專利名稱：一株產(chǎn)琥珀酸的琥珀酸放線桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株厭氧條件下發(fā)酵高產(chǎn)琥珀酸的微生物菌株(F3-ZK)的選育，以及發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸過程，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
琥珀酸，學(xué)名丁二酸，因最早于琥珀中發(fā)現(xiàn)而得名。作為一種重要的C4平臺(tái)化合物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、可降解塑料和化學(xué)工業(yè)。琥珀酸主要是通過來源于石化原料的順丁烯二酐水解得到。由于石化資源的不可再生和石化工業(yè)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的負(fù)面影響，發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸作為一種新興的綠色工藝，已成為近年來研究的熱點(diǎn)。發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸具有低碳、清潔環(huán)保的特點(diǎn)，符合可持續(xù)發(fā)展的要求。其中選育高產(chǎn)琥珀酸菌株是實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸工業(yè)化的關(guān)鍵一環(huán)。目前，已報(bào)道發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸的微生物菌株有產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Mc tinobacillus succinogenes )、 產(chǎn)琥拍酸厭氧螺、lif (.Anaerobiospirillum succiniciproducens ) > 產(chǎn)琥拍酸曼氏溶血桿HMannheimia Succiniciproducens ) >大腸桿菌(萬.coli )和谷氨酸棒桿菌 (Corynebac terium glu tanicum )。早期研究較為成功的嚴(yán)格厭氧螺菌Jaaero力io^iriW腫 succiniciproducens ATCC 四305，其產(chǎn)琥珀酸可達(dá) 43g/L，產(chǎn)率 91% (US 5, 143, 833 ；US 5，143，834和US 5，168，055)；密歇根大學(xué)和密歇根生物技術(shù)研究所篩選的兼性厭氧菌 Bacterium 130Z (Actinobacillus succinogenes ATCC 55618)，產(chǎn)琥珀酸含量可達(dá) 70g/ L，產(chǎn)率80% (US 5，04，004，1996 ；US 5，723，322，1998)，其最高研究水平發(fā)酵7 產(chǎn)酸達(dá)到 106.8 g/L，對(duì)葡萄糖產(chǎn)率83% (US 5573931，1996)；韓國科學(xué)技術(shù)研究院研究組篩選曼氏琥珀酸桿菌sWccifliciZTroifoceas,報(bào)道的最高產(chǎn)琥珀酸水平為52. 4 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度 1.8 g/L'h, (S. J. Lee et al. Appl Envi Microbiol, 2006)。美國阿貢國家實(shí)驗(yàn)室Μ. I. Donnelly等、南伊利諾斯州大學(xué)的Clark DP等研究組、喬治亞大學(xué)的Mark Α. Eiteman研究組等研究構(gòu)建大腸桿菌基因工程菌，其中五cWi AFPlll/pTrc99A- pyc最高水平產(chǎn)酸 99. 2 g/L(Vemuri G N et al. J Ind Microbiol Biotechnol, 2002)。但是，上述有生產(chǎn)前景的菌株受專利保護(hù)，不易獲得。中國專利 CN 1884484A 公布了一株 Jciiz7O^ciBw1S succinogenes NJ113，編號(hào)為CGMCC N0. 171，其產(chǎn)琥珀酸可達(dá)38. 5 g/L ；中國專利CN1884484A公布了一株高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌CGMCC N0. 3991，其發(fā)酵液最高產(chǎn)琥珀酸35. 8g/L。本研究小組前期從牛的瘤胃中篩選到一株產(chǎn)琥珀酸的野生菌株，通過菌種鑒定確認(rèn)為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌CGMCC 1593 (中國專利ZL 200610038113. 6);通過NTG誘變選育氟乙酸鈉抗性突變株，得到產(chǎn)量提高的誘變菌株SF-9 (工業(yè)微生物，2007, 37 (2) 1_7)，其5L發(fā)酵罐中發(fā)酵3 可積累琥珀酸 40. 5g/L，應(yīng)用基因組改組技術(shù)選育到耐鈉、氟乙酸鈉抗性改組菌CGMCC 2653 (即F3-IO,中國專利ZL 200810146688. 9)，該菌株在5L發(fā)酵罐中補(bǔ)料分批發(fā)酵4 產(chǎn)琥珀酸53. 96g/L。 2009年報(bào)道了采用基因組改組技術(shù)選育耐酸性琥珀酸放線桿菌F3-21，其在5L發(fā)酵罐中補(bǔ)料分批發(fā)酵7 產(chǎn)琥珀酸達(dá)到67. 4g/L (微生物學(xué)通報(bào)，2009，36 (11) :1676_1681)。但是這些菌株的產(chǎn)琥珀酸水平多數(shù)達(dá)不到70g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度在1.3 g/(L.h)以下，應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的成本相對(duì)還是偏高。本發(fā)明針對(duì)上述問題，在前期工作的基礎(chǔ)上，采用基因組改組技術(shù)，通過改進(jìn)篩選方法，選育到高產(chǎn)琥珀酸的琥珀酸放線桿菌F3-ZK，其產(chǎn)酸水平為70-95. 6 g/L。比出發(fā)菌株F3-21產(chǎn)酸提高41. 8%，生產(chǎn)強(qiáng)度提高111. 7%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高9. m。該菌株具有高產(chǎn)、 降低生產(chǎn)成本的優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株產(chǎn)琥珀酸的琥珀酸放線桿菌，其產(chǎn)酸水平為70-95. 6 g/ L0本發(fā)明的技術(shù)方案一株高產(chǎn)琥珀酸的琥珀酸放線桿菌Mc tinobacillus succinogenes) F3-ZK，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC NO :M2012036。所述CCTCC N0:M2012036菌株的應(yīng)用，該菌在5-15L發(fā)酵罐中，補(bǔ)料分批發(fā)酵 36-48 h 產(chǎn)琥珀酸 70-95. 6 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度 1. 70-1. 99 g/(L *h)，糖酸轉(zhuǎn)化率 0. 70-0. 83 g/一株高產(chǎn)琥珀酸的琥珀酸放線桿菌JciiflO力aci/^As succinogenes F3-ZK， 巳保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC NO :M2012036o通過以下選育得到 CGMCC1593經(jīng)基因組改技術(shù)得到的菌株F3-21為出發(fā)菌株，通過吖啶黃、紫外線、紫外線-硫酸二乙酯和亞硝基胍誘變，采用“96孔板培養(yǎng)-HPLC濃縮檢測(cè)-厭氧瓶復(fù)篩”的方法，獲得進(jìn)一步進(jìn)行基因組改組的出發(fā)菌庫，再通過三輪的原生質(zhì)體遞進(jìn)融合，得到改組菌A succinogenes F3_ZK0以下是本發(fā)明方法的詳細(xì)描述
改進(jìn)的“96孔板培養(yǎng)-HPLC濃縮檢測(cè)-厭氧瓶復(fù)篩”篩選方法 吖啶黃、紫外線、紫外線-硫酸二乙酯和亞硝基胍對(duì)菌株F3-21進(jìn)行誘變處理，處理液涂布于選擇性平板，并于37°C厭氧培養(yǎng)3-5 d。選擇性平板上長出的單菌落用牙簽接入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于厭氧手套箱中在100%C02條件下培養(yǎng)M-72 h。采用濃縮檢測(cè)法對(duì)96孔進(jìn)行HPLC檢測(cè)第一步96孔板中孔的編號(hào)規(guī)則先按96孔板發(fā)酵批次編號(hào)I、II、III、IV、V等，然后在每塊96孔板中，按行順序編號(hào)1、2、3··· 12和列順序編號(hào)A、 B、O·· H ；第二步將每行如1-A，1-B,……I-H孔中的發(fā)酵液等體積混合，樣品處理后進(jìn)行 HPLC檢測(cè)；第三步對(duì)檢測(cè)結(jié)果最高一組(假設(shè)是第2組)中的單孔發(fā)酵液進(jìn)行下一輪檢測(cè)， 如對(duì)2-A，2-B,……2-H孔中的發(fā)酵液分別用HPLC檢測(cè)，通過減少測(cè)定數(shù)量，達(dá)到濃縮篩選的目的。每塊細(xì)胞培養(yǎng)板選出1-2株產(chǎn)琥珀酸含量最高的菌株，接種到厭氧瓶中進(jìn)行復(fù)篩， 產(chǎn)酸高的前5-15株菌組成基因組改組的出發(fā)菌庫。選擇平板是在TSB平板培養(yǎng)基中，分別添加0.3-0. 5 mol/L琥珀酸鈉、10-100 g/L 丙酮酸鈉、1-20 g/L氟乙酸鈉和稀釋1-5倍發(fā)酵液，制成相應(yīng)的琥珀酸鈉的平板，丙酮酸鈉的平板，氟乙酸鈉的平板以及發(fā)酵液的平板。發(fā)酵培養(yǎng)基按文獻(xiàn)微生物學(xué)通報(bào)(2009,36 :1676-1681)中報(bào)道的方法?；蚪M改組方法
改組出發(fā)菌庫的菌株培養(yǎng)12-24 h后轉(zhuǎn)接到另一新鮮培養(yǎng)基中，取基本處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞在6000-100000r/min轉(zhuǎn)速下離心，PB緩沖液洗滌和制成菌體懸液，向菌懸液中加入適量溶菌酶于在37°C水浴中酶解得到原生質(zhì)體。將得到的原生質(zhì)體懸液等量混合后分成兩等份，分別進(jìn)行紫外(25 W紫外燈下30 cm處照射5_10 min)和熱滅活(55°C，20-60 min)，取等量的滅活菌懸液在離心管中混合，離心后用PB緩沖液懸浮，然后加入0.2-5mL PEG在37 °C水浴中融合5-20min，離心棄去上清，用PB緩沖液懸浮，涂布選擇性再生平板上， 倒置于37°C厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-5 d。將再生平板上長出的融合子挑入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按 “96孔板培養(yǎng)-HPLC濃縮檢測(cè)-厭氧瓶復(fù)篩”篩選方法，進(jìn)行第一輪基因組改組菌的篩選。 將得到的3-5株高產(chǎn)菌，作為第二輪基因組改組的母本，按同樣的流程進(jìn)行第二輪、第三論基因組改組。有機(jī)酸產(chǎn)物檢測(cè)方法，按中國專利ZL 200610038113. 6所述的方法。酶活分析按文獻(xiàn)Arch Microbiol (1997,167 332 - 342)所述的方法。本發(fā)明的有益效果通過改進(jìn)篩選方法，選育到高產(chǎn)琥珀酸的琥珀酸放線桿菌 F3-ZK,即CCTCC NO :M2012036，其產(chǎn)酸水平為70-95. 6 g/L。比出發(fā)菌株F3_21產(chǎn)酸提高 41. 8%，生產(chǎn)強(qiáng)度提高111. 7%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高9. m。該菌株具有高產(chǎn)、降低生產(chǎn)成本的優(yōu)勢(shì)。生物材料樣品保藏一株高產(chǎn)琥珀酸的琥珀酸放線桿菌Mc tinobacillus succinogenes) F3-ZK，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期2012年2月洸日，保藏編號(hào)CCTCC NO :M2012036。


圖1 F3-I改組菌5 L攪拌罐補(bǔ)料分批發(fā)酵曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
分別用吖啶黃、紫外線、紫外線-硫酸二乙酯和亞硝基胍誘變A succinogenes F3_21， 得到1056個(gè)單菌落；這些單菌經(jīng)過“96孔板培養(yǎng)-HPLC濃縮檢測(cè)-厭氧瓶復(fù)篩”獲得 11株琥珀酸產(chǎn)量高于出發(fā)菌株的突變株(III -9-H、IV -7-A、IV _7_C、V -12_B、VI -10-C、 W -11-H、VDI -10-H、IX -2-C、X -8-E、XI -8-B 和ΧΠ _7_B)，其平均搖瓶產(chǎn)琥珀酸較 F3-21 提高了 13. 9%。以該11株突變菌株為出發(fā)菌庫。實(shí)施例2
以11株誘變高產(chǎn)菌株作為改組出發(fā)菌庫進(jìn)行第一輪融合，11株菌酶解條件采用酶濃度為0. 25 mg/mL，酶解時(shí)間為60 min，采用紫外和熱致死雙滅活，PEG融合后涂布選擇性再生雙層平板，平板上共長出360多個(gè)單菌落，然后將這些單菌落挑入96孔板內(nèi)進(jìn)行通量篩選。第一輪基因組改組，得到4株F1代高產(chǎn)改組菌(F1- I -3-F, F1- II -7-B, F1-III -2-E 和F1- IV -9-D)，其平均搖瓶產(chǎn)琥珀酸較F3-21提高了 20. 2%，以F1代改組菌為母本進(jìn)行第二輪改組，篩選得到了 4株F2代高產(chǎn)改組菌(F2- I -5-B、F2- II -5-H、F2- III -6-D和 F2- III -10-F)，其平均搖瓶產(chǎn)琥珀酸較F3-21提高了 32. 9% ；再以F2代改組菌為母本進(jìn)行第三輪改組，結(jié)果篩選得到3株F3代高產(chǎn)改組菌(F3- I -9-C、F3- II _3_F、F3- II -10-D)，平均搖瓶產(chǎn)琥珀酸較F3-21提高了 45. 7%，其中F3- II _3_F(定名為F3-I)，搖瓶產(chǎn)琥珀酸達(dá)到 38. 9 g/L,比 F3-21 提高了 47. 6%。實(shí)施例3
將F3-I種子液，按10%接種量接入裝有3. 5L發(fā)酵液的5L發(fā)酵罐中，于37°C，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min下厭氧發(fā)酵，發(fā)酵過程通過補(bǔ)充葡萄糖漿維持糖濃度10-30 g/L，并用堿性鹽控制PH，維持5. 8-6. 4之間。其中，種子培養(yǎng)基(每L):葡萄糖5 g，酵母膏5 g，Κ2ΗΡ04·3Η20 1.0 g，NaH2PO4CH2O 1.0 g，pH 7.0。37°C厭氧培養(yǎng)16小時(shí)。發(fā)酵培養(yǎng)基(每L)甜高粱榨汁糖漿(總還原糖》0-80 g，酵母膏 0-15 g，玉米漿 20 g, MgCl2 0.2 g, Na2HPO4* 12 H2O 1.5 g, NaH2PO4 · 2 H2O 1. 5 g, pH 6. 5。37°C厭氧培養(yǎng) 48 小時(shí)。發(fā)酵曲線如圖1。48 h產(chǎn)琥珀酸95. 6 g/L。實(shí)施例4
測(cè)定改組菌F3-a(和出發(fā)菌F3-21的代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，結(jié)果如表1。表1. F3-ZK與F3-21代謝途徑中關(guān)鍵酶的酶活比較結(jié)果
權(quán)利要求
1.一株高產(chǎn)琥珀酸的琥珀酸放線桿菌(Jciiz7OAaciWw1S succinogenes) F3-ZK，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC NO :M2012036。
2.權(quán)利要求1所述CCTCCNO :M2012036菌株的應(yīng)用，其特征在于該菌在5-15L發(fā)酵罐中，補(bǔ)料分批發(fā)酵36-48 h產(chǎn)琥珀酸70-95. 6 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度1. 70-1. 99 g/(L*h)，糖酸轉(zhuǎn)化率 0. 70-0. 83 g/g。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株高產(chǎn)琥珀酸的琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)F3-ZK，以及其篩選和應(yīng)用于發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸的方法。該菌株是以CGMCC1593為出發(fā)菌株，經(jīng)多輪原生質(zhì)體遞進(jìn)融合，并通過“96孔板培養(yǎng)-HPLC濃縮檢測(cè)-厭氧瓶復(fù)篩”的方法獲得。該菌株已于2012年2月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCCNOM2012036。該菌在5-15L發(fā)酵罐中，采用補(bǔ)料分批發(fā)酵，48h產(chǎn)琥珀酸95.6g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度1.99g/(L·h)，糖酸轉(zhuǎn)化率0.71g/g。與國內(nèi)外其它菌株比具有高產(chǎn)、降低生產(chǎn)成本的優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102533622SQ201210056568
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月6日
發(fā)明者張坤坤, 鄭璞 申請(qǐng)人:江南大學(xué)