一種還原/酶/pH多重響應(yīng)性釋藥的核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料及藥物控制釋放領(lǐng)域，具體涉及一種還原/酶/pH多重響應(yīng)性釋藥的核殼結(jié)構(gòu)納米粒子。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)2006年國(guó)家衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，癌癥已超越心血管疾病排在疾病死因的第一位。我國(guó)每年死于腫瘤的人數(shù)超過(guò)160萬(wàn)，治療費(fèi)用高達(dá)1500億元，并且每年的腫瘤死亡率呈上升趨勢(shì)，其中乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第一位，癌癥治療由此成為當(dāng)前國(guó)際上最受關(guān)注的研究領(lǐng)域。藥物治療是目前主要的治療癌癥手段，但存在的最大問(wèn)題是抗癌藥物不能在腫瘤組織局部停留而分布在身體各個(gè)組織器官，從而導(dǎo)致抗癌藥物在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)嚴(yán)重?fù)p傷其他正常組織。最新研究發(fā)現(xiàn)采用納米粒子負(fù)載抗癌藥物靶向治療惡性腫瘤可以提高給藥效率，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，顯示出良好的應(yīng)用前景，但以下幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題仍未較好解決:1.在血液中穩(wěn)定性差(易解體)；2.主動(dòng)靶向性差;3.響應(yīng)性不足;4.載藥量不高，致使到達(dá)癌細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度較低，抗癌效果不夠理想。因此如何設(shè)計(jì)高載藥能力的納米粒子載體，提高納米粒子在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性并主動(dòng)革G向癌細(xì)胞，借助納米粒子在癌細(xì)胞內(nèi)的各種響應(yīng)性來(lái)控制藥物向細(xì)胞質(zhì)釋放，是癌癥治療的關(guān)鍵。
[0003]載藥納米粒子從靜脈注射到在癌細(xì)胞內(nèi)釋放藥物的過(guò)程非常復(fù)雜，需要經(jīng)過(guò)血液循環(huán)靠近癌細(xì)胞、被癌細(xì)胞吞噬內(nèi)化、從內(nèi)涵體/溶酶體中逃逸向細(xì)胞質(zhì)釋放藥物等幾個(gè)階段，期間納米粒子會(huì)與體內(nèi)環(huán)境發(fā)生復(fù)雜的相互作用，導(dǎo)致最終釋放到癌細(xì)胞質(zhì)中的藥物濃度較低。
[0004]納米粒子的血液穩(wěn)定性受納米粒子的親疏水性和荷電性影響。帶正電荷的納米粒子容易被血管中的巨噬細(xì)胞攝取，而帶負(fù)電荷和電中性的的納米粒子有利于延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間；疏水性的納米粒子容易表面吸附各種血漿蛋白而被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，而親水性的納米粒子有利于延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間。因此，為了提高載藥納米粒子在血液中的穩(wěn)定性，基材應(yīng)優(yōu)先考慮選用負(fù)電性或電中性的親水性聚合物，還要考慮納米粒子自身的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性設(shè)計(jì)，以避免在血液循環(huán)中發(fā)生解體。
[0005]納米粒子對(duì)癌細(xì)胞的革El向包括被動(dòng)革El向和主動(dòng)革El向。被動(dòng)革El向是依賴滲透與滯留增強(qiáng)(EPR)效應(yīng)來(lái)革El向癌細(xì)胞，控制納米粒子的大小是關(guān)鍵，而主動(dòng)革El向則是由納米粒子表面的功能配體與癌細(xì)胞表面的某些受體特異性結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)靶向，比被動(dòng)靶向的效率要高。因此，人們嘗試在納米粒子表面引入可與各種腫瘤標(biāo)記物(如EGFR、HER2、MUCl、aj3integrins等)特異性結(jié)合的蛋白或抗體來(lái)進(jìn)行主動(dòng)革El向，但在納米粒子的化學(xué)合成與純化過(guò)程中，這些具有靶向功能的蛋白和抗體很容易因構(gòu)象改變而變性失活。其實(shí)，有些聚合物本身就能與癌細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合而顯示主動(dòng)靶向性，如透明質(zhì)酸(HA)可靶向乳腺癌細(xì)胞的CD-44、RHAMM受體，果膠可靶向肝癌細(xì)胞的ASGPR受體。因此，納米粒子的基材可以考慮選擇這些特殊的聚合物來(lái)實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的主動(dòng)靶向。
[0006]當(dāng)載藥納米粒子被癌細(xì)胞吞噬后，如何控制藥物向細(xì)胞質(zhì)快速釋放是關(guān)鍵。最近研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)納米粒子對(duì)環(huán)境刺激的響應(yīng)性可以控制藥物釋放，包括外部刺激和內(nèi)部刺激。外部刺激研究較多的是溫敏性聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)及其共聚物體系，通過(guò)復(fù)合磁敏性納米粒子Fe3O4或光敏性納米粒子CuO、Au等，在外磁場(chǎng)或光照作用下使體系的溫度改變來(lái)控制藥物釋放。如果再往體系中引入PH敏感性的聚甲基丙烯酸(PMAA)，則可制得雙重或多重響應(yīng)性的載藥納米粒子，如pH/溫度、pH/磁場(chǎng)、溫度/pH/磁場(chǎng)響應(yīng)等。但這些體系的最大缺點(diǎn)是所用基材在體內(nèi)不可降解，從而限制了它們?cè)谂R床上的應(yīng)用范圍。內(nèi)部刺激響應(yīng)主要依靠載藥納米粒子對(duì)癌細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的響應(yīng)性來(lái)控制藥物釋放。腫瘤組織有著跟正常組織很不一樣的環(huán)境特征，如內(nèi)涵體/溶酶體呈酸性(pH?5.0)且含有豐富的谷胱甘肽(GSH)，可以用來(lái)設(shè)計(jì)pH響應(yīng)性和二硫鍵還原響應(yīng)性的載藥納米粒子，如最近報(bào)道用于肺癌A549細(xì)胞研究的PEG-PAsp(MEA)-PEI載藥納米粒子和用于子宮癌Hela細(xì)胞研究的PEG-oDS/LDS載藥納米粒子，但在如何協(xié)助藥物從內(nèi)涵體/溶酶體中逃逸向細(xì)胞質(zhì)快速釋放問(wèn)題上仍然存在很大的挑戰(zhàn)性，雖然目前利用PEI(聚乙烯亞胺)的質(zhì)子海綿效應(yīng)能幫助藥物從內(nèi)涵體/溶酶體中逃逸，但由于PEI不可降解、對(duì)細(xì)胞毒性大而備受爭(zhēng)議。組氨酸(His)是一種對(duì)pH有敏感性的氨基酸，在內(nèi)涵體/溶酶體的酸性環(huán)境中His的咪唑基團(tuán)(pKa?6.0)會(huì)被質(zhì)子化，導(dǎo)致氫離子、氯離子和水分子大量進(jìn)入內(nèi)涵體/溶酶體，使內(nèi)涵體/溶酶體發(fā)生滲透性腫脹破裂，因此可用來(lái)設(shè)計(jì)藥物從內(nèi)涵體/溶酶體逃逸向細(xì)胞質(zhì)釋放。
[0007]在納米粒子的運(yùn)送過(guò)程中，由于各種原因?qū)е伦罱K釋放到細(xì)胞質(zhì)的藥物濃度較低而影響治療效果，因此提高納米粒子的載藥量同樣重要。聚合物納米粒子的載藥方法包括化學(xué)法和物理法?；瘜W(xué)法是將小分子藥物鍵合到聚合物鏈中變成大分子藥物，然后通過(guò)控制化學(xué)鍵的斷裂來(lái)釋放藥物，而物理法則是在制備聚合物納米粒子過(guò)程中將藥物包裹其中，然后通過(guò)納米粒子的降解或者體積收縮等來(lái)控制藥物釋放。目前的納米粒子常用單一的化學(xué)法或者物理法載藥，其載藥量往往不高(最大載藥量?10%)，如果在載藥納米粒子設(shè)計(jì)時(shí)能同時(shí)結(jié)合化學(xué)法和物理法，首先將疏水藥物鍵合到親水基材上構(gòu)建雙親分子(化學(xué)載藥)，然后將雙親分子與藥物混和，在雙親分子自組裝形成納米膠束過(guò)程中，根據(jù)相似相容的原理，利用鍵合藥物與游離藥物的分子間作用包裹藥物(物理載藥)，則可以有效提高納米粒子的最大載藥量。
[0008]對(duì)于乳腺癌治療，在載藥納米粒子設(shè)計(jì)時(shí)還應(yīng)該考慮乳腺癌細(xì)胞的自身特點(diǎn)。乳腺癌細(xì)胞表面含有過(guò)表達(dá)的CD-44受體，與HA特異性結(jié)合并介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)納米粒子的吞噬，可作為HA的靶向位點(diǎn)，且HA來(lái)源豐富、經(jīng)濟(jì)易得，因而可選用HA作為乳腺癌靶向納米粒子的基材。同時(shí)，乳腺癌細(xì)胞除了內(nèi)涵體/溶酶體呈酸性和含有豐富的GSH這些特征外，還含有高濃度的透明質(zhì)酸酶Hyal-1，可以將HA降解成可被人體吸收的小分子碎片，因而可用來(lái)設(shè)計(jì)HA基載藥納米粒子的GSH/Hyal-1/pH多重刺激響應(yīng)性。
[0009]因此，針對(duì)乳腺癌治療，研究開(kāi)發(fā)在血液循環(huán)中穩(wěn)定、對(duì)癌細(xì)胞有主動(dòng)靶向性、可控藥物快速向細(xì)胞質(zhì)釋放和高載藥量的載藥納米粒子，對(duì)提高抗乳腺癌治療效果，恢復(fù)病患者的身體健康，具有重要的科學(xué)意義和良好的應(yīng)用前景與經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]為了克服現(xiàn)有技術(shù)不足和缺點(diǎn)，本發(fā)明的首要目的在于提供一種還原/酶/pH多重響應(yīng)性釋藥的核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的制備方法，該制備方法重復(fù)性好，操作性強(qiáng)。
[0011]本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到的還原/酶/pH多重響應(yīng)性釋藥的核殼結(jié)構(gòu)納米粒子，該納米粒子以高載藥的殼聚糖(Cs)納米膠束為核層，以組氨酸(His)和半胱胺(Cys)修飾的透明質(zhì)酸(HA)為殼層，核層和殼層通過(guò)靜電作用復(fù)合形成具有核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子，然后殼層進(jìn)一步氧化交聯(lián)以提高納米粒子的穩(wěn)定性。該納米粒子具有在血液中穩(wěn)定性好、主動(dòng)靶向乳腺癌細(xì)胞、載藥量高、在乳腺癌細(xì)胞的內(nèi)涵體/溶酶體中可以GSH/Hayl-1/pH多重刺激響應(yīng)性釋放藥物等特點(diǎn)。
[0012]本發(fā)明的再一目的在于提供上述還原/酶/pH多重響應(yīng)性釋藥的核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0014]—種還原/酶/pH多重響應(yīng)性釋藥的核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的制備方法，包含以下步驟:
[0015](I)核層殼聚糖基高載藥納米膠束的制備
[0016]①將含有反應(yīng)活性羥基的疏水性抗癌藥物、丁二酸酐溶解于有機(jī)溶劑中，加入三乙胺進(jìn)行酯化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后去除未反應(yīng)的化合物并干燥，得到丁二酸酐改性藥物；由于丁二酸酐化藥物分子的酯鍵在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境中會(huì)水解，恢復(fù)原來(lái)的藥物分子結(jié)構(gòu)，因此不會(huì)影響這部分藥物的活性；
[0017]②將步驟①中制得的丁二酸酐改性藥物溶于有機(jī)溶劑中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)對(duì)丁二酸酐化藥物分子上的羧基進(jìn)行活化反應(yīng);然后加入含有殼聚糖(Cs)的MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)緩沖液，使藥物分子的活化羧基與Cs的氨基進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后透析、干燥，得到雙親性的殼聚糖基藥物衍生物;該衍生物中的疏水基團(tuán)是化學(xué)鍵合的藥物分子，與游離藥物相互作用有利于物理包覆更多藥物；
[0018]③將步驟②中得到的殼聚糖基藥物衍生物溶于鹽酸/有機(jī)溶劑混合溶劑中，然后在超聲條件下緩慢滴加含有反應(yīng)活性羥基的疏水性抗癌藥物的有機(jī)溶劑，形成納米膠束，滴加結(jié)束后攪拌使載藥完全，然后透析除去未負(fù)載的藥物，干燥，得到殼聚糖基高載藥納米膠束；
[0019](2)殼層透明質(zhì)酸分子的組氨酸和半胱胺修飾
[0020]①將透明質(zhì)酸(HA)溶解于磷酸鹽緩沖液中，加入EDC.HCl和NHS對(duì)羧基進(jìn)行活化反應(yīng)，然后加入組氨酸甲酯鹽酸鹽(His)進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后透析、干燥，得到組氨酸修飾的透明質(zhì)酸(His-HA)；
[0021