小分子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及電化學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，特別涉及一種基于酞菁鈷標(biāo)記檢測(cè)有機(jī)小分子的電化學(xué)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在目前的生物醫(yī)藥檢測(cè)領(lǐng)域，對(duì)于環(huán)境污染物、農(nóng)藥、激素、抗生素等小分子的高靈敏度定量免疫檢測(cè)已成為廣大研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題之一。為了實(shí)現(xiàn)微量或痕量的小分子化合物的高靈敏度檢測(cè)，各種基于生物特異性反應(yīng)，如抗原抗體技術(shù)、蛋白配體技術(shù)等不同的方法和體系已經(jīng)被建立。其中，具有典型性的是競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢測(cè)技術(shù)，其利用標(biāo)記抗原和待測(cè)分析物對(duì)抗體的競(jìng)爭(zhēng)，通過(guò)檢測(cè)被抗體吸附的標(biāo)記抗原可以推斷出體系中含有的待測(cè)分析物的濃度。但此種免疫檢測(cè)方法的核心材料抗體通常制備周期長(zhǎng)，且難以獲得。
[0003]分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers, MIPs)是人工設(shè)計(jì)的一類(lèi)功能高分子材料，它可以實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)藥分子的選擇性識(shí)別及富集。分子印跡聚合物是以“鎖-鑰匙”假說(shuō)為理論基礎(chǔ)，通過(guò)模板分子、功能單體和交聯(lián)劑在發(fā)生聚合反應(yīng)時(shí)形成特定的三維空間結(jié)構(gòu)。在聚合物內(nèi)部就形成了特定形狀的空穴，由于這些空穴中含有能夠與模板分子形成特異性作用的基團(tuán)或結(jié)合位點(diǎn)，以及在三維空間結(jié)構(gòu)上空穴與模板分子的匹配性，生成的分子印跡聚合物就對(duì)模板分子具有特異型識(shí)別的能力和良好的親和性。這種分子印跡聚合物不僅有類(lèi)似酶和抗體的特異性識(shí)別能力，還具有酶和抗體不具備的相當(dāng)程度上的化學(xué)、物理穩(wěn)定性，能夠耐受酸、堿、高溫、有機(jī)溶劑等環(huán)境因素的影響，且具有制備簡(jiǎn)單，可重復(fù)使用、使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)(譚天偉，2010)。在本發(fā)明中采用分子印跡聚合物作為抗體的仿生替代物，用于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)。
[0004]在競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)中，經(jīng)常采用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)等酶標(biāo)記催化過(guò)氧化氫分解，氧化還原性底物顯色或產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。但由于酶是生物大分子，對(duì)溫度、溶劑等外部條件要求嚴(yán)格，限制了其應(yīng)用范圍。
[0005]因此，提供一種基于酞菁鈷標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磁性分子印跡聚合物檢測(cè)有機(jī)小分子化合物的電化學(xué)檢測(cè)體系，以克服相關(guān)技術(shù)中所需酶由于對(duì)外部條件的要求較高而導(dǎo)致的缺陷，并為環(huán)境污染物、農(nóng)藥、激素、抗生素等小分子的高靈敏度快速定量檢測(cè)提供一種新的檢測(cè)模式是本領(lǐng)域亟待解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明提供了一種基于酞菁鈷標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)有機(jī)小分子的方法，以克服現(xiàn)有上述技術(shù)問(wèn)題。
[0007]本發(fā)明實(shí)施例提供的這種基于酞菁鈷標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)有機(jī)小分子的方法，包括以下步驟:
[0008]a)、以一種具有類(lèi)過(guò)氧化氫酶催化活性的酞菁鈷標(biāo)記待測(cè)物的類(lèi)似物作為標(biāo)記待測(cè)物分子；[0009]b)、通過(guò)聚合反應(yīng)，將分子印跡聚合物包覆在磁性納米粒子表面，并將其分散在反應(yīng)液中；
[0010]C)、在反應(yīng)液中加入步驟a)中制得的標(biāo)記待測(cè)物和待測(cè)目標(biāo)物后，標(biāo)記待測(cè)物與待測(cè)目標(biāo)物競(jìng)爭(zhēng)磁性分子印跡聚合物表面結(jié)合位點(diǎn)，形成競(jìng)爭(zhēng)性特異結(jié)合反應(yīng)；
[0011]d)、通過(guò)磁鐵分離，將磁性印跡聚合物及其吸附的目標(biāo)物分離至試管底部，吸取上清，在其中加入含有對(duì)苯二酚和過(guò)氧化氫的溶液，通過(guò)差分脈沖伏安法，電化學(xué)檢測(cè)體系中的氧化電流信號(hào)進(jìn)而對(duì)待測(cè)物實(shí)現(xiàn)定量測(cè)量。
[0012]該檢測(cè)方法采用酞菁鈷代替了生物酶分子標(biāo)記小分子抗原，并結(jié)合磁性分子印跡聚合物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性特異性結(jié)合反應(yīng)，通過(guò)電化學(xué)檢測(cè)標(biāo)記抗原對(duì)于過(guò)氧化氫和對(duì)苯二酚的催化氧化反應(yīng)產(chǎn)生的電信號(hào)，由于其電信號(hào)大小與待測(cè)小分子濃度呈線性相關(guān)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)小分子化合物的高靈敏度定量檢測(cè)。
[0013]本發(fā)明利用磁性分子印跡聚合物特異性結(jié)合并快速分離富集小分子化合物，并借助酞菁鈷的仿生催化活性實(shí)現(xiàn)小分子化合物的快速高靈敏檢測(cè)。本發(fā)明特別適合于抗體難于制備的小分子檢測(cè)，且由于采用的材料均為人工化學(xué)合成的仿生材料，大大降低了成本，擴(kuò)大了檢測(cè)反應(yīng)的適宜范圍，較傳統(tǒng)免疫分析方法具有很大的優(yōu)勢(shì)。
[0014]可選的，在步驟b)中；所述將分子印跡聚合物為:二氧化硅；所述磁性納米粒子為:磁性四氧化三鐵微粒。
[0015]可選的，在步驟c)中；在反應(yīng)液中加入步驟a)中制得的標(biāo)記待測(cè)物和待測(cè)目標(biāo)物后，振蕩吸附30分鐘。
[0016]可選的，在步驟c)中；反應(yīng)液與標(biāo)記待測(cè)物的體積比為50:1。
[0017]可選的，在步驟d)中；在所述的電化學(xué)檢測(cè)中，以玻碳電極為工作電極、鉬片電極為對(duì)電極、Ag/AgCl電極為參比電極。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為本實(shí)施例一的酞菁催化電化學(xué)檢測(cè)三嗪差分脈沖伏安圖；
[0019]圖2為本發(fā)明實(shí)施例一中的檢測(cè)方法中，待測(cè)物濃度數(shù)據(jù)(ppm)對(duì)電流mV的線性關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]本發(fā)明提供了一種基于酞菁鈷標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)有機(jī)小分子的方法；該檢測(cè)方法采用酞菁鈷代替了生物酶分子標(biāo)記小分子抗原，并結(jié)合磁性分子印跡聚合物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性特異性結(jié)合反應(yīng)，通過(guò)電化學(xué)檢測(cè)標(biāo)記抗原對(duì)于過(guò)氧化氫和對(duì)苯二酚的催化氧化反應(yīng)產(chǎn)生的電信號(hào)，由于其電信號(hào)大小與待測(cè)小分子濃度呈線性相關(guān)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)小分子化合物的高靈敏度定量檢測(cè)。
[0021]另外，需要指出的是，在本發(fā)明的所有實(shí)施例中，優(yōu)選的，可以具備以下一個(gè)或者多個(gè)限定條件(結(jié)合權(quán)利要求1的給出的技術(shù)方案):可選的，在步驟b)中；所述將分子印跡聚合物為:二氧化硅；所述磁性納米粒子為:磁性四氧化三鐵微粒。在步驟C)中；在反應(yīng)液中加入步驟a)中制得的標(biāo)記待測(cè)物和待測(cè)目標(biāo)物后，振蕩吸附30分鐘。在步驟c)中；反應(yīng)液與標(biāo)記待測(cè)物的體積比為50:1。在步驟d)中；在所述的電化學(xué)檢測(cè)中，以玻碳電極為工作電極、鉬片電極為對(duì)電極、Ag/AgCl電極為參比電極。
[0022]實(shí)施例一
[0023]本實(shí)施例提供的檢測(cè)方法包括以下步驟:
[0024]1、酞菁鈷標(biāo)記小分子化合物的制備方法
[0025]將帶有氨基或羧基等活性基團(tuán)的小分子化合物通過(guò)酰胺化反應(yīng)(EDC/NHS反應(yīng))、重氮化法、戊二醛法等方法與氨基化酞菁鈷偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)酞菁鈷對(duì)小分子抗原的標(biāo)記。
[0026]例如，以一種具有類(lèi)過(guò)氧化氫酶催化活性的氨基化酞菁鈷標(biāo)記羧基化的三嗪類(lèi)似物作為標(biāo)記待測(cè)物分子:具體的，稱(chēng)取20mg修飾有羧基的待測(cè)物分子結(jié)構(gòu)類(lèi)似物溶于ImL含有200 μ L甲醇的ddH20，在其中分別加入IOOyL含IOmg EDC和NHS構(gòu)成的偶聯(lián)液，在37°C中活化30min，緩慢滴入含5mg氨基化酞菁鈷的二甲基亞砜(DMSO)溶液，通過(guò)酰胺化反應(yīng)(EDC/NHS反應(yīng))偶聯(lián)2h。之后，與1%的脫脂乳粉在37°C下孵育lh，封閉掉未反應(yīng)的羧基，洗滌一次，裝入透析袋，用蒸餾水透析3d，每天更換2到3次透析液至透析完全，即獲得偶聯(lián)酞菁鈷的待測(cè)物分子。
[0027]2、磁性分子印跡聚合物的制備方案
[0028]將8.1g FeCl3.6H20在142.5mL去離子水中溶解后，轉(zhuǎn)移到三口燒瓶中，攪拌加熱至70°C。稱(chēng)取4.4gFeCl2*4H20溶于IOmL去離子水，過(guò)濾，取7.5mL加入到三口燒瓶中。在劇烈攪拌下，快速加入24mL20%的NaOH溶液，于70°C下繼續(xù)快速攪拌20min。反應(yīng)結(jié)束后，得到黑色溶膠狀物質(zhì)，利用外加磁場(chǎng)將所得的沉淀從反應(yīng)體系中分離出來(lái)，得到Fe3O4磁性納米粒子。
[0029]將5mL經(jīng)超聲分散后的Fe3O4懸濁液于三頸燒瓶中40°C水浴攪拌，在攪拌過(guò)程中，加入幾滴油酸，然后依次加入50.0OmL無(wú)水乙醇、1.0OmL氨水、1.0OmL TE0S，反應(yīng)3h。得到二氧化硅包覆的四氧化三鐵(Fe3O4OSiO2)tj
[0030]在250mL圓底燒瓶中加入Immol模板分子，4mmol (0.34mL)功能單體(MAA), 30mL溶劑及致孔劑(氯仿)，超聲30min，置于4°C冰箱中避光，進(jìn)行預(yù)組裝過(guò)夜。
[0031]第二天再向體系中加入2mL交聯(lián)劑(Trim),以及0.2gFe304iSi02納米粒子(作為磁性核心)，充分混勻后，通氮?dú)獬?5min,加入30mg引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)后將燒瓶密封，置于水浴振蕩搖床60°C下200rpm振蕩12h，實(shí)現(xiàn)聚合過(guò)程。
[0032]聚合反應(yīng)完成后，體系中生成深色的沉淀，用外加磁場(chǎng)對(duì)其進(jìn)行磁吸附分離。將分離出的沉淀冷卻至室溫，采用洗脫液(甲醇:冰醋酸v/v = 9:1)對(duì)其進(jìn)行反復(fù)洗滌，以除去模板分子，至高效液相色譜/質(zhì)譜檢測(cè)不到上清液中有模板分子殘留后，磁性分離或離心分離，將分離出的沉淀置于真空干燥箱，烘干備用。
[0033]上述步驟具體為通過(guò)聚合反應(yīng)即可將分子印跡聚合物包覆在磁性納米粒子表面(形成磁性分子印跡聚合物)，并將其分散在反應(yīng)液中具體操作過(guò)程。
[0034]3、電化學(xué)檢測(cè)方法，可通過(guò)酞菁鈷仿生標(biāo)記結(jié)合磁性微粒競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)電化學(xué)檢測(cè)小分子化合物，包括以下步驟:
[0035]在反應(yīng)液中加入步驟I中制得的標(biāo)記待測(cè)物和待測(cè)目標(biāo)物后，標(biāo)記待測(cè)物與待測(cè)目標(biāo)物競(jìng)爭(zhēng)磁性分子印跡聚合物表面結(jié)合位點(diǎn)，形成競(jìng)爭(zhēng)性特異結(jié)合反應(yīng):具體的，將100 μ L含有25mg磁性分子印跡聚合物分散在5mL反應(yīng)液中，在反應(yīng)液中加入100 μ L步驟I中制得的標(biāo)記待測(cè)物和一組不同濃度待測(cè)物后，振蕩吸附30min，標(biāo)記待測(cè)物與待測(cè)目標(biāo)物競(jìng)爭(zhēng)磁性分子印跡聚合物表面結(jié)合位點(diǎn)，形成競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)。
[0036]通過(guò)磁鐵分離，將磁性印跡聚合物及其吸附的目標(biāo)物分離至試管底部，吸取2mL上清，加入2mL含有77mg對(duì)苯二酚和11 μ L30%過(guò)氧化氫的溶液中，以玻碳電極為工作電極，鉬片電極為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極，在-0.6?2.0V間，通過(guò)差分脈沖伏安法(DPV法)電化學(xué)檢測(cè)體系中的氧化電流信號(hào)進(jìn)而對(duì)待測(cè)物實(shí)現(xiàn)定量測(cè)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在20ng.mL-1?10 μ g.mL-1之間，電流信號(hào)大小與待測(cè)目標(biāo)物濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。
[0037]綜上，本發(fā)明實(shí)施例提出了一種利用酞菁鈷催化活性作為標(biāo)記，以及磁性分子印跡聚合物的特異性結(jié)合能力的競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合反應(yīng)電化學(xué)檢測(cè)方法。本方法首先將氨基酞菁鈷與羧基化的待測(cè)小分子化合物類(lèi)似物偶聯(lián)，構(gòu)成標(biāo)記待測(cè)物。通過(guò)聚合反應(yīng)，將分子印跡聚合物包覆在磁性納米粒子表面，借助標(biāo)記待測(cè)物與待測(cè)目標(biāo)物對(duì)磁性分子印跡聚合物的競(jìng)爭(zhēng)以及外加磁場(chǎng)對(duì)于磁性分子印跡聚合物結(jié)合目標(biāo)物和標(biāo)記待測(cè)物后的分離，構(gòu)建了競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合反應(yīng)體系。然后通過(guò)電化學(xué)檢測(cè)上清液中剩余的標(biāo)記待測(cè)物對(duì)過(guò)氧化氫的催化分解及其對(duì)對(duì)苯二酚的氧化電流，建立了小分子化合物高靈敏度的檢測(cè)體系。
[0038]另外，本發(fā)明實(shí)施例的方法在實(shí)施過(guò)程中使用的試劑包括以下幾種成分:
[0039]分子印跡聚合物:一般是指可特異識(shí)別環(huán)境污染物、農(nóng)藥、激素、抗生素等小分子的分子印跡聚合物。磁性納米粒子，氨基化酞菁鈷，玻碳電極，鉬片電極，飽和甘汞電極，待測(cè)物分子及其含羧基或氨基的類(lèi)似物，過(guò)氧化氫，對(duì)苯二酚，亞硝酸鈉，EDC, NHS，六水合氯化鐵，四水合氯化亞鐵、甲醇、乙腈等。使用的裝置包括:水浴鍋、電化學(xué)工作站、超純水制水機(jī)。以玻碳電極為工作電極，鉬片電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極，采用差分脈沖伏安法，電化學(xué)檢測(cè)體系中的氧化電流信號(hào)進(jìn)而對(duì)待測(cè)物實(shí)現(xiàn)定量測(cè)量。
[0040]另外，以酞菁鈷為標(biāo)記催化材料、以四氧化三鐵納米粒子為磁性微粒、以三嗪類(lèi)分子印跡聚合物為特異性吸附材料、阿特拉津?yàn)榇郎y(cè)分析物、羧基化三嗪分子為待測(cè)分析物的類(lèi)似物為例，說(shuō)明本方法的具體實(shí)施流程。
[0041]步驟1:以一種具有類(lèi)過(guò)氧化氫酶催化活性的酞菁鈷標(biāo)記待測(cè)物的類(lèi)似物作為標(biāo)記待測(cè)物分子:稱(chēng)取20mg修飾有羧基的待測(cè)物分子結(jié)構(gòu)類(lèi)似物溶于ImL含有200 μ L甲醇的dd H2O,在其中分別加入100 μ L含IOmg EDC和NHS構(gòu)成的偶聯(lián)液，在37°C中活化30min，緩慢滴入含5mg氨基化酞菁鈷的二甲基亞砜(DMSO)溶液，通過(guò)酰胺化反應(yīng)(EDC/NHS反應(yīng))偶聯(lián)2h。之后，與I %的脫脂乳粉在37°C下孵育lh，封閉掉未反應(yīng)的羧基，洗滌一次，裝入透析袋，用蒸餾水透析3d，每天更換2到3次透析液至透析完全，即獲得偶聯(lián)酞菁鈷的待測(cè)物分子。
[0042]步驟2:將8.1gFeCl3.6Η20在142.5mL去離子水中溶解后，轉(zhuǎn)移到三口燒瓶中，攪拌加熱至70°C。稱(chēng)取4.4gFeCl2.4H20溶于IOmL去離子水，過(guò)濾，取7.5mL加入到三口燒瓶中。在劇烈攪拌下，快速加入24mL20%的NaOH溶液，于70°C下繼續(xù)快速攪拌20min。反應(yīng)結(jié)束后，得到黑色溶膠狀物質(zhì)，利用外加磁場(chǎng)將所得的沉淀從反應(yīng)體系中分離出來(lái)，得到Fe3O4磁性納米粒子。
[0043]將5mL經(jīng)超聲分散后的Fe3O4懸濁液于三頸燒瓶中40°C水浴攪拌，在攪拌過(guò)程中，加入幾滴油酸，然后依次加入50.0OmL無(wú)水乙醇、1.0OmL氨水、1.0OmL TE0S，反應(yīng)3h。得到二氧化硅包覆的四氧化三鐵(Fe3O4OSiO2)tj
[0044]在250mL圓底燒瓶中加入Immol模板分子，4mmol (0.34mL)功能單體(MAA), 30mL溶劑及致孔劑(氯仿)，超聲30min，置于4°C冰箱中避光，進(jìn)行預(yù)組裝過(guò)夜。
[0045]第二天再向體系中加入2mL交聯(lián)劑(Trim)，以及0.2gFe304iSi02納米粒子(作為磁性核心)，充分混勻后，通氮?dú)獬?5min,加入30mg引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)后將燒瓶密封，置于水浴振蕩搖床60°C下200rpm振蕩12h，實(shí)現(xiàn)聚合過(guò)程。
[0046]聚合反應(yīng)完成后，體系中生成深色的沉淀，用外加磁場(chǎng)對(duì)其進(jìn)行磁吸附分離。將分離出的沉淀冷卻至室溫，采用洗脫液(甲醇:冰醋酸v/v = 9:1)對(duì)其進(jìn)行反復(fù)洗滌，以除去模板分子，至高效液相色譜/質(zhì)譜檢測(cè)不到上清液中有模板分子殘留后，磁性分離或離心分離，將分離出的沉淀置于真空干燥箱，烘干備用。
[0047]步驟3:在上述反應(yīng)液中加入步驟I中制得的標(biāo)記待測(cè)物和待測(cè)目標(biāo)物后，標(biāo)記待測(cè)物與待測(cè)目標(biāo)物競(jìng)爭(zhēng)磁性分子印跡聚合物表面結(jié)合位點(diǎn)，形成競(jìng)爭(zhēng)性特異結(jié)合反應(yīng):
[0048]將100 μ L含有25mg磁性分子印跡聚合物分散在5mL反應(yīng)液中，在反應(yīng)液中加入100 μ L步驟一中制得的標(biāo)記待測(cè)物和一組不同濃度待測(cè)物后，振蕩吸附30min，標(biāo)記待測(cè)物與待測(cè)目標(biāo)物競(jìng)爭(zhēng)磁性分子印跡聚合物表面結(jié)合位點(diǎn)，形成競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)。
[0049]步驟4，通過(guò)磁鐵分離，將磁性印跡聚合物及其吸附的目標(biāo)物分離至試管底部，吸取2mL上清，加入2mL含有77mg對(duì)苯二酚和11 μ L30 %過(guò)氧化氫的溶液中，以玻碳電極為工作電極，鉬片電極為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極，在-0.6?2.0V間，通過(guò)差分脈沖伏安法(DPV法)電化學(xué)檢測(cè)體系中的氧化電流信號(hào)進(jìn)而對(duì)待測(cè)物實(shí)現(xiàn)定量測(cè)量(請(qǐng)參考圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在10 μ g.mL-1?100 μ g.mL-1之間，電流信號(hào)大小與待測(cè)目標(biāo)物濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(請(qǐng)參考圖2，橫坐標(biāo)為濃度數(shù)據(jù)，縱坐標(biāo)為電流)。
[0050]綜上，本發(fā)明利用磁性分子印跡聚合物特異性結(jié)合并快速分離富集小分子化合物，并借助酞菁鈷的仿生催化活性實(shí)現(xiàn)小分子化合物的快速高靈敏檢測(cè)。本發(fā)明特別適合于抗體難于制備的小分子檢測(cè)，且由于采用的材料均為人工化學(xué)合成的仿生材料，大大降低了成本，擴(kuò)大了檢測(cè)反應(yīng)的適宜范圍，較傳統(tǒng)免疫分析方法具有很大的優(yōu)勢(shì)。
[0051]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.基于酞菁鈷標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)有機(jī)小分子的方法，其特征在于，包括以下步驟: a)、以一種具有類(lèi)過(guò)氧化氫酶催化活性的酞菁鈷標(biāo)記待測(cè)物的類(lèi)似物作為標(biāo)記待測(cè)物分子; b)、通過(guò)聚合反應(yīng)，將分子印跡聚合物包覆在磁性納米粒子表面，并將其分散在反應(yīng)液中； c)、在反應(yīng)液中加入步驟a)中制得的標(biāo)記待測(cè)物和待測(cè)目標(biāo)物后，標(biāo)記待測(cè)物與待測(cè)目標(biāo)物競(jìng)爭(zhēng)磁性分子印跡聚合物表面結(jié)合位點(diǎn)，形成競(jìng)爭(zhēng)性特異結(jié)合反應(yīng)； d)、通過(guò)磁鐵分離，將磁性印跡聚合物及其吸附的目標(biāo)物分離至試管底部，吸取上清，在其中加入含有對(duì)苯二酚和過(guò)氧化氫的溶液，通過(guò)差分脈沖伏安法，電化學(xué)檢測(cè)體系中的氧化電流信號(hào)進(jìn)而對(duì)待測(cè)物實(shí)現(xiàn)定量測(cè)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于酞菁鈷標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)有機(jī)小分子的方法，其特征在于:在步驟b)中； 所述將分子印跡聚合物為:二氧化硅； 所述磁性納米粒子為:磁性四氧化三鐵微粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于酞菁鈷標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)有機(jī)小分子的方法，其特征在于:在步驟c)中； 在反應(yīng)液中加入步驟a)中制得的標(biāo)記待測(cè)物和待測(cè)目標(biāo)物后，振湯吸附30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于酞菁鈷標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)有機(jī)小分子的方法，其特征在于:在步驟c)中； 反應(yīng)液與標(biāo)記待測(cè)物的體積比為50:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于酞菁鈷標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)有機(jī)小分子的方法，其特征在于:在步驟d)中； 在所述的電化學(xué)檢測(cè)中，以玻碳電極為工作電極、鉬片電極為對(duì)電極、Ag/AgCl電極為參比電極。
【文檔編號(hào)】G01N27/48GK103995040SQ201410257998
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】王靜, 王淼, 佘永新, 李騰飛, 劉廣洋, 杜欣蔚, 于海龍, 金芬, 邵華, 金茂俊, 王珊珊 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所