肽基精氨酸脫亞胺酶1在制備腫瘤臨床診斷試劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了肽基精氨酸脫亞胺酶1在制備診斷腫瘤的臨床診斷試劑或檢測(cè)物中的應(yīng)用，所述腫瘤選自子宮癌、肝癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、肺癌。具體應(yīng)用時(shí)，以常規(guī)方法制備抗肽基精氨酸脫亞胺酶1抗體，建立檢測(cè)肽基精氨酸脫亞胺酶1的定性或定量方法及配套試劑盒。本發(fā)明還公開了一種診斷腫瘤的血液診斷試劑，包括肽基精氨酸脫亞胺酶1抗體、HRP-IgG抗體，以及血液診斷試劑中的常規(guī)試劑。所述血液診斷試劑中的常規(guī)試劑包括碳酸鹽緩沖液、PBST洗液、封閉液、顯色液和終止液。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)PAD1可以作為腫瘤血液標(biāo)志物進(jìn)行應(yīng)用，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，PAD1作為腫瘤標(biāo)志物具有可行性。
【專利說明】肽基精氨酸脫亞胺酶1在制備腫瘤臨床診斷試劑中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及肽基精氨酸脫亞胺酶1作為腫瘤血液標(biāo)志物在制備腫瘤臨床血液診 斷試劑中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 肽基精氨酸脫亞胺酶（Peptidylarginine deiminase, PAD或PADI)是在人體組 織中一種酶，目前，共發(fā)現(xiàn)了五種PAD酶（即PAD/PADI1、2、3、4和6)。這些酶由坐落在人 類染色體lp36區(qū)域上的一簇基因所編碼，并具有不同的組織分布。它可以在鈣離子存在 的情況下對(duì)其它一些組織蛋白進(jìn)行后翻譯修飾（post-translational modification)。這 個(gè)酶可將多肽鏈中的精氨酸（arginine)的氨基催化成羰基，從而使精氨酸轉(zhuǎn)化成瓜氨酸 (citrulline)。瓜氨酸是一個(gè)非自然氨基酸。這個(gè)由PAD催化的多肽中精氨酸轉(zhuǎn)化成瓜氨 酸的過程被稱做瓜氨酸化（citrullination)。蛋白發(fā)生瓜氨酸化后由于結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo) 致其酶活性、代謝活性、調(diào)節(jié)功能和結(jié)構(gòu)功能均發(fā)生改變。因此，瓜氨酸化是和磷酸化、乙酰 化、糖基化、甲基化、泛素化一樣重要的蛋白翻譯后修飾方式。
[0003] 近年來，通過免疫學(xué)、細(xì)胞生物化學(xué)和分子遺傳學(xué)的研究，PAD4(肽基精氨酸脫亞 胺酶4, Peptidylarginine deiminase 4,或PADI4)被證明在人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過 程中起著非常重要的作用，且可作為腺癌標(biāo)志物，在制備腺癌臨床診斷試劑中進(jìn)行應(yīng)用。 PADl (肽基精氨酸脫亞胺酶 1，Peptidylarginine deiminase 1，或 PADI1)和 PAD4 雖然同 為肽基精氨酸脫亞胺酶，但具有不同的組織分布，目前并未有關(guān)于PADl作為腫瘤血液標(biāo)志 物的相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明通過研究得到了一種新的腫瘤血液標(biāo)志物一肽基精 氨酸脫亞胺酶I (PAD1/PADI1)，可用于腫瘤的臨床診斷。
[0005] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)研究首次發(fā)現(xiàn)，與良性腫瘤患者血清、慢性炎癥患者血清和正常 人血清相比，PADl在肝癌、結(jié)/直腸癌、乳腺癌、食管及賁門癌等惡性腫瘤患者血清中的表 達(dá)水平明顯增高。PADl能同時(shí)在多種惡性腫瘤患者血清中表達(dá)，這在目前使用的腫瘤標(biāo) 記物中是比較少的（目前腫瘤血液標(biāo)記物敏感性和特異性不理想，臨床現(xiàn)有腫瘤血清標(biāo)記 物達(dá)20余種，但絕大多數(shù)往往只能用于檢測(cè)一種腫瘤，敏感性和特異性差，通常只能采用 聯(lián)合檢測(cè)才能為臨床診斷提供有意義的數(shù)據(jù)）。本發(fā)明將PADl在血液中的表達(dá)水平與已 知腫瘤標(biāo)記物水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)PADl腫瘤檢測(cè)陽性率和特異性不亞于CEA，廣譜性高于 CA125、CA199、PSA、CA242 等。
[0007] 基于以上發(fā)現(xiàn)，PADl作為腫瘤血清標(biāo)記物應(yīng)用具有更高的特異性，為此，本發(fā)明研 發(fā)了診斷范圍廣、敏感性強(qiáng)、特異性高的腫瘤診斷試劑盒及檢測(cè)方法，可廣泛用于臨床腫瘤 初步調(diào)查和健康普查，為臨床診斷提供可靠依據(jù)。
[0008] 具體地，以常規(guī)方法制備抗肽基精氨酸脫亞胺酶1抗體，建立檢測(cè)肽基精氨酸脫 亞胺酶1的定性或定量方法及配套試劑盒。
[0009] -種診斷腫瘤的血液診斷試劑，包括肽基精氨酸脫亞胺酶1抗體、HRP-IgG抗體， 以及血液診斷試劑中的常規(guī)試劑。
[0010] 所述血液診斷試劑中的常規(guī)試劑包括碳酸鹽緩沖液、PBST洗液、封閉液、顯色液和 終止液。
[0011] 進(jìn)一步地，定性的檢測(cè)方法為間接ELISA方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗 人免疫球蛋白抗體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，具體方式如下：
[0012] (1)將待檢測(cè)血樣用碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)稀釋10倍后，加至空白酶標(biāo)板中，37°C 溫育2h ;
[0013] ⑵棄去孔內(nèi)液體，PBST洗液洗板三次（所述PBST洗液是指PBS溶液加上 Tween-20, PBS溶液的pH為7. 4, Tween-20的濃度為0? 1 %，體積百分?jǐn)?shù)）；
[0014] (3)每孔加封閉液（0? 5% BSA，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)）200ii L/孔，37°C溫育Ih ;
[0015] (4)棄去孔內(nèi)液體，PBST洗液洗板三次；
[0016] (5)每組加PADl抗體稀釋液（1:2000稀釋）IOOii L/孔，37°C溫育Ih ;
[0017] (6)棄去孔內(nèi)液體，PBST洗液洗板三次；
[0018] (7)每孔加 HRP-IgG 抗體稀釋液（1:3000 稀釋）100ii L，37°C溫育 Ih ;
[0019] (8)棄去孔內(nèi)液體，PBST洗液洗板五次；
[0020] (9)每孔加顯色液A、B【顯色劑A (含過氧化氫）為供氫體（DH2)，底物B就是顯 色劑B (含TMB，3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺）】各50 ii L，37°C顯色lOmin。
[0021] (10)每孔加50 i! L終止液（2M H2SO4溶液）終止顯色，振勻，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD45tol值；
[0022] (11)計(jì)算：以陰性血清（正常人血清）為對(duì)照，檢測(cè)陰性血清OD45tlnm均值（是以 多份陰性血清為對(duì)照檢測(cè)出來再平均的值）；將OD45tlnm值代入公式P/N值=待測(cè)血樣OD45tol值/陰性血清OD45tlnm均值，計(jì)算得到待檢測(cè)血樣的P/N值；
[0023] (12)判斷：若待檢測(cè)血樣的P/N值大于或等于2. 1，則該待檢測(cè)血樣的檢測(cè)結(jié)果為 陽性，該待檢測(cè)血樣所屬的患者有可能患有腫瘤，可作為臨床診斷的依據(jù)之一。
[0024] 上述所涉及的抗體，為通過常規(guī)方法制備得到。上述所涉及的各種試劑，均為現(xiàn)有 技術(shù)中已有的常規(guī)試劑。
[0025] 同理，進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，也采用上述檢測(cè)原理，配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，然后繪制 標(biāo)準(zhǔn)品濃度與OD45tlnm值或OD63tol值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到線性回歸方程，然后將待檢測(cè)血樣的 OD45tol值或OD63tol值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣品中的濃度。
[0026] 進(jìn)一步地，定量檢測(cè)時(shí)，采用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)PAD1，步驟如下：
[0027] (1)包被：將PADl單克隆抗體1用包被液（pH9. 6的碳酸鹽緩沖液）稀釋成I ii g/ mL，加至空白酶標(biāo)板中，100 ii L/孔，4°C飽和濕度下放置過夜；
[0028] (2)洗板：棄去孔內(nèi)液體，每孔加入PBST洗液300 ii L (所述PBST洗液是指PBS溶 液加上Tween-20, PBS溶液的pH為7. 4, Tween-20的濃度0? 1 %，體積百分?jǐn)?shù)），浸泡15秒， 甩棄液體。連續(xù)洗板三次；
[0029] (3)封閉：每孔加封閉液（0? 5% BSA，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)）200ii L/孔，37°C溫育Ih ;
[0030] (4)洗板三次，同步驟⑵；
[0031] (5)設(shè)定：留一孔作空白對(duì)照，暫不加任何液體；另設(shè)PADl標(biāo)準(zhǔn)品7孔，各加 100 y L標(biāo)準(zhǔn)品；
[0032] (6)加樣：將待檢測(cè)血樣用PBST稀釋10倍后，按順序加至反應(yīng)孔中，室溫孵育 I. 5h ；
[0033] (7)洗板三次，同步驟（2);
[0034] (8)加酶：每個(gè)孔加入100 ii LHRP標(biāo)記的PADl單克隆抗體稀釋液（1/3000)(不包 括空白對(duì)照），室溫孵育45min ;
[0035] (9)洗板三次，同步驟（2);
[0036] (10)顯色：每孔依次加入顯色液A、B【顯色劑A(含過氧化氫）為供氫體（DH2)， 底物B就是顯色劑B (含TMB，3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺）】各50 ii L (包括空白對(duì)照），震蕩 混勻，室溫避光顯色10分鐘；
[0037] (11)終止：每孔加入終止液各50 ii L (包括空白對(duì)照），震湯混勾終止反應(yīng)；
[0038] (12)測(cè)定：用空白對(duì)照孔調(diào)零，并于30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)450nm測(cè)定各孔OD 值；也可用雙波長(zhǎng)450nm/630nm測(cè)定各孔OD值；
[0039] (13)計(jì)算：以系列標(biāo)準(zhǔn)品濃度值的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（X軸），以標(biāo)準(zhǔn)品OD值的對(duì)數(shù) 值為縱坐標(biāo)（Y軸），建立（log-log)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣本的PADl含量。
[0040] 另外，定性的檢測(cè)方法也可為膠體金法，其檢測(cè)原理為：采用雙抗體夾心法和膠體 金免疫技術(shù)，在膠體金墊上預(yù)加入抗PADl抗體膠體金結(jié)合物，在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線和 對(duì)照線上分別包被有抗PADl抗體。當(dāng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，如為陽性樣本，樣本中的PADl可與金標(biāo) 抗PADl抗體結(jié)合形成復(fù)合物，由于層析作用復(fù)合物沿試紙向前移動(dòng)，再與檢測(cè)線預(yù)包被的 抗體結(jié)合形成"金標(biāo)抗體-PADl-抗體"復(fù)合物而凝集顯色。硝酸纖維膜上同時(shí)包被有一條 質(zhì)控線作為對(duì)照，故當(dāng)出現(xiàn)一條紅色質(zhì)控線和一條紅色反應(yīng)線時(shí)判為陽性。當(dāng)待檢標(biāo)本中 無PADl抗原時(shí)，只出現(xiàn)一條紅色質(zhì)控線判為陰性。作為質(zhì)控，不管結(jié)果為陽性或陰性，都會(huì) 出現(xiàn)一條紅色質(zhì)控線。若無紅線（或只有反應(yīng)線）出現(xiàn)，則檢測(cè)無效。具體的檢測(cè)方法為：
[0041] (1)用潔凈的容器收集少量樣本（血清樣本按常規(guī)方法靜脈采集；采集的樣本在 五天內(nèi)檢測(cè)，需放置4°C保存，五天以上需放置-20°C保存，避免反復(fù)凍融；如果樣本出現(xiàn)渾 濁或沉淀，應(yīng)離心或過濾澄清后再檢測(cè)）；打開內(nèi)包裝，取出檢測(cè)試紙。
[0042] (2)依據(jù)產(chǎn)品型號(hào)進(jìn)行操作：
[0043] ①檢測(cè)條：將檢測(cè)條標(biāo)有MX字樣的一端浸入樣本中30秒（注意：液面不要沒過 MAX線）取出平放于臺(tái)面上。
[0044] ②檢測(cè)卡：在檢測(cè)卡標(biāo)有"S"字樣的加樣孔中，用滴管滴加4滴樣本（約100 ill)。
[0045] (3)待檢測(cè)條質(zhì)控線（C線）出現(xiàn)后計(jì)時(shí)，20分鐘內(nèi)觀察結(jié)果，20分鐘以后觀察結(jié) 果無效。
[0046] 檢驗(yàn)結(jié)果的解釋：
[0047] ⑴陰性結(jié)果：僅出現(xiàn)質(zhì)控線（C線）。
[0048] (2)陽性結(jié)果：出現(xiàn)兩條線，即質(zhì)控線（C線）和檢測(cè)線（T線）。
[0049] (3)無效結(jié)果：無線出現(xiàn)，或僅出現(xiàn)檢測(cè)線（T線），須重新檢測(cè)。
[0050] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)PADl可在子宮癌、肝癌、胃癌、食管癌、肺癌和卵巢癌等多種惡性 腫瘤的細(xì)胞中以及血液中高表達(dá)，因此，PADl可以作為腫瘤血液標(biāo)志物進(jìn)行應(yīng)用，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證 明，其特異性不亞于CEA，廣譜性高于CA242、CA125、PSA、CA199等。盡管PADl在多種腫瘤中 表達(dá)，達(dá)不到絕對(duì)的特異性，但是，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員公知，臨床檢測(cè)指標(biāo)的特異性的非絕 對(duì)唯一并不能否定檢測(cè)指標(biāo)作為診斷相關(guān)疾病的手段之一的可行性，例如醫(yī)生經(jīng)常將幾種 檢測(cè)指標(biāo)結(jié)合臨床表現(xiàn)作出最后診斷。因此，PADl作為腫瘤標(biāo)志物具有可行性；盡管PADl 具有非唯一的特異性，但將PADl作為腫瘤血液標(biāo)志物結(jié)合其它檢測(cè)指標(biāo)及臨床表現(xiàn)也足 以用于檢測(cè)腫瘤（這種方式也是目前臨床上的常見方式）。另外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，PADl還可 作為血液標(biāo)志物應(yīng)用于炎癥等其他疾病的檢測(cè)，如乙肝、普通炎癥（具有白細(xì)胞、中性粒細(xì) 胞增多，淋巴細(xì)胞比率降低的癥狀）、腎?。òI病綜合征、腎衰竭、腎炎）、尿毒癥（包括 尿毒癥和尿路感染），也可作為炎癥等其它疾病的臨床診斷依據(jù)之一。

【具體實(shí)施方式】
[0051] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0052] 下述實(shí)施例中所涉及的試劑、方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)試 劑、方法。
[0053] 實(shí)施例I PADl作為腫瘤血液標(biāo)志物的檢測(cè)實(shí)例1
[0054] 以PADl作為腫瘤血液標(biāo)志物，對(duì)腫瘤患者的血液進(jìn)行檢測(cè)，腫瘤患者的例數(shù)以及 所患腫瘤的種類詳見表1。
[0055] 檢測(cè)方法為：
[0056] (1)將待檢測(cè)血樣用碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)稀釋10倍后，加至空白酶標(biāo)板中，37°C 溫育2h ;
[0057] (2)棄去孔內(nèi)液體，PBST洗液洗板三次（所述PBST洗液是指PBS溶液加上 Tween-20, PBS溶液的pH為7. 4, Tween-20的濃度為0? 1 %，體積百分?jǐn)?shù)）；
[0058] (3)每孔加封閉液（0? 5% BSA，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)）200ii L/孔，37°C溫育Ih ;
[0059] (4)棄去孔內(nèi)液體，PBST洗液洗板三次；
[0060] (5)每組加PADl抗體稀釋液（1:2000稀釋）100 ii L/孔，37°C溫育Ih ;
[0061] (6)棄去孔內(nèi)液體，PBST洗液洗板三次；
[0062] (7)每孔加 HRP-IgG 抗體稀釋液（1:3000 稀釋）100 ii L，37°C溫育 Ih ;
[0063] (8)棄去孔內(nèi)液體，PBST洗液洗板五次；
[0064] (9)每孔加顯色液A、B【顯色劑A (含過氧化氫）為供氫體（DH2)，底物B就是顯 色劑B (含TMB，3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺）】各50 ii L，37°C顯色lOmin。
[0065] (10)每孔加50 ii L終止液（2M H2SO4溶液）終止顯色，振勻，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD45tlnm 值；
[0066] (11)計(jì)算：以陰性血清（正常人血清）為對(duì)照，檢測(cè)陰性血清OD45tlnm均值（是以 多份陰性血清為對(duì)照檢測(cè)出來再平均的值）；將OD45tlnm值代入公式P/N值=待測(cè)血樣OD45tol值/陰性血清OD45tlnm均值，計(jì)算得到待檢測(cè)血樣的P/N值；
[0067] (12)判斷：若待檢測(cè)血樣的P/N值大于或等于2. 1，則該待檢測(cè)血樣的檢測(cè)結(jié)果為 陽性。
[0068] 結(jié)果：陽性例數(shù)及陽性率見表1，其它腫瘤標(biāo)志物的陽性率見表2(為現(xiàn)有技術(shù)中 能公開的數(shù)據(jù)），通過表1、表2可以看出，PADl作為腫瘤血液標(biāo)志物，具有良好的特異性， 廣譜性。

【權(quán)利要求】
1. 肽基精氨酸脫亞胺酶1在制備診斷腫瘤的臨床診斷試劑或檢測(cè)物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述腫瘤選自子宮癌、肝癌、胃癌、食管 癌、卵巢癌、肺癌。
3. 肽基精氨酸脫亞胺酶1在制備診斷炎癥的臨床診斷試劑或檢測(cè)物中的應(yīng)用，所述炎 癥選自乙肝、普通炎癥、腎病、尿毒癥。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的應(yīng)用，其特征在于：以常規(guī)方法制備抗肽基精氨酸 脫亞胺酶1抗體，建立檢測(cè)肽基精氨酸脫亞胺酶1的定性或定量方法及配套試劑盒。
5. -種診斷腫瘤的血液診斷試劑，其特征在于：包括肽基精氨酸脫亞胺酶1抗體、 HRP-IgG抗體，以及血液診斷試劑中的常規(guī)試劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的診斷腫瘤的血液診斷試劑，其特征在于：所述腫瘤選自子宮 癌、肝癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、肺癌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的診斷腫瘤的血液診斷試劑，其特征在于：所述血液診斷 試劑中的常規(guī)試劑包括碳酸鹽緩沖液、PBST洗液、封閉液、顯色液和終止液。
8. -種診斷炎癥的血液診斷試劑，其特征在于：包括肽基精氨酸脫亞胺酶1抗體、 HRP-IgG抗體，以及血液診斷試劑中的常規(guī)試劑；所述炎癥選自乙肝、普通炎癥、腎病、尿毒 癥。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的診斷炎癥的血液診斷試劑，其特征在于：所述血液診斷試劑 中的常規(guī)試劑包括碳酸鹽緩沖液、PBST洗液、封閉液、顯色液和終止液。
【文檔編號(hào)】G01N33/573GK104360062SQ201410714949
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】常曉天, 邢艷秋, 馬芳, 楊冬霞 申請(qǐng)人:山東創(chuàng)新藥物研發(fā)有限公司