特異結合胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗原的單克隆抗體及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種特異結合胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗原的單克隆抗體及分泌它的雜交瘤細胞系，該雜交瘤細胞系保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.9051。本發(fā)明還公開了該單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明還公開了一種體外化學標記處理的該單克隆抗體。本發(fā)明還公開了競爭ELISA檢測胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗體試劑盒。本發(fā)明的競爭ELISA試劑盒檢測樣品可以在1h內(nèi)完成，比目前的商品化間接ELISA檢測試劑盒快0.5h，比檢驗檢疫行業(yè)標準使用的阻斷ELISA快1.5h，一天內(nèi)可以完成多批次樣品檢測，符合疫病快速診斷的要求。
CGMCC NO.9051
2014.04.10
【專利說明】特異結合胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗原的單克隆抗體及 試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術和動物檢疫【技術領域】，具體涉及一種特異結合胸膜肺炎放線 桿菌血清7型抗原的單克隆抗體及分泌它的雜交瘤細胞系，此外，本發(fā)明還涉及一種競爭 ELISA檢測胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗體試劑盒。

【背景技術】
[0002] 豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumoniae)是由胸膜肺炎放線 桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，簡稱App)引起的豬的一種呼吸道傳染病，具有 高度傳染性，多呈最急性或急性病程而迅速致死，其發(fā)病率和死亡率都在50%以上，最急性 型的死亡率可高達80-100%，慢性型可導致豬生長緩慢，成為僵豬，該病是集約化豬場常見 豬病之一，是我國進口種豬檢疫的豬病之一。我國曾多次從美國、丹麥、英國等進口種豬中 檢出豬傳染性胸膜肺炎。根據(jù)胸膜肺炎放線桿菌可溶性抗原莢膜多糖和脂多糖抗原性的差 異，可將其分為15個血清型。血清學抗體檢測是最重要的診斷方法之一。
[0003] 由于App各型之間沒有完全的交叉保護，App每個血清型的毒力不同，每個血清 型在各個國家的分布也不同，因此，準確診斷感染血清型是預防和控制該病的基礎。App血 清7型是重要的致病血清型，我國從美國、加拿大進口種豬都要求檢疫此血清型。根據(jù)吉 林大學雷連成等從我國長春分離的App菌株毒力測定，血清7型對小鼠的致死率很高，達 66. 5%。
[0004] ELISA檢測方法方便、快速、敏感、特異，是抗體檢測最常用的方法。
[0005] 此檢測方法不需要昂貴的儀器，幾乎所有的檢測單位都備有ELISA儀，ELISA試劑 盒很容易推廣應用。就App而言，目前國內(nèi)外商品化ELISA檢測試劑盒還沒有只檢測血清 7型抗體的試劑盒。也沒有采用競爭ELISA檢測App抗體的試劑盒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術問題之一是提供能與App血清7型抗原特異結合的單克隆抗 體。
[0007] 本發(fā)明要解決的技術問題之二是提供分泌產(chǎn)生上述單克隆抗體的雜交瘤細胞系。
[0008] 本發(fā)明要解決的技術問題之三是提供本發(fā)明的單克隆抗體的制備方法。
[0009] 本發(fā)明要解決的技術問題之四是提供一種體外化學標記過的單克隆抗體。
[0010] 本發(fā)明要解決的技術問題之五是提供基于上述單克隆抗體研制的競爭ELISA檢 測胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗體試劑盒。
[0011] 本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0012] 在本發(fā)明的一方面，提供一種分泌特異結合胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗原的單 克隆抗體的雜交瘤單克隆細胞，代號為SHCIQ-S7-8D12雜交瘤細胞株，經(jīng)間接ELISA和競爭 ELISA檢測，證實其所分泌的單克隆抗體能夠特異識別并結合胸膜肺炎放線桿菌血清7型 抗原。該雜交瘤細胞株已于2014年4月10日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心（簡稱為CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 9051，保藏地點：中國，北京。
[0013] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種特異結合胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗原的單克 隆抗體，由上述保藏編號為CGMCC No. 9051的雜交瘤細胞系分泌產(chǎn)生。
[0014] 本文所采用的術語"單克隆抗體（單抗）"指從一純系細胞得到的免疫球蛋白，具 有相同的結構和化學特性，對單一抗原決定簇有特異性。單克隆抗體與常規(guī)多克隆抗體制 劑（通常是具有針對不同決定簇的不同抗體）不同，各單克隆抗體是針對抗原上的單個決 定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的好處還在于它們是通過雜交瘤或重組工程細胞 培養(yǎng)獲得，不會混雜有其它免疫球蛋白。修飾語"單克隆"表示了抗體的特性，是從均一的 抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特殊方法來生產(chǎn)抗體。
[0015] 本文所采用的術語"雜交瘤細胞系"（英文名稱：hybridoma cell line)，指從雜交 瘤細胞中篩選培養(yǎng)出的細胞系。
[0016] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種上述單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：
[0017] 步驟1、制備免疫原：配制巧克力培養(yǎng)基，將胸膜肺炎放線桿菌血清7型標準菌株 復蘇，大量培養(yǎng)，用生理鹽水洗菌，離心，棄上清，細菌沉淀用生理鹽水洗懸浮，離心，生理鹽 水懸浮的S7細菌全抗原作為免疫原；
[0018] 步驟2、小鼠免疫：通過反復多次小劑量的小鼠皮下免疫，挑選可分泌高效價的抗 App血清7型多克隆抗體的小鼠；
[0019] 步驟3、細胞融合：取免疫小鼠脾臟細胞,通過體外與小鼠骨髓瘤細胞融合；
[0020] 步驟4、陽性雜交瘤細胞篩選：用間接ELISA試驗篩選抗胸膜肺炎放線桿菌血清7 型抗原的陽性雜交瘤細胞；
[0021] 步驟5、陽性雜交瘤細胞的獲得：選擇強陽性反應的雜交瘤細胞，用有限稀釋法連 續(xù)克隆3次，最后一次克隆后檢測為陽性的孔所得細胞株即為穩(wěn)定分泌的、特異的抗胸膜 肺炎放線桿菌血清7型抗體的雜交瘤細胞株；
[0022] 步驟6、雜交瘤細胞的培養(yǎng)與保存：將陽性雜交瘤細胞擴增培養(yǎng)，收集細胞；一部 分用于生產(chǎn)小鼠腹水抗體，另一部分液氮保存。
[0023] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術方案，步驟1具體為：配制巧克力培養(yǎng)基，將胸膜肺炎放線 桿菌血清7型標準菌株復蘇，大量培養(yǎng)，用生理鹽水將菌洗下，8000r/min離心lOmin，棄上 清，細菌沉淀用生理鹽水洗懸浮，離心，如此洗菌3次。細菌沉淀用含0. 5%甲醛生理鹽水懸 浮，放置4°C過夜滅活，8000r/min離心lOmin去除甲醛，用生理鹽水洗3次。生理鹽水懸浮 的S7細菌全抗原作為免疫原；
[0024] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術方案，步驟2具體為：將上述免疫原與等體積的福氏完全 佐劑混合乳化，對8周齡的BALB/C雌鼠做腹腔注射，3-4周后用同樣免疫原乳化在福氏不完 全佐劑中，作第二次腹腔注射，2-3周后用加倍劑量的免疫原作最后一次腹腔注射，三天后 取小鼠脾臟用于細胞融合。
[0025] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術方案，步驟3具體為：取免疫小鼠脾臟細胞，通過體外與 小鼠骨髓瘤細胞SP2/0按5-10:1的比例在50% PEG下融合，用HAT培養(yǎng)基篩選；融合細 胞培養(yǎng)5d后，用HAT培養(yǎng)基再換液一次，第10d用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細胞覆蓋孔低 5% -30%時，取上清用間接ELISA方法篩選。
[0026] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術方案，步驟4中，篩選時包被抗原為App S7型經(jīng)反復凍融 3次處理的抗原，所述抗原以1:5000稀釋，并以其它血清型的App為陰性對照。
[0027] 此外，在本發(fā)明的另一方面，還提供一種體外化學標記處理的上述抗胸膜肺炎放 線桿菌血清7型抗原的單克隆抗體。
[0028] 所述體外化學標記處理的步驟如下：
[0029] 1)將腹水單克隆抗體用硫酸銨純化；
[0030] 2)用改良過碘酸鈉法將抗體與HRP偶聯(lián)，鹽析法去除樣品中未結合的HRP，最終產(chǎn) 物對PBS透析過夜，即得到體外化學標記過的辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體。
[0031] "改良過碘酸鈉法"可參考韓文瑜等主編的病原細菌檢驗技術（吉林科學技術出版 社1992年7月第1版P204)，主要步驟如下：
[0032] (1)將5mgHRP溶于0. 5ml蒸餾水中，加入新配制的0. 06mol/L NaI04水溶液 0. 5ml，混勻置冰箱中30min。
[0033] (2)加入0· 16mol/L乙醇水溶液0· 5ml，置室溫放置30min。
[0034] (3)加入含5mg純化抗體的水溶液1ml，混勻后裝入透析袋，以0· 05mol/L, pH值 9. 5碳酸鹽緩沖液緩慢攪拌透析6小時或過夜。
[0035] (4)吸出后，加 NaBH4溶液（5mg/ml) 0· 2ml,置冰箱2小時。
[0036] (5)將上述結合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置冰箱30分鐘，離心，將所 得沉淀物溶于少許〇. 〇2mol/L，pH值7. 4PBS中，并對之透析過夜。
[0037] (6)離心除去不溶物，即得到體外化學標記過的辣根過氧化物酶（HRP)標記的單 克隆抗體。
[0038] 此外，在本發(fā)明的另一方面，還提供一種競爭ELISA檢測胸膜肺炎放線桿菌血清7 型抗體試劑盒,主要包括：胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗原；如權利要求3所述的體外化學 標記處理的可特異結合胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗原的單克隆抗體；胸膜肺炎放線桿菌 血清7型陽性對照血清；陰性對照血清。
[0039] 該試劑盒的使用方法，包括如下步驟：1)包被抗原；2)洗板；3)封閉；4)洗板；5) 加入被檢血清，同時加入辣根過氧化物酶標記的抗App血清7型抗原的單克隆抗體；6)洗 板；7)加入底物；8)終止反應；9)檢測吸光值（0D值）；10)計算并判定結果。步驟10)中， 所述判定結果具體如下：（1)陰性對照血清0D值大于0. 8 ; (2) 0D陽性/0D陰性< 20% ;對 照成立才能進行樣品判斷；（3)血清樣品1:16稀釋，其S/N值（0D樣品/陰性0D)彡20% 為陽性，S/N > 40%為陰性，40%彡S/N > 20%為可疑。
[0040] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于：為準確檢測App血清7型，在研制App 血清7型單抗的基礎上，研制了競爭ELISA檢測胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗體試劑盒。 與使用多克隆抗體相比，使用單克隆抗體，檢測試劑盒容易批量生產(chǎn)，試劑盒的質(zhì)量容易控 制。與間接ELISA相比，競爭ELISA檢測無種屬特異型，除檢測豬抗體外，還能檢測鼠等實 驗動物抗體，可以用于建立豬傳染性胸膜肺炎實驗動物模型效果評估。且本發(fā)明建立的競 爭ELISA方法檢測樣品可以在lh內(nèi)完成，比目前的商品化間接ELISA檢測試劑盒快0. 5h， 比檢驗檢疫行業(yè)標準使用的阻斷ELISA快1. 5h，一天內(nèi)可以完成多批次樣品檢測，符合疫 病快速診斷的要求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041] 圖1是本發(fā)明實施例2中12% SDS-PAGE IgM電泳圖；其中，Μ代表蛋白分子量標 準（170kD, 130kD, 95kD, 72kD(red), 55kD, 43kD, 34kD, 26kD, 17kD, llkD) ;1 代表 2ug BSA ;2 代表 4ug BSA ;3 代表 8ug BSA ;4 代表 16ug BSA ;5 代表 lul IgM(稀釋 10 倍）；6 代表 2ul IgM(稀釋10倍）；7代表4ul IgM(稀釋10倍）。
[0042] 圖2是本發(fā)明實施例3中1:1萬稀釋的酶濃度檢測不同稀釋度抗原的結果示意 圖；
[0043] 圖3是本發(fā)明實施例3中1:2萬稀釋的酶濃度檢測不同稀釋度抗原的結果示意 圖；
[0044] 圖4是本發(fā)明實施例3中陽性血清比值的散點圖；
[0045] 圖5是本發(fā)明實施例3中陰性血清比值的散點圖；
[0046] 圖6是本發(fā)明實施例3中不同時間陰性和陽性血清吸光值的變化示意圖；
[0047] 代號為SHCIQ-S7-8D12的小鼠雜交瘤細胞株（來源于小鼠 Mus musculus)，經(jīng)間 接ELISA和競爭ELISA檢測，證實其所分泌的單克隆抗體能夠特異識別并結合胸膜肺炎放 線桿菌血清7型抗原。該小鼠雜交瘤細胞株已于2014年4月10日保藏在中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱為CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 9051，保藏地點： 中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。

【具體實施方式】
[0048] 下面的實施例可以使本領域技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制 本發(fā)明。
[0049] 實施例1雜交瘤細胞株制備及單克隆抗體的制備
[0050] 步驟1、免疫原的制備：配制巧克力培養(yǎng)基，在巧克力培養(yǎng)基上劃線將胸膜肺炎放 線桿菌血清7型標準菌株（App S7)復蘇、大量培養(yǎng)，用生理鹽水將菌洗下，8000r/min離 心lOmin，棄上清，細菌沉淀用生理鹽水懸浮，離心，如此洗菌3次。細菌沉淀用含0.5%甲 醛生理鹽水懸浮，放置4°C過夜滅活，8000r/min離心lOmin去除甲醛，用生理鹽水洗3次。 生理鹽水懸浮的App S7細菌全抗原作為免疫原；步驟2、BALB/C小鼠免疫：將上述免疫原 (含1〇4胸膜肺炎放線桿菌）與等體積的福氏完全佐劑混合乳化，對8周齡的BALB/C雌鼠 做腹腔注射免疫，3-4周后用同樣免疫原乳化在福氏不完全佐劑中，作第二次腹腔注射免 疫，2-3周后用加倍劑量的免疫原進行腹腔注射加強免疫，三天后取小鼠脾臟用于細胞融 合。步驟3、細胞融合：取上述免疫小鼠脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞（SP2/0)按5-10:1的比 例，在無血清的RPMI-1640(Gibco)培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50% PEG(Sigma，分子量1500)作為融合劑，在37°C下水浴下加入lml，使其融合2min，用無血清 的RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔 含有飼養(yǎng)細胞的細胞板中，37°C，5% C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。步驟4、陽性雜交瘤細胞篩 選：細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合 細胞覆蓋孔底5 % -30 %時用間接ELISA試驗篩選分泌抗胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗原 抗體的陽性雜交瘤細胞，篩選時包被抗原為App S7型經(jīng)反復凍融3次處理的抗原（1:5000 稀釋，重量/體積，g/ml)，并以其它血清型的App為陰性對照。步驟5、陽性雜交瘤細胞的 獲得：選擇間接ELISA強陽性反應的雜交瘤細胞孔，用有限稀釋法連續(xù)克隆細胞3次，最后 一次克隆后檢測為陽性的孔所得細胞株即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。陽性雜交瘤 細胞為穩(wěn)定分泌的、特異的抗胸膜肺炎放線桿菌血清7型的雜交瘤單克隆細胞；
[0051] 步驟6、雜交瘤細胞的培養(yǎng)與保存：將陽性雜交瘤細胞擴增培養(yǎng)，收集細胞；一部 分用于生產(chǎn)小鼠腹水抗體，用凍存液懸浮另一部分細胞后分裝于凍存管后于液氮中保存。
[0052] 步驟7、腹水制備：取8周齡健康BALB/C小鼠，腹腔注入0. 5ml/只滅菌的液體石 蠟，10天后注入雜交瘤細胞0. 5ml/只（濃度為106個/ml)，待小鼠腹部膨脹，行動困難時， 用大號針頭刺入小鼠腹部收集腹水，4000g離心3min，上清液即為腹水單克隆抗體。
[0053] 實施例2體外化學標記單克隆抗體
[0054] 主要步驟是：
[0055] 1、單抗的亞型鑒定：使用荷蘭HyCult Biotechnology生產(chǎn)的小鼠單克隆抗體檢 測試劑盒（Mouse Mab Isotying test kit),步驟如下：
[0056] a)將細胞上清或腹水用pH7. 4PBS適當稀釋，至抗體濃度1-50 μ g/mL備用；
[0057] b)加500 μ L稀釋液至含一條試紙條的檢測管中；
[0058] c)再加500 μ L a)中稀釋好的樣品至檢測管中；
[0059] d)將試紙條完全浸入并輕輕攪動；
[0060] e)輕搖瓶子混勻兔抗鼠 K鏈膠粒，取lmL加入至檢測管中；
[0061] f)在18-25°C環(huán)境中振蕩30min左右判讀結果，試紙條在振蕩過程中始終保持浸 在溶液中。
[0062] 經(jīng)檢測，本發(fā)明建立的穩(wěn)定分泌抗胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗體的雜交瘤單克 隆細胞系（保存代號為SHCIQ-S7-8D12)分泌的單抗為IgM亞型。
[0063] 2、單抗的純化
[0064] 將腹水單克隆抗體用硫酸銨純化
[0065] a) 2ml腹水加入2ml PBS溶液稀釋，共得到4ml溶液，加入飽和硫酸銨溶液4ml (緩 慢加入，一邊加一邊混勻），4°C放置過夜；
[0066] b)4°C離心（lOOOOrpm，10分鐘）棄去上清，沉淀加入4ml PBS溶液，重懸，加入飽 和硫酸銨溶液2ml (緩慢加入，一邊加一邊混勻），4°C放置過夜；
[0067] c)4°C離心（lOOOOrpm，10分鐘）棄去上清，沉淀加入4ml PBS溶液，重懸，加入飽 和硫酸銨溶液2ml (緩慢加入，一邊加一邊混勻），4°C放置過夜；
[0068] d) 4°C離心（lOOOOrpm，10分鐘）棄去上清，沉淀加入2ml PBS溶液，對1LPBS透析 24小時（換2次透析液）。
[0069] 3、單抗含量的電泳檢測
[0070] 配制12% SDS-PAGE膠，將純化的IgM單抗10倍稀釋后，分別取lul、2ul、4ul電 泳，用BSA作為定量參考，見圖1。根據(jù)電泳檢測結果，純化后（即標記前）的IgM的濃度約 為 10mg/ml〇
[0071] 4、單抗的標記
[0072] 參考韓文瑜等主編的病原細菌檢驗技術（吉林科學技術出版社1992年7月第1 版P204)，由上海友科生物科技有限公司用改良過碘酸鈉法將抗體與HRP偶聯(lián)，主要步驟如 下：
[0073] (1)將5mgHRP溶于0. 5ml蒸餾水中，加入新配制的0. 06mol/L NaI04水溶液 0. 5ml，混勻置冰箱中30min。
[0074] (2)加入0· 16mol/L乙醇水溶液0· 5ml，置室溫放置30min。
[0075] (3)加入含5mg純化抗體的水溶液1ml，混勻后裝入透析袋，以0· 05mol/L, pH值 9. 5碳酸鹽緩沖液緩慢攪拌透析6小時或過夜。
[0076] (4)吸出后，加 NaBH4溶液（5mg/ml) 0· 2ml,置冰箱2小時。
[0077] (5)將上述結合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置冰箱30分鐘，離心，將所 得沉淀物溶于少許〇. 〇2mol/L，pH值7. 4PBS中，并對之透析過夜。
[0078] (6)離心除去不溶物，即得到體外化學標記過的辣根過氧化物酶（HRP)標記的單 克隆抗體。
[0079] 5、酶標效價的初步測定
[0080] 使用直接ELISA，包被抗原為App S7和App S6,均1:50倍稀釋，后者作為陰性對 照。將酶標單抗按照1:625-1:40000稀釋，滴定酶標抗體效價，見表1，初步選擇酶濃度1:1 萬-1:2萬。
[0081] 表1酶標抗體效價滴定
[0082]

【權利要求】
1. 一種分泌特異結合胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗原的單克隆抗體的雜交瘤細胞系， 其保藏編號為CGMCC No. 9051。
2. -種特異結合胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗原的單克隆抗體，由權利要求1所述的 雜交瘤細胞系分泌產(chǎn)生。
3. -種如權利要求2所述單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟： 步驟1、制備免疫原：配制巧克力培養(yǎng)基，將胸膜肺炎放線桿菌血清7型標準菌株復蘇， 大量培養(yǎng)，用生理鹽水洗菌，離心，棄上清，細菌沉淀用生理鹽水洗懸浮，離心，生理鹽水懸 浮的S7細菌全抗原作為免疫原； 步驟2、小鼠免疫：通過反復多次小劑量的小鼠皮下免疫，挑選可分泌高效價的抗App 血清7型多克隆抗體的小鼠； 步驟3、細胞融合：取免疫小鼠脾臟細胞,通過體外與小鼠骨髓瘤細胞融合； 步驟4、陽性雜交瘤細胞篩選：用間接ELISA試驗篩選抗胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗 原的陽性雜交瘤細胞； 步驟5、陽性雜交瘤細胞的獲得：選擇強陽性反應的雜交瘤細胞，用有限稀釋法連續(xù)克 隆3次，最后一次克隆后檢測為陽性的孔所得細胞株即為穩(wěn)定分泌的、特異的抗胸膜肺炎 放線桿菌血清7型抗體的雜交瘤細胞株； 步驟6、雜交瘤細胞的培養(yǎng)與保存：將陽性雜交瘤細胞擴增培養(yǎng)，收集細胞；一部分用 于生產(chǎn)小鼠腹水抗體，另一部分液氮保存。
4. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟1具體為：配制巧克力培養(yǎng)基，將 胸膜肺炎放線桿菌血清7型標準菌株復蘇，大量培養(yǎng)，用生理鹽水將菌洗下，8000r/min離 心lOmin，棄上清，細菌沉淀用生理鹽水洗懸浮，離心，如此洗菌3次。細菌沉淀用含0. 5%甲 醛生理鹽水懸浮，放置4°C過夜滅活，8000r/min離心lOmin去除甲醛，用生理鹽水洗3次。 生理鹽水懸浮的S7細菌全抗原作為免疫原。
5. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟2具體為：將上述免疫原與等體積 的福氏完全佐劑混合乳化，對8周齡的BALB/C雌鼠做腹腔注射，3-4周后用同樣免疫原乳化 在福氏不完全佐劑中，作第二次腹腔注射，2-3周后用免疫原作最后一次腹腔注射，三天后 取小鼠脾臟用于細胞融合。
6. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟3具體為：取免疫小鼠脾臟細胞， 通過體外與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0按5-10:1的比例在50 % PEG下融合，用HAT培養(yǎng)基篩 選；融合細胞培養(yǎng)5d后，用HAT培養(yǎng)基再換液一次，第10d用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細胞 覆蓋孔低5% -30%時，取上清用間接ELISA方法篩選。
7. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟4中，篩選時包被抗原為App S7型 經(jīng)反復凍融3次處理的抗原，所述抗原以1:5000稀釋，并以其它血清型的App為陰性對照。
8. -種體外化學標記處理的如權利要求2所述的特異結合胸膜肺炎放線桿菌血清7型 抗原的單克隆抗體。
9. 一種如權利要求8所述的單克隆抗體，其特征在于，所述體外化學標記處理的步驟 如下： 1) 將腹水單克隆抗體用硫酸銨純化； 2) 用改良過碘酸鈉法將抗體與HRP偶聯(lián)，鹽析法去除樣品中未結合的HRP，最終產(chǎn)物對 PBS透析過夜，即得到體外化學標記過的辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體。
10. -種競爭ELISA檢測胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗體試劑盒，其特征在于，主要包 括：胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗原；如權利要求3所述的體外化學標記處理的可特異結 合胸膜肺炎放線桿菌血清7型抗原的單克隆抗體；胸膜肺炎放線桿菌血清7型陽性對照血 清；陰性對照血清。
【文檔編號】G01N33/577GK104297485SQ201410571437
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月23日 優(yōu)先權日:2014年10月23日
【發(fā)明者】李樹清, 陳志飛, 張強, 王巧全, 林穎崢, 劉雨瀟, 吳建詳, 陸承平, 宋青, 唐智芳 申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局, 南京農(nóng)業(yè)大學