一種檢測(cè)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的酶聯(lián)免疫試劑盒，涉及酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)試【技術(shù)領(lǐng)域】。所述試劑盒中含有包被重組抗原構(gòu)成的酶標(biāo)板，酶標(biāo)二抗，小鼠陰性對(duì)照血清，感染西氏貝蛔蟲(chóng)鼠陽(yáng)性對(duì)照血清，底物溶液，洗滌液；其中，包被重組抗原為重組蛋白rBs-GST-1；所述酶標(biāo)二抗為羊抗鼠-HRP二抗，以上液體均分裝在試劑盒中。重組蛋白rBs-GST-1是通過(guò)克隆、表達(dá)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的Bs-GST-1蛋白而獲得的重組蛋白rBs-GST-1。rBs-GST-1具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，能夠有效地識(shí)別抗西氏貝蛔蟲(chóng)免疫血清。利用重組蛋白建立的ELISA方法臨床檢測(cè)出43份陽(yáng)性測(cè)試血清表明，其檢測(cè)率達(dá)79%以上，其特異性為82%，為有效防控大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)及該病的免疫學(xué)診斷奠定了理論基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種檢測(cè)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的酶聯(lián)免疫試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)試【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一種檢測(cè)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的 酶聯(lián)免疫試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 大熊貓（Ailuropoda melanoleuca)是我國(guó)特有的野生珍稀動(dòng)物，被譽(yù)為中國(guó)的 "國(guó)寶"?，F(xiàn)有野生大熊貓的數(shù)量在1600只左右，人工圈養(yǎng)的大熊貓僅有190只左右，但它 們?nèi)蕴幱诮^滅的邊緣。天敵危害、疾病侵襲、食物缺乏、棲息地縮小及繁殖能力低下等是造 成大熊貓趨于瀕危的原因，而在大熊貓疾病中，寄生蟲(chóng)病占有極其重要的位置。其中，又以 西氏貝蛔蟲(chóng)對(duì)大熊貓的危害最大。西氏貝蛔蟲(chóng)是引起大熊貓疾病的重要原因之一，感染率 高，診斷主要以傳統(tǒng)的糞便漂浮蟲(chóng)卵法及驅(qū)蟲(chóng)藥驅(qū)出蟲(chóng)體從而檢測(cè)是否有西氏貝蛔蟲(chóng)的感 染。雖然糞便漂浮沉淀法檢測(cè)簡(jiǎn)便易行，但是在感染度較低的情況下，蟲(chóng)卵檢測(cè)的敏感性也 明顯降低。
[0003] 近期也有研究者從大熊貓糞便中提取DNA，從而根據(jù)西氏貝蛔蟲(chóng)線(xiàn)粒體基因組序 列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增蛔蟲(chóng)蟲(chóng)卵DNA，期望從分子水平上建立了診斷大熊貓感染西氏貝蛔蟲(chóng) 的情況。而對(duì)于該蛔蟲(chóng)在感染的早期階段例如幼蟲(chóng)移行期階段等尚無(wú)診斷方法，加之大熊 貓這一特殊的物種，因此運(yùn)用病原學(xué)及PCR診斷方法存在局限。
[0004] 本研究以小鼠為模型,利用感染該蛔蟲(chóng)的小鼠陽(yáng)性血清和陰性血清、西氏貝蛔蟲(chóng) 重組蛋白為抗原構(gòu)建一種操作簡(jiǎn)單，快速、敏感的ELISA免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒及其方法，且對(duì) 該重組蛋白的檢測(cè)價(jià)值進(jìn)行評(píng)估，為以后建立診斷大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)感染的方法做基礎(chǔ)， 尤其是對(duì)潛伏期的西氏貝蛔蟲(chóng)感染的檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種操作簡(jiǎn)單，快速、敏感的檢測(cè)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的酶聯(lián)免 疫試劑盒。
[0006] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)解決方案是，一種檢測(cè)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的酶聯(lián)免疫試劑盒包 括：
[0007] 所述試劑盒中含有包被重組抗原構(gòu)成的酶標(biāo)板，酶標(biāo)二抗，小鼠陰性對(duì)照血清，感 染西氏貝蛔蟲(chóng)小鼠陽(yáng)性對(duì)照血清，底物溶液，洗滌液，其中，所述包被重組抗原為重組蛋白 rBs-GST-1 ;所述酶標(biāo)二抗為羊抗鼠-HRP二抗，以上液體均分裝在試劑盒中。
[0008] 所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，所述重組蛋白rBs-GST-1是通過(guò)克隆、表達(dá)大熊貓西氏 貝蛔蟲(chóng)的Bs-GST-I蛋白而獲得的重組rBs-GST-1蛋白。
[0009] 所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，所述重組蛋白rBs-GST-1能與西氏貝蛔蟲(chóng)感染的小鼠陽(yáng) 性血清發(fā)生免疫反應(yīng),具有反應(yīng)源性。
[0010] 進(jìn)一步的所述酶聯(lián)免疫試劑盒，所述重組抗原的包被稀釋度達(dá)到1:12800時(shí)，OD45tl 值顯著。
[0011] 進(jìn)一步的所述酶聯(lián)免疫試劑盒，所述對(duì)照陽(yáng)性血清稀釋度達(dá)到1:12800,抗原包被 稀釋度為1:12800時(shí)，OD 45tl值顯著。
[0012] 更進(jìn)一步的所述酶聯(lián)免疫試劑盒，所述酶標(biāo)二抗，其在50min時(shí)，稀釋度1:3000時(shí) OD 45tl 為 0.987,且 P/N 值最大。
[0013] 更進(jìn)一步的所述酶聯(lián)免疫試劑盒，上述的重組蛋白rBs-GST-1按照以下方法制 備，步驟包括：
[0014] (I)Bs-GST-I基因的擴(kuò)增：采用高通量測(cè)序技術(shù)獲得的西氏貝蛔蟲(chóng)基因組和發(fā)育 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定和篩選出編碼Bs-GST-I的轉(zhuǎn)錄本，然后以此為模板利用Primer 5. 0軟件 設(shè)計(jì)特異性PCR擴(kuò)增引物：
[0015] 上游引物：5' -AAGCAACATGCCGCAGTACAAG-3' ；
[0016] 下游引物：5' -CACAAAAAACAGAATAGACCCTAATA-3' ；
[0017] 經(jīng)PCR擴(kuò)增出Bs-GST-I基因，測(cè)序得到長(zhǎng)647bp片段序列，其ORF框長(zhǎng)為621bp ;
[0018] (2)利用DNAStar軟件分析出表達(dá)序列蛋白分子量是22. 65915kDa，理論等電點(diǎn)pi 為 7. 449 ;
[0019] (3)氨基酸序列分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：利用DNAStar軟件對(duì)西氏貝蛔蟲(chóng)GST-I蛋白進(jìn)行 氨基酸序列分析，編碼為199個(gè)氨基酸；其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
[0020] (4)GST_1基因的克隆載體構(gòu)建：設(shè)計(jì)加酶切位點(diǎn)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出約600bp 大小的片段；
[0021] (5)重組質(zhì)粒的酶切；通過(guò)設(shè)計(jì)的兩個(gè)酶切位點(diǎn)引物對(duì)重組質(zhì)粒PMD19-T-GST-1 進(jìn)行提??；
[0022] (6)表達(dá)載體的構(gòu)建；將上述質(zhì)粒通過(guò)膠回收后與原核表達(dá)載體pET_32a(+)連 接，構(gòu)建pET32a (+)-GST-I重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21中，經(jīng)單菌落PCR鑒定與測(cè) 序，并擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，再次雙酶切鑒定，從而確定表達(dá)載體構(gòu)建成功；
[0023] (7)表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-Bs-GST-I誘導(dǎo)表達(dá)；經(jīng)過(guò)表達(dá)條件優(yōu)化，重組蛋白的純 化，誘導(dǎo)表達(dá)的菌體經(jīng)超聲波破碎儀破碎后，經(jīng)SDS-PAGE鑒定pET32a (+) -Bs-GST-I表達(dá)蛋 白以包涵體形式存在，得到重組蛋白rBs-GST-1。
[0024] 本發(fā)明利用間接ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，以西氏貝蛔蟲(chóng)重組蛋白rBs-GST-1為 抗原檢測(cè)抗體，檢測(cè)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)；使用方法步驟如下：
[0025] 1)將稀釋成1:12800待檢血清分別加入到包被有rBs-GST-1蛋白包的96孔酶 標(biāo)板中，37°C孵育Ih;再用PBS-T洗滌3次，每次5min，拋干，加入PBS(0. 01M，pH 7. 4)稀 釋的山羊抗小鼠HRP偶聯(lián)IgG(l :3000)酶標(biāo)二抗，IOOii L/孔，37°C孵育Ih ;PBS-T洗滌， 51^11\3次，拋干，加入11^底物溶液顯色，1001117孔，371：作用15111111;加入1001^終止 液（2M H2S04)終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。
[0026] 2)陽(yáng)性血清臨界值的確定：X+3SD，其中X是標(biāo)準(zhǔn)陰性血清OD45tl值平均值，SD是其 標(biāo)準(zhǔn)偏差；經(jīng)計(jì)算陽(yáng)性血臨界值為0. 098355。
[0027] 3)結(jié)果判定：陽(yáng)性：0D45Q 彡 0? 098355 ;陰性：0D45Q〈0. 098355。
[0028] 術(shù)語(yǔ)解釋?zhuān)?br> [0029] rBs-GST-1 :重組蛋白。通過(guò)克隆、表達(dá)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的Bs-GST-I蛋白而獲得 的重組rBs-GST-1蛋白。
[0030] ELISA:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒。是酶聯(lián)免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用最廣的 技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使 酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的ELISA 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測(cè)大分子抗原，后者用于測(cè)定 特異抗體。
[0031] GSTs :谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathione transferases ;)是由多個(gè)基因編碼，在機(jī) 體生物轉(zhuǎn)化、免疫等防御系統(tǒng)中具有解毒和抗氧化等多重功能的超家族蛋白酶。GSTs廣泛 存在于各種生物體內(nèi)的各種組織細(xì)胞中，與細(xì)胞損傷、缺氧、中毒、衰老等多種疾病過(guò)程的 發(fā)生有關(guān)。其催化還原型谷胱甘肽（GSH)結(jié)合到許多外源或內(nèi)源的毒物上，尚可作為無(wú)催 化活性的結(jié)合蛋白，為很多疏水基團(tuán)解毒。目前對(duì)于寄生蟲(chóng)GST-I蛋白研究較豐富，主要從 作為保護(hù)性抗原、GST-I結(jié)構(gòu)、功能及免疫診斷等角度進(jìn)行的研究。
[0032] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較具有如下積極效果：
[0033] 1、利用所述重組蛋白rBs-GST-1作為抗原建立的ELISA方法具有較高的靈敏性和 特異性，開(kāi)發(fā)和形成了大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)檢測(cè)ELISA試劑盒。
[0034] 2、利用所述重組蛋白建立的ELISA方法臨床檢測(cè)出43份陽(yáng)性測(cè)試血清表明，其檢 測(cè)率達(dá)79%以上，其特異性為82%。
[0035] 3、重組Bs-GST-I蛋白的Western-blot結(jié)果表明，rBs-GST-1具有良好的免疫原 性和反應(yīng)原性，能夠有效地識(shí)別抗西氏貝蛔蟲(chóng)免疫血清。從而為有效的防控大熊貓西氏貝 蛔蟲(chóng)及該病的免疫學(xué)診斷奠定了理論基礎(chǔ)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1為本發(fā)明所述GST-I克隆質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳圖。
[0037] 圖2為本發(fā)明所述GST-I信號(hào)位點(diǎn)分布圖。
[0038] 圖3為本發(fā)明所述GST-I蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)示意圖。
[0039] 圖4為本發(fā)明所述加入酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物電泳圖。
[0040] 圖5為本發(fā)明所述重組質(zhì)粒pMD19-T-GST-l酶切結(jié)果電泳圖。
[0041] 圖6為本發(fā)明所述表達(dá)載體pET32a(+)-GST-l酶切結(jié)果電泳圖。
[0042] 圖7重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物即誘導(dǎo)表達(dá)的pET-32a(+)-Bs-GST_l的菌體電泳圖。
[0043] 圖8為本發(fā)明所述經(jīng)Ni柱純化，SDS-PAGE電泳后的洗脫峰電泳圖。
[0044] 圖9所述蛋白與西氏貝蛔蟲(chóng)感染小鼠陽(yáng)性血清發(fā)生免疫反應(yīng)的免疫印跡圖。

【具體實(shí)施方式】
[0045] 結(jié)合附圖及試驗(yàn)例、實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步具體說(shuō)明。
[0046] 本發(fā)明的檢測(cè)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的酶聯(lián)免疫試劑盒包括：試劑盒中含有包被重 組抗原構(gòu)成的酶標(biāo)板，酶標(biāo)二抗，小鼠陰性對(duì)照血清，感染西氏貝蛔蟲(chóng)小鼠陽(yáng)性對(duì)照血清， 底物溶液，洗滌液，其中，所述包被重組抗原為重組蛋白rBs-GST-1 ;所述酶標(biāo)二抗為羊抗 鼠-HRP二抗，以上液體均分裝在試劑盒中。
[0047] 所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，所述重組蛋白rBs-GST-1是通過(guò)克隆、表達(dá)大熊貓西氏 貝蛔蟲(chóng)的Bs-GST-I蛋白而獲得的重組rBs-GST-1蛋白。
[0048] 所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，所述重組蛋白rBs-GST-1能與西氏貝蛔蟲(chóng)感染的小鼠陽(yáng) 性血清發(fā)生免疫反應(yīng),具有反應(yīng)源性。
[0049] 所述酶聯(lián)免疫試劑盒，所述重組抗原的包被稀釋度達(dá)到1:12800時(shí)，OD45tl值顯著。
[0050] 所述酶聯(lián)免疫試劑盒，所述對(duì)照陽(yáng)性血清稀釋度達(dá)到1:12800,抗原包被稀釋度為 1:12800 時(shí)，OD45tl 值顯著。
[0051] 所述酶聯(lián)免疫試劑盒，所述酶標(biāo)二抗，其在50min時(shí)，稀釋度1:3000時(shí)OD45tl為 0. 987,且P/N值最大。
[0052] 上述說(shuō)明通過(guò)本發(fā)明所做的ELISA檢測(cè)方法的建立試驗(yàn)例1. 2. 11、試驗(yàn)例 1. 2. 10、試驗(yàn)例2. 4. 4、試驗(yàn)例2. 5. 1、試驗(yàn)例2. 5. 2、試驗(yàn)例2. 5. 3、試驗(yàn)例2. 5. 4做進(jìn)一步 描述：
[0053] 試驗(yàn)例I. 2. 11 ELISA檢測(cè)方法的建立
[0054] ①抗原的制備經(jīng)大腸桿菌表達(dá)出的GST-I蛋白純化后，收集GST-I蛋白（跑PAGE 測(cè)定蛋白濃度），使用時(shí)以Tris-HCl緩沖液（pH7. 4)進(jìn)行適當(dāng)稀釋。
[0055] ②詳細(xì)的ELISA操作參見(jiàn)Vlaminck(2012)中所述[95]。稀釋成的10iig/mL 池 8-651'-1蛋白包被于96孔￡1^4板，10〇1117孔，置于41：冰柜孵育14?1611，隨后用 0? 5 % Tween-20 (PBS-T)洗滌 3 次，每次 5min，再加 5 % BSA 進(jìn)行封閉，100 ii L/ 孔，37°C 作 用211屮85-1'洗滌，51^11\3次，加入？85(0.01]\1，？117.4)按 1:2000稀釋小鼠血清，1001117 孔，37°C孵育Ih ;再用PBS-T洗滌3次，每次5min，拋干，加入PBS (0. 01M，pH 7. 4)稀釋的山 羊抗小鼠!11^偶聯(lián)186(1:5000)酶標(biāo)二抗，1001117孔，371：孵育111刊5-1'洗滌，5111111\3 次，拋干，加入TMB底物溶液顯色，100 ii L/孔，37°C作用5?IOmin ;加入100 ii L終止液（2M H2S(M)終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。同時(shí)用西氏貝蛔蟲(chóng)感染鼠的陽(yáng)性 血清作方陣滴定。選擇陽(yáng)性血清與陰性血清OD 45tl的比值（P/N)最大所對(duì)應(yīng)的抗原、抗體稀 釋度作為判定標(biāo)準(zhǔn)。
[0056] 試驗(yàn)例L 2. 10 rBs-GST-1蛋白的免疫原性分析（Western-blot)
[0057] 免疫印跡試驗(yàn)基本如Tsuji等（1998) [94]和Wang等（2008) [17]所述。寄生蟲(chóng) 重組Bs-GST-I蛋白先分別經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)入硝酸纖維膜（NC膜）上，并于 室溫在5% BSA中孵育lh。重組Bs-GST-I蛋白抗原性的檢測(cè)，上述NC膜需要與小鼠抗西 氏貝蛔蟲(chóng)感染血清孵育。經(jīng)一抗孵育后，棄一抗，用TBS-T洗膜，5minX 3次；加入堿性磷酸 酶偶聯(lián)羊抗鼠二抗（按1:200比例用TBS-T稀釋?zhuān)ㄙ?gòu)自ICN Pharmaceuticals公司），室 溫孵育2h ;棄去二抗，用TBS-T洗膜3次，每次5min ;加入顯色液（nitroblue tetrazolium 和 5-brom〇-4-chloro_3-in-dolylphosphate，NBT/BCIP)，避光顯色直至印跡帶出現(xiàn)，然后 放入ddH 20終止顯色反應(yīng)。
[0058] 2. 4. 4融合蛋白Bs-GST-I的免疫原性檢測(cè)
[0059] 純化后的蛋白經(jīng)Western-Blotting檢測(cè)顯示該蛋白可以與西氏貝蛔蟲(chóng)感染的小 鼠陽(yáng)性血清發(fā)生免疫反應(yīng)，具有反應(yīng)源性；參見(jiàn)圖9。
[0060] 2. 5. 1最佳工作條件的摸索
[0061] 2. 5. I. 1抗原最適包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)
[0062] 由方陣梯度法選定抗原包被濃度和血清最佳稀釋度，每組重復(fù)一次，求其平均值 見(jiàn)表1。根據(jù)表中分析抗原稀釋度1:400、血清稀釋度1:400的條件下OD45tl大于1，P/N值 最大，確定為抗原和血清的最適包被稀釋度。且通過(guò)表1分析知當(dāng)陽(yáng)性血清稀釋倍數(shù)達(dá)到 1:12800,抗原包被稀釋度為1:12800時(shí)，OD45tl值顯著。這也暗示著該方法靈敏度高。
[0063] 表1抗原最適工作濃度和血清最適稀釋度測(cè)定的平均OD45tl [0064]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中含有包 被重組抗原構(gòu)成的酶標(biāo)板，酶標(biāo)二抗，小鼠陰性對(duì)照血清，感染西氏貝蛔蟲(chóng)小鼠陽(yáng)性對(duì)照血 清，底物溶液，洗滌液；其中，所述包被重組抗原為重組蛋白rBs-GST-1，所述酶標(biāo)二抗為羊 抗鼠-HRP二抗，以上液體均分裝在試劑盒中。
2. 根據(jù)權(quán)利1所述的一種檢測(cè)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所 述重組蛋白rBs-GST-1是通過(guò)克隆、表達(dá)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的Bs-GST-1蛋白而獲得的重組 蛋白 rBs-GST-1。
3. 根據(jù)權(quán)利1或2所述的一種檢測(cè)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于， 所述重組蛋白rBs-GST-1能與西氏貝蛔蟲(chóng)感染的小鼠陽(yáng)性血清發(fā)生免疫反應(yīng)，具有反應(yīng)源 性。
4. 根據(jù)權(quán)利1所述的一種檢測(cè)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所 述重組抗原的包被稀釋度達(dá)到1:12800時(shí)，(》45(|值顯著。
5. 根據(jù)權(quán)利1所述的一種檢測(cè)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所 述對(duì)照陽(yáng)性血清稀釋度達(dá)到1:12800,抗原包被稀釋度為1:12800時(shí)，0045(|值顯著。
6. 根據(jù)權(quán)利1所述的一種檢測(cè)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所 述酶標(biāo)二抗，其在50min時(shí)，稀釋度1:3000時(shí)OD45(l為0. 987,且P/N值最大。
7. 根據(jù)權(quán)利1或2所述的一種檢測(cè)大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于， 所述重組蛋白rBs-GST-1按照以下方法制備，步驟包括： (1) Bs-GST-1基因的擴(kuò)增：采用高通量測(cè)序技術(shù)獲得的西氏貝蛔蟲(chóng)基因組和發(fā)育轉(zhuǎn)錄 組數(shù)據(jù)，鑒定和篩選出編碼Bs-GST-1的轉(zhuǎn)錄本，然后以此為模板利用Primer 5.0軟件設(shè) 計(jì)特異性PCR擴(kuò)增引物： 上游引物：5 ' -AAGCAACATGCCGCAGTACAAG-3 ' ； 下游引物：5' -CACAAAAAACAGAATAGACCCTAATA-3' ； 經(jīng)PCR擴(kuò)增出Bs-GST-1基因；測(cè)序得到長(zhǎng)647bp片段序列，其ORF框長(zhǎng)為621bp ; (2) 利用DNAStar軟件分析出表達(dá)序列蛋白分子量是22. 65915kDa，理論等電點(diǎn)pi為 7. 449 ； (3) 氨基酸序列分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：利用DNAStar軟件對(duì)西氏貝蛔蟲(chóng)GST-1蛋白進(jìn)行氨基 酸序列分析，編碼為199個(gè)氨基酸；其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示； (4) GST-1基因的克隆載體構(gòu)建：設(shè)計(jì)加酶切位點(diǎn)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出約600bp大小 的片段； (5) 重組質(zhì)粒的酶切；通過(guò)設(shè)計(jì)的兩個(gè)酶切位點(diǎn)引物對(duì)重組質(zhì)粒pMD19-T-GST-l進(jìn)行 提?。? (6) 表達(dá)載體的構(gòu)建；將上述質(zhì)粒通過(guò)膠回收后與原核表達(dá)載體pET-32a(+)連接，構(gòu) 建pET32a (+) -GST-1重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21中，經(jīng)單菌落PCR鑒定與測(cè)序，并擴(kuò) 大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，再次雙酶切鑒定，從而確定表達(dá)載體構(gòu)建成功； (7) 表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-Bs-GST-l誘導(dǎo)表達(dá)；經(jīng)過(guò)表達(dá)條件優(yōu)化，重組蛋白的純化，誘 導(dǎo)表達(dá)的菌體經(jīng)超聲波破碎儀破碎后，經(jīng)SDS-PAGE鑒定pET32a(+)-Bs-GST-l表達(dá)蛋白以 包涵體形式存在，得到重組蛋白rBs-GST-1。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104374923SQ201410709071
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】楊光友, 謝躍, 古小彬, 汪濤, 賴(lài)為民, 彭雪蓉 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)