專利名稱：：谷氨酰胺合成酶活性的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于抑制谷氨酰胺合成酶活性的物質(zhì)和方法，更具體地涉及通過(guò)氨對(duì)Y-谷氨酰酶?；虚g體進(jìn)行親核進(jìn)攻的假設(shè)機(jī)理來(lái)抑制谷氨酰胺合成酶形成谷氨酰胺的第二催化反應(yīng)的物質(zhì)和方法，以及涉及用于設(shè)計(jì)和使用該抑制劑的物質(zhì)和方法。
背景技術(shù)：
：谷氨酰胺合成酶(GS，EC6.3丄2)是參與氮代謝并催化L-谷氨酸、ATP和氨可逆轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-谷氨酰胺、ADP和無(wú)機(jī)磷酸的核心酶。該反應(yīng)通過(guò)，谷氨酰磷酸中間體調(diào)節(jié)。該酶的每個(gè)亞基需要至少兩個(gè)二價(jià)金屬離子(Me2+);本文中，二價(jià)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)被稱為nl和n2。GS通過(guò)如下反應(yīng)催化谷氨酸生物合成為谷氨酰胺Me2+谷氨酸+NH4++ATP—谷氨酰胺+ADP+Pi+H20其中，M^+代表選自鎂或錳的二價(jià)金屬陽(yáng)離子。該反應(yīng)經(jīng)常被稱為"生物合成"反應(yīng)或"正"反應(yīng)，并且認(rèn)為與谷氨酰胺合成酶催化的反應(yīng)在生理學(xué)上最為相關(guān)。，谷氨酰磷酸是通過(guò)ATP的，磷酸轉(zhuǎn)移到谷氨酸的，羧基而形成的。磷?；谶@兩種負(fù)電基團(tuán)之間的有效轉(zhuǎn)移通過(guò)n2金屬配位來(lái)實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)已接受的機(jī)理假設(shè)認(rèn)為在此之后，通過(guò)氨置換磷酸以得到無(wú)機(jī)磷酸和谷氨酰胺ATP+谷氨酸—ADP+"谷氨酸-P八0+"谷氨酸^+1^114+—ADP+谷氨酰胺+&。在結(jié)構(gòu)上，來(lái)自大腸桿菌(五sc^r/c/n'flco//)的GS酶是大分子金屬酶(-600,000Mr)，具有12個(gè)相同的亞基，這些亞基排列在兩個(gè)面對(duì)面的六角環(huán)形內(nèi)，兩個(gè)單體間形成兩個(gè)活性位點(diǎn)，總計(jì)12個(gè)活性位點(diǎn)?？蓪⒚總€(gè)活性位點(diǎn)描繪成"雙漏斗"，其中ATP與谷氨酸分別結(jié)合在相對(duì)的末端。因?yàn)锳TP結(jié)合位點(diǎn)向谷氨酰胺合成酶分子的六個(gè)外表面(externalsixfoldsurface)敞開(kāi)，所以它被稱為雙漏斗的頂部。在雙漏斗的連接處發(fā)現(xiàn)兩個(gè)二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)nl和n2。n2離子參與磷酰基的轉(zhuǎn)移，而nl離子使谷氨酰胺合成酶保持在其活性形式并對(duì)谷氨酸的結(jié)合發(fā)揮作用。朝向nl附近雙漏斗下半部的較大負(fù)電荷使得nl位點(diǎn)處對(duì)金屬離子的親合力比n2位點(diǎn)處大50倍。nl金屬離子有三個(gè)谷氨酸殘基側(cè)鏈131、212和220作為配體，而n2金屬離子有兩個(gè)谷氨酸殘基配體129和357，以及組氨酸269(Abell，LM，JSchineller,PJKeck和JVillafranca(1995)Biochemistry34:16695-16702)。作為金屬離子配體的氨基酸在各種來(lái)源的谷氨酰胺合成酶中高度保守(PesoleG，MPBozzetti，CLanave，GPreparata禾口CSaccone(1991)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,USA88:522-526)。(除非另外特殊說(shuō)明，本文鑒定的所有的GS氨基酸殘基數(shù)是指大腸桿菌co//)GS的殘基。如果給出細(xì)菌GS多肽序列之間的同源性，本領(lǐng)域技術(shù)人員就能利用例如同源性比對(duì)或分子模擬等方法確定其它種的GS所關(guān)注的相應(yīng)殘基。)對(duì)于浸在含有各種配體的溶液中的谷氨酰胺合成酶晶體的構(gòu)象變化與側(cè)鏈移動(dòng)已經(jīng)有所描述(LiawS-H，JJVillafranca和DEisenberg(1993b)Biochemistry33:7999-8003;LiawS腸H和DEisenberg(1994)Biochemistry33:675-681;LiawS-H，GJun和DEisenberg(1994)Biochemistry33:11184-11188)。這些殘基在低級(jí)和高級(jí)生物的谷氨酰胺合成酶中均絕對(duì)保守，并且在生物合成反應(yīng)機(jī)理中發(fā)揮重要作用(EisenbergD,HSGill，GMUPfluegl和SHRotstein(2000)BiochemicaetBiophysicaActa1477:122-145)。Eisenberg(2000)記載的谷氨酰胺合成酶十二聚體的結(jié)構(gòu)被認(rèn)為含有幾個(gè)具有重要功能的環(huán)(EisenbergD，HSGill，GMUPfluegl和SHRotstein(2000)BiochemicaetBiophysicaActa1477:122-145)。這些帶有對(duì)應(yīng)于大腸桿菌殘基的殘基數(shù)的環(huán)如下由親水性殘基156-173組成的環(huán)，其伸入十二聚體的中心通道，并且是蛋白水解和ADP核糖基化的位點(diǎn)。另一已知為腺苷酰化環(huán)的環(huán)，其含有酪氨酸397，通過(guò)加入AMP被共價(jià)修飾。該環(huán)恰好位于雙漏斗底部入口外。.谷氨酸327翼，由殘基323-330構(gòu)成，其保護(hù)谷氨酸進(jìn)入活性位點(diǎn)。該"翼"包圍活性位點(diǎn)，保護(hù)，谷氨酰磷酸中間體不被水解。當(dāng)該翼關(guān)閉時(shí)，谷氨酸327羧酸酯形成部分銨位點(diǎn)。天冬氨酸50'使銨離子去質(zhì)子化形成氨。于是，氨進(jìn)攻，谷氨酰磷酸中間體由此形成過(guò)渡態(tài)的四面體中間體。谷氨酸327翼接受來(lái)自四面體中間體的S-氨基的質(zhì)子獲得谷氨酰胺。*含有天冬氨酸50'的環(huán)，其位于N端結(jié)構(gòu)域(殘基1-100)。每個(gè)活性位點(diǎn)形成于十二聚體環(huán)內(nèi)一個(gè)亞基的C端結(jié)構(gòu)域和相鄰亞基的N端結(jié)構(gòu)域之間的界面處，因此大多數(shù)活性位點(diǎn)通過(guò)C端結(jié)構(gòu)域的殘基形成。天冬氨酸50'在活性位點(diǎn)的N端部分，認(rèn)為其與銨底物結(jié)合，然后接受來(lái)自銨的質(zhì)子，結(jié)果形成其后能進(jìn)攻磷酸化-谷氨酰中間體的氨。天冬氨酸50'的位置通過(guò)核苷酸結(jié)合來(lái)控制。ADP與ATP由雙漏斗頂部進(jìn)入活性位點(diǎn)且磷酸鏈指向雙漏斗內(nèi)。ADP誘導(dǎo)精氨酸359與天冬氨酸50'作用并激發(fā)精氨酸344與天冬氨酸64'作用，為環(huán)內(nèi)亞基間的穩(wěn)定化提供額外接觸。天冬氨酸50'的移動(dòng)有助于形成銨結(jié)合位點(diǎn)，而精氨酸339的移動(dòng)可能有助于磷?；D(zhuǎn)移以及磷酸結(jié)合。有人認(rèn)為通過(guò)誘導(dǎo)精氨酸359向谷氨酸的Y-羧酸酯氧中的一個(gè)移動(dòng)，ADP結(jié)合還能增加谷氨酸的親合力。最后，ADP的P-磷酸向n2離子、組氨酸269和組氨酸271轉(zhuǎn)移谷氨酸129。已經(jīng)進(jìn)行了通過(guò)定點(diǎn)突變由其它氨基酸殘基，即天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺來(lái)取代金屬離子配體組氨酸269的研究。所有的突變酶均顯示幾乎無(wú)構(gòu)象變化，并且仍能結(jié)合兩個(gè)金屬離子。用中性配體例如天冬酰胺和谷氨酰胺來(lái)取代組氨酸269稍微改變解離常數(shù)(3-4倍)，而用谷氨酸取代則稍微減小了解離常數(shù)。除H269E夕卜，突變對(duì)底物Km'幾乎無(wú)影響，H269E的km顯示出比野生型增加IOOO倍(Abell，LM，JSchineller，PJKeck禾卩JVillafranca(1995)Biochemistry34:16695-16702)。'發(fā)現(xiàn)天冬酰胺264在雙漏斗下端谷氨酸入口附近的柔性環(huán)(殘基255-266)上，并且與谷氨酸327翼相鄰。當(dāng)谷氨酸結(jié)合時(shí)，側(cè)鏈向賴氨酸176的e-氨基擺動(dòng)，當(dāng)丙氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺與谷氨酰胺合成酶復(fù)合時(shí)，發(fā)現(xiàn)也同樣出現(xiàn)該現(xiàn)象。對(duì)這些環(huán)進(jìn)行以上闡述的結(jié)果是可將谷氨酰胺合成酶的酶反應(yīng)機(jī)理描述為一系列環(huán)和側(cè)鏈的移動(dòng)。在所提出的反應(yīng)機(jī)理中，atp結(jié)合于雙漏斗的頂部，以使其末端的磷酸基結(jié)合到n2離子的附近。該atp結(jié)合的結(jié)果是天冬氨酸50'環(huán)向銨離子隨后將要結(jié)合的位點(diǎn)移動(dòng)。然后，精氨酸359向谷氨酸的？羧酸酯基隨后將要結(jié)合的位點(diǎn)移動(dòng)。這些移動(dòng)均增加了谷氨酸與銨結(jié)合的親合力。隨后，谷氨酸從雙漏斗底部進(jìn)入并結(jié)合到谷氨酸327翼上，并使其，羧酸酯基結(jié)合到nl離子的附近。谷氨酸的氨基移動(dòng)天冬酰胺264環(huán)，輔助天冬氨酸50'環(huán)上的絲氨酸52'使上述翼穩(wěn)定。這時(shí)，活性位點(diǎn)被包圍并且與水隔離，完成銨結(jié)合。atp的y-磷酸轉(zhuǎn)移到谷氨酸的y-羧酸酯上，由此形成中間體。兩個(gè)正電金屬離子和精氨酸359通過(guò)極化atp的，磷酸基使y-磷的正電性更強(qiáng)來(lái)參與磷酰基轉(zhuǎn)移。銨離子進(jìn)入雙漏斗并在負(fù)電口袋中結(jié)合，所述的負(fù)電口袋由谷氨酸327、天冬氨酸50'、酪氨酸19、谷氨酸212和絲氨酸53'形成。天冬氨酸50'的側(cè)鏈?zhǔn)逛@離子去質(zhì)子化形成氨，然后該氨進(jìn)攻，谷氨酰磷酸中間體的S-碳，因此釋放出磷酸基。這時(shí)，在四面體加合物和谷氨酸327之間形成鹽橋，然后該鹽橋接受加合物的質(zhì)子，由此使鹽橋中和并形成谷氨酰胺。最后，谷氨酸327翼打開(kāi)，釋放出谷氨酰胺。存在三種不同形式的谷氨酰胺合成酶GSI、GSn和GSIII。GSI形式只存在于細(xì)菌(真細(xì)菌)和古菌(古細(xì)菌)中。GSII存在于真核細(xì)胞和某些土壤細(xì)菌，而只在少數(shù)菌種中發(fā)現(xiàn)GSin基因。有兩個(gè)重要的GSI亞門GSI-ct和GSI-P。在嗜熱菌、低G+C革蘭氏陽(yáng)性菌和廣古菌(包括產(chǎn)甲烷菌類、嗜鹽菌類和一些嗜熱菌類)中發(fā)現(xiàn)GSI-a基因，而在所有其它細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)GSI-P基因。GSI-P酶通過(guò)腺苷?；?去腺苷酰化級(jí)聯(lián)被調(diào)節(jié)，并且還含有在GSI-a形式中不存在的25個(gè)氨基酸插入序列。具有GSI-P基因的細(xì)菌包括白喉棒狀桿菌、淋球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌、傷寒沙門氏桿菌、肺炎克雷伯菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、普通變形桿菌、痢疾志賀菌、霍亂弧菌、銅綠假單孢菌、糞產(chǎn)堿桿菌、幽門螺桿菌、流感嗜血桿菌、百日咳桿菌、支氣管炎博德特菌、腦膜炎奈瑟菌、羊布魯氏菌、結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、梅毒密螺旋體、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體、衣氏放線菌、星形諾卡菌、氧化亞鐵硫桿菌、巴西固氮螺菌、魚(yú)腥藻、Fremyelladiplosiphon和天藍(lán)色鏈霉菌。GSI-a亞門的生物例子包括蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、破傷風(fēng)梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌。在具有GSI-P基因的大腸桿菌和其它細(xì)菌中，通過(guò)l個(gè)和12個(gè)GS亞基之間的腺苷酰化來(lái)調(diào)節(jié)GS活性。所有原核細(xì)菌的腺苷酰化位點(diǎn)(相當(dāng)于大腸桿菌中的Tyr397)均表現(xiàn)出高度保守，而腺苷酰化程度與培養(yǎng)基中氮能源和碳能源的可利用性有關(guān)。具有10-12個(gè)腺苷?；瘉喕墓劝滨０泛铣擅府a(chǎn)生于過(guò)量氮和限量碳存在下生長(zhǎng)的細(xì)胞中。GS的腺苷酰化還改變了酶對(duì)二價(jià)金屬離子從Mg"到M+的特異性。絲氨酸蛋白酶抑制劑的研發(fā)和治療用途已經(jīng)體現(xiàn)在包括乙型肝炎病毒(HCV)的疾病和與凝血級(jí)聯(lián)障礙有關(guān)的疾病，例如心肌梗塞、中風(fēng)和深度靜脈血栓。已經(jīng)研發(fā)凝血酶、凝血因子X(jué)a和凝血因子VIIIa復(fù)合物的抑制劑用作對(duì)血栓障礙和預(yù)防靜脈血栓和動(dòng)脈血栓的生物有效的口服抗凝血藥。因?yàn)檫@些酶均屬于絲氨酸蛋白酶的胰蛋白酶家族，所以它們具有結(jié)構(gòu)類似的活性位點(diǎn)。已經(jīng)設(shè)計(jì)了很多種對(duì)這些絲氨酸蛋白酶具有特異靶向的抑制劑。其中包括肽基-精氨酸醛衍生物(peptidyl-argininealdehydederivative)(Bajusz，S.,等(1997)WO97/46576)、吡咯并吡啶烷衍生物(pyrrolopyrrrolidenederivative)(Cooke，S.H.等(1998)，WO99/12935)、喹啉酮(Dudley,D.A.和J.J.Edmunds(1999)，WO99〃50263以及PastorR.M,，Artis，D.R.和A.G.Olivem(2002)，WO02/22575)。凝血酶和凝血因子X(jué)a的雙重抑制劑包括含有使用4-(l-甲基-苯并咪唑-z-基)-甲基氨基-芐脒作為基本支架的1-甲基-苯并咪唑部分的化合物(Nar，H.等人(2001)Structure,9:29-37)。
發(fā)明內(nèi)容本公開(kāi)內(nèi)容部分基于此發(fā)現(xiàn)，即谷氨酰胺合成酶使用依賴于其腺苷?；癄顟B(tài)的兩個(gè)類絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體中的一個(gè)，催化氨與在第一酶催化步驟形成的"谷氨酰磷酸的反應(yīng)。本文所用的形成谷氨酰胺的GS活性位點(diǎn)在本文是指谷氨酰胺形成位點(diǎn)。雖然任何理論均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，但是本發(fā)明者認(rèn)為一種機(jī)理(通過(guò)該機(jī)理酶的腺苷?；癄顟B(tài)或去腺苷?；癄顟B(tài)影響酶對(duì)MgATP/NH4+或Mn2ATP/NH3的催化特異性)是通過(guò)誘導(dǎo)兩個(gè)假設(shè)的催化三聯(lián)體之間的轉(zhuǎn)換。依賴于該酶的腺苷?；癄顟B(tài)，兩個(gè)三聯(lián)體中的一個(gè)參與激活的絲氨酸對(duì)第一反應(yīng)的羧基-磷酸酐中間體，即Y-谷氨酰磷酸的親核進(jìn)攻，從而形成?；钢虚g體。然后，谷氨酰?；虚g體經(jīng)歷NH3的親核進(jìn)攻，從酶表面釋放谷氨酰胺。兩個(gè)催化三聯(lián)體的存在符合此事實(shí)，即來(lái)源于大腸桿菌的谷氨酰胺合成酶對(duì)氨具有兩個(gè)親合常數(shù)(MeekTD和JJVillafranca(1980)Biochemistry19:5513-5519)。由于在氮過(guò)量和碳限量條件下產(chǎn)生腺苷?；?，在氮限量和碳過(guò)量條件下產(chǎn)生去腺苷酰化酶，NH4+7NH3的溶液化學(xué)也影響GS的調(diào)節(jié)。在低銨鹽濃度下，NH4+離解為NH3+H+。NH3是強(qiáng)親核體，能對(duì)所提出的Y-谷氨酰?；钢虚g體進(jìn)行親核進(jìn)攻。此外，如下所示，通過(guò)已知的絲氨酸蛋白酶抑制劑AEBSF和PMSF進(jìn)行的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)和GS活性抑制，進(jìn)一步證明了通過(guò)兩個(gè)類絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體的存在可調(diào)節(jié)谷氨酰胺合成酶反應(yīng)的最終步驟。因此，在設(shè)計(jì)對(duì)腺苷?；?或去腺苷酰化谷氨酰胺合成酶特異的抑制劑過(guò)程中，可將絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體的化學(xué)和反應(yīng)機(jī)理的知識(shí)與GS結(jié)構(gòu)包括GS谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的知識(shí)結(jié)合。因此，本文提供一種設(shè)計(jì)試驗(yàn)抑制劑化合物的計(jì)算機(jī)輔助方法，以及用于試驗(yàn)化合物抑制活性的體外和體內(nèi)篩選的方法。如此設(shè)計(jì)或篩選的化合物可用于抑制腺苷?；蛉ハ佘挣；疓S活性，并且因此治療、預(yù)防或改善哺乳動(dòng)物的細(xì)菌感染。因?yàn)橥ㄟ^(guò)腺苷?；?去腺苷?；?jí)聯(lián)可調(diào)節(jié)細(xì)菌GSI-P酶，但卻不能調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的GSII酶，因此對(duì)腺苷?；疓S有抑制作用、但對(duì)去腺苷?；疓S沒(méi)有或僅有最小抑制作用的化合物可用于選擇性地抑制GSI-P細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的負(fù)面影響也被最小化。本文還提供用于抑制GS活性，包括腺苷?；腿ハ佘挣；疓S活性的化合物和組合物；用于抑制或預(yù)防體外和體內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)的化合物和組合物；以及用于治療、預(yù)防或改善哺乳動(dòng)物細(xì)菌感染的化合物和組合物。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種產(chǎn)生谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)活性的試驗(yàn)抑制劑的計(jì)算機(jī)輔助方法。所述方法使用包括處理器和輸入設(shè)備的程序式計(jì)算機(jī)，所述方法包括(a)向所述輸入設(shè)備輸入包括谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)；(b)使用所述處理器將試驗(yàn)抑制劑分子對(duì)接到所述谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)內(nèi)；以及(c)基于所述對(duì)接，確定所述試驗(yàn)抑制劑分子是否抑制所述谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的活性。所述方法還可包括將"谷氨酰磷酸部分對(duì)接到所述活性位點(diǎn)內(nèi)，和/或生成由步驟(c)確定的試驗(yàn)抑制劑以抑制所述谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的活性并體外評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)谷氨酰胺合成酶多肽的抑制活性。體外評(píng)價(jià)包括使用能測(cè)量ATP水解、ADP形成、AMP形成、谷氨酸利用或谷氨酰胺形成的分析法(assay)。在有些實(shí)施方式中，所述方法還可包括體外評(píng)價(jià)相對(duì)于去腺苷酰化的谷氨酰胺合成酶多肽，所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)腺苷酰化的谷氨酰胺合成酶多肽有差別的抑制活性，和/或生成所述試驗(yàn)抑制劑并評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)含有GSI-a或GSI-卩谷氨酰胺合成酶基因的細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制活性。GSI-I3細(xì)菌可選自白喉棒狀桿菌、淋球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌、傷寒沙門氏桿菌、肺炎克雷伯菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、普通變形桿菌、痢疾志賀菌、霍亂弧菌、銅綠假單孢菌、糞產(chǎn)堿桿菌、幽門螺桿菌、流感嗜血桿菌、百日咳桿菌、支氣管炎博德特菌、腦膜炎奈瑟菌、羊布魯氏菌、結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、梅毒密螺旋體、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體、衣氏放線菌、星形諾卡菌、氧化亞鐵硫桿菌、巴西固氮螺菌、魚(yú)腥藻、Fremyelladiplosiphon和天藍(lán)色鏈霉菌，以及GSI-a細(xì)菌可選自蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、破傷風(fēng)梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌。在有些實(shí)施方式中，所述方法可包括評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)真核細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物(例如人)細(xì)胞)生長(zhǎng)的抑制活性。另一方面，本文提供一種產(chǎn)生抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)活性的化合物的方法，所述方法包括(a)提供谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)；以及(b)基于所述三維結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)能抑制所述谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)和，谷氨酰磷酸中間體之間相互作用的試驗(yàn)化合物。在有些實(shí)施方式中，所述試驗(yàn)化合物能抑制所述谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的腺苷酰化催化三聯(lián)體位點(diǎn)和，谷氨酰磷酸中間體之間的相互作用，或者能抑制所述谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的去腺苷?；呋?lián)體位點(diǎn)和"谷氨酰磷酸中間體之間的相互作用。在有些實(shí)施方式中，試驗(yàn)化合物能抑制在所述谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的腺苷?；呋?lián)體位點(diǎn)中?；?酶中間體的形成，或者能抑制在所述谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的去腺苷酰化催化三聯(lián)體位點(diǎn)中?；?酶中間體的形成。所述方法還可包括生成步驟(b)的所述試驗(yàn)化合物并體外評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)化合物對(duì)谷氨酰胺合成酶多肽的抑制活性，和/或評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)化合物對(duì)含有GSI-a或GSI-j3谷氨酰胺合成酶基因的細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制活性。在有些情況下，所述方法可包括評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)化合物對(duì)真核細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物的(例如人)細(xì)胞)生長(zhǎng)的抑制活性。另一方面，本文提供一種產(chǎn)生抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的催化三聯(lián)體位點(diǎn)活性的試驗(yàn)化合物的方法。所述方法可包括(a)提供包括谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的催化三聯(lián)體位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)；以及(b)基于所述三維結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)能形成帶有所述催化三聯(lián)體位點(diǎn)的殘基的?；?酶中間體的試驗(yàn)化合物。在有些實(shí)施方式中，所述試驗(yàn)化合物能形成帶有對(duì)應(yīng)于大腸桿菌的谷氨酰胺合成酶多肽的Ser52或Ser53的結(jié)構(gòu)中的殘基的?；?酶中間體。在另一實(shí)施方式中，提供一種體外篩選試驗(yàn)蛋白酶抑制劑化合物以確定其是否抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)活性的方法，其中所述方法包括(a)使谷氨酰胺合成酶多肽與試驗(yàn)蛋白酶抑制劑化合物接觸；以及(b)確定相對(duì)于還沒(méi)有與所述試驗(yàn)絲氨酸蛋白酶抑制劑化合物接觸過(guò)的谷氨酰胺合成酶多肽的活性，所述谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的活性是否有所降低。通過(guò)使用能測(cè)量ATP水解、ADP形成、AMP形成、谷氨酸利用或谷氨酰胺形成的分析法，可測(cè)量所述谷氨酰胺形成位點(diǎn)的活性。所述試驗(yàn)蛋白酶抑制劑化合物可以是試驗(yàn)絲氨酸蛋白酶抑制劑化合物。在有些實(shí)施方式中，試驗(yàn)蛋白酶抑制劑的文庫(kù)(例如試驗(yàn)絲氨酸蛋白酶抑制劑的文庫(kù))逐一與谷氨酰胺合成酶多肽接觸。在另一實(shí)施方式中，提供一種用于抑制GS多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)活性的體外方法，所述方法包括使GS多肽與含有絲氨酸蛋白酶抑制劑的組合物接觸。該絲氨酸蛋白酶抑制劑可以是肽基-精氨酸醛衍生物、吡咯并吡咯垸酮衍生物、喹啉酮衍生物或1-甲基苯并咪唑衍生物。還提供一種用于抑制含有GSI-a或GSI-卩基因的細(xì)菌生長(zhǎng)的體外方法，所述方法包括使所述細(xì)菌與含有絲氨酸蛋白酶抑制劑的組合物接觸。在又一實(shí)施方式中，提供一種用于治療、預(yù)防或改善與哺乳動(dòng)物細(xì)菌感染有關(guān)的一種或多種癥狀或障礙的方法，其中所述細(xì)菌感染由含有GSI-a或GSI-P基因的細(xì)菌引起。所述方法可包括將含有絲氨酸蛋白酶抑制劑的組合物給予所述哺乳動(dòng)物。此外，還提供一種用于抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成位點(diǎn)活性的體內(nèi)方法，其中所述方法包括將含有絲氨酸蛋白酶抑制劑的組合物給予懷疑遭受或正在遭受細(xì)菌感染的哺乳動(dòng)物，其中所述細(xì)菌感染由含有GSI-a或GSI-P基因的細(xì)菌引起。除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員所普遍理解的意義相同。如有沖突，本文件包括定義將決定保護(hù)范圍。盡管與本文記載的方法和材料類似或等同的方法和材料也可用于實(shí)施本發(fā)明或?qū)Ρ景l(fā)明進(jìn)行試驗(yàn)，但以下記載了優(yōu)選的方法和材料。所有的出版物，專利申請(qǐng)、專利及其它參考文獻(xiàn)均以整體引入本文。本文公開(kāi)的材料、方法和實(shí)施例只用于說(shuō)明而沒(méi)有限制本發(fā)明的意圖。從以下說(shuō)明、附圖和權(quán)利要求書(shū)中將明顯看出本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)，例如抑制腺苷?；疓S的活性和由此用于治療細(xì)菌感染的方法。圖1示出了在高氨濃度條件下，腺苷酰化谷氨酰胺合成酶在谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)處的假設(shè)反應(yīng)機(jī)理，其中需要NHU+的去質(zhì)子化。所述機(jī)理由左上方的非共價(jià)的米氏(Michaelis)復(fù)合物開(kāi)始。接下來(lái)，形成第一四面體過(guò)渡態(tài)，隨后形成酰基-酶中間體、釋放磷酸和通過(guò)Asp50'或該酰基中間體對(duì)銨進(jìn)行去質(zhì)子化。然后發(fā)生氨對(duì)酰基中間體的親核進(jìn)攻并形成第二四面體過(guò)渡態(tài)，隨后釋放谷氨酰胺并回到非共價(jià)的米氏復(fù)合物。圖2示出了在低氨濃度條件下，去腺苷酰化谷氨酰胺合成酶在谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)處的假設(shè)反應(yīng)機(jī)理。所述機(jī)理由左上方的非共價(jià)米氏復(fù)合物開(kāi)始。接下來(lái)，形成第一四面體過(guò)渡態(tài)，隨后形成酰基-酶中間體和釋放磷酸。然后發(fā)生氨對(duì)陽(yáng)碳離子的親核進(jìn)攻并形成第二四面體過(guò)渡態(tài)，隨后釋放谷氨酰胺并回到非共價(jià)米氏復(fù)合物。具體實(shí)施例方式定義除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"GS多肽"和"谷氨酰胺合成酶多肽"在本文中可互換使用，是指例如來(lái)自GSI-a或GSI-P細(xì)菌的細(xì)菌GSI多肽。除非另有說(shuō)明，該術(shù)語(yǔ)包括全長(zhǎng)的多肽及其片段。此外，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將公認(rèn)的那樣，GS可作為體內(nèi)十二聚體，GS活性位點(diǎn)可由來(lái)自于一個(gè)以上單體的氨基酸組成。因此，該術(shù)語(yǔ)還包括全長(zhǎng)GS的多聚體(例如二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體、九聚體、十聚體、十一聚體和十二聚體)、GS片段的多聚體、作為一個(gè)或多個(gè)GS活性位點(diǎn)一部分的一個(gè)或多個(gè)殘基(例如一組殘基，所述殘基可能在GS的一級(jí)序列中不鄰接和/或來(lái)自于不同單體，但卻組成GS活性位點(diǎn)的至少一部分)以及這些組合的多聚體。"多肽"和"蛋白"可互換使用，是指無(wú)論長(zhǎng)度或翻譯后修飾，氨基酸的任意肽連接鏈(peptide-linkedchain)。術(shù)語(yǔ)"分離的"可指沒(méi)有自然存在的對(duì)應(yīng)物或已經(jīng)從與之自然相伴的成分例如下列組織或體液中分離或純化的多肽，所述組織例如是胰腺、肝、脾、卵巢、睪丸、肌肉、關(guān)節(jié)組織、神經(jīng)組織、胃腸組織或腫瘤組織(例如乳腺癌或結(jié)腸癌組織)；所述體液例如是血液、血清或尿，或是從細(xì)菌或真菌培養(yǎng)液中分離或純化的多肽。通常，當(dāng)至少70%干重的多肽不含有與之自然相關(guān)聯(lián)的蛋白和其它自然存在的有機(jī)分子時(shí)，認(rèn)為多肽是"分離的"。優(yōu)選地，多肽制劑是至少80%、更優(yōu)選至少90%和最優(yōu)選至少99%干重的多肽。因?yàn)榛瘜W(xué)合成的多肽其本身是從與之自然共存的成分中分離出來(lái)的，所以合成的多肽是"分離的"。分離的多肽可以例如通過(guò)從天然來(lái)源(例如從組織)提取、通過(guò)編碼多肽的重組核酸的表達(dá)或通過(guò)化學(xué)合成來(lái)獲得。因?yàn)楸囟ú缓信c之自然相伴的成分，因此在與自然產(chǎn)生多肽來(lái)源不同的細(xì)胞體系內(nèi)產(chǎn)生的多肽是"分離的"。通過(guò)任何適合的方法，例如柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析可以測(cè)量分離或純化的程度。在檢測(cè)之前，通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法和本文記載的方法可對(duì)任何多肽進(jìn)行修飾，例如腺苷?；⒘姿峄蛱腔?。本文使用的化合物的"藥學(xué)上可接受的衍生物"包括鹽、酯、烯醇醚、烯醇酯、縮醛、縮酮、原酸酯、半縮醛、半縮酮、酸、堿、溶劑合物、水合物或其前體藥物。使用用于這些衍生的已知方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地制備這些衍生物。將生成的化合物給予動(dòng)物或人而沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的毒性作用，并且該化合物具有藥學(xué)活性或者為前體藥物。藥學(xué)上可接受的鹽包括胺鹽，例如N,N'-二節(jié)基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、氨、二乙醇胺和其它羥垸基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普魯卡因、N-芐基苯乙胺、l-對(duì)-氯芐基-2-吡咯垸-l'-基甲基-苯并咪唑、二乙胺和其它垸基胺、哌嗪和三(羥甲基)氨基甲垸，但不限于此；堿金屬鹽，例如鋰鹽、鉀鹽和鈉鹽，但不限于此；堿土金屬鹽，例如鋇鹽、f!鹽和鎂鹽，但不限于此；過(guò)渡金屬鹽，例如鋅鹽，但不限于此；和其它金屬鹽，例如磷酸氫鈉和磷酸二鈉，但不限于此；還包括但不限于硝酸鹽、硼酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、無(wú)機(jī)酸鹽(例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽和硫酸鹽，但不限于此)；以及有機(jī)酸鹽，例如醋酸鹽、三氟乙酸鹽、馬來(lái)酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、水楊酸鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、丁酸鹽、戊酸鹽和延胡索酸鹽，但不限于此。藥學(xué)上可接受的酯包括酸基的烷基酯、烯基酯、炔基酯、芳基酯、雜芳基酯、芳垸基酯、雜芳垸基酯、環(huán)烷基酯和雜環(huán)酯，但不限于此，其中所述酸基包括羧酸、磷酸、次磷酸、磺酸、亞磺酸和硼酸，但不限于此。藥學(xué)上可接受的烯醇醚包括式C-C(OR)表示的衍生物，其中R為氫、垸基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、環(huán)垸基或雜環(huán)基，但不限于此。藥學(xué)上可接受的烯醇酯包括式C-C(OC(O)R)的衍生物，其中，R為氫、垸基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳垸基、環(huán)烷基或雜環(huán)基，但不限于此。藥學(xué)上可接受的溶劑合物和水合物為一個(gè)或多個(gè)溶劑或水分子與化合物的復(fù)合物，或1-約100個(gè)、或1-約10個(gè)、或1-約2個(gè)、1-約3個(gè)或1-約4個(gè)溶劑或水分子與化合物的復(fù)合物。本文使用的治療意指以任何方式使細(xì)菌感染例如結(jié)核分枝桿菌感染的一種或多種癥狀得以改善或發(fā)生其它有利地改變。治療還包括本文所述的組合物的任何藥物用途，例如用于治療與細(xì)菌感染有牽連的疾病、障礙或失調(diào)的用途。本文使用的通過(guò)給予特定化合物或藥物組合物使特定障礙的癥狀得以改善是指任何可歸因于組合物給予或與組合物給予有關(guān)的減輕，無(wú)論這種減輕是持久的或臨時(shí)的、持續(xù)的或短暫的。本文所用的ICso是指在測(cè)量響應(yīng)的方法中，對(duì)最大響應(yīng)的抑制達(dá)到50%的特定試驗(yàn)化合物的量、濃度或劑量。本文所用的術(shù)語(yǔ)Ki代表酶/抑制劑復(fù)合物的解離常數(shù)。Ki理論上與被抑制劑試驗(yàn)的底物無(wú)關(guān)。使用方程式K產(chǎn)ICsZKm/(S+Km)由ICso可計(jì)算Ki，其中，S是底物濃度，Km是反應(yīng)速度為最大值一半時(shí)的底物濃度(在沒(méi)有抑制劑時(shí))。用于抑制特定底物(固定Km)的抑制劑的Ki是常數(shù)。本文所用的ECso是指達(dá)到50%抑制時(shí)的藥物濃度，以及CCso是指達(dá)到50%毒性時(shí)的藥物濃度。本文所用的前體藥物是經(jīng)體內(nèi)給予，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)步驟或過(guò)程被代謝、或通過(guò)另外的方式被轉(zhuǎn)化為該化合物在生物學(xué)上、藥學(xué)上或治療學(xué)上的活性形式。為生成前體藥物，對(duì)藥學(xué)上的活性化合物進(jìn)行修飾以使該活性化合物通過(guò)代謝過(guò)程再生?？梢栽O(shè)計(jì)前體藥物以改變其代謝穩(wěn)定性或藥物轉(zhuǎn)運(yùn)特性、掩蓋副作用或毒性、改善藥物味道或改變藥物的其它特性或性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員一旦獲知具有藥學(xué)活性的化合物，可通過(guò)體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)過(guò)程和藥物代謝的知識(shí)設(shè)計(jì)該化合物的前體藥物(參見(jiàn)例如Nogrady(1985)MedicinalChemistryABiochemicalApproach,OxfordUniversityPress,NewYork,388-392)。本文所用的關(guān)于化合物"相當(dāng)純的"是指足夠均一以至于當(dāng)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員評(píng)價(jià)純度使用的標(biāo)準(zhǔn)分析方法，例如薄層層析法(TLC)、凝膠電泳法、高效液相色譜法(HPLC)和/或質(zhì)譜法(MS)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，顯示不含有容易檢測(cè)的雜質(zhì)，或足夠純以至于進(jìn)一步純化不會(huì)檢測(cè)到物質(zhì)的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)(例如酶活性和生物活性)的改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于對(duì)化合物進(jìn)行純化以產(chǎn)生化學(xué)上相當(dāng)純的化合物的方法。然而，化學(xué)上相當(dāng)純的化合物可以是立體異構(gòu)體的混合物。在這種情況下，進(jìn)一步純化可增加化合物的比活性。除非另有說(shuō)明，本文所用的任何保護(hù)基、氨基酸和其它化合物的縮寫均符合它們的慣常用法、公認(rèn)的縮寫或IUPAC-IUB委員會(huì)對(duì)于生物化學(xué)命名的規(guī)定(參見(jiàn)(1972)Biochem.11:942-944)。GS活性位點(diǎn)的抑制劑的設(shè)計(jì)方法本文提供用于設(shè)計(jì)結(jié)合到和/或抑制GS(特別是來(lái)自GSI細(xì)菌的GS多肽)的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的化合物的方法，包括基于計(jì)算機(jī)的方法。如本文進(jìn)一步描述的，認(rèn)為GS的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)催化氨對(duì)Y-谷氨酰?；钢虚g體的親核進(jìn)攻從而形成谷氨酰胺。該谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)可包括一個(gè)或多個(gè)類絲氨酸催化三聯(lián)體，例如本文所述的腺苷?；?或去腺苷?；腉S催化三聯(lián)體。本發(fā)明者已提出假設(shè)，依賴于腺苷?；癄顟B(tài)，谷氨酰胺合成酶利用兩個(gè)類絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體中的一個(gè)來(lái)催化氨與在第一GS酶催化步驟中形成的"谷氨酰磷酸的反應(yīng)。依賴于該酶的腺苷?；癄顟B(tài)，兩個(gè)三聯(lián)體中的一個(gè)參與激活的絲氨酸對(duì)第一反應(yīng)的羧基-磷酸酐中間體，即"谷氨酰磷酸的親核進(jìn)攻，從而形成?；钢虚g體。然后，該谷氨酰酰基中間體經(jīng)歷NH3的親核進(jìn)攻，從酶表面釋放谷氨酰胺。因此，通過(guò)分析一個(gè)或兩個(gè)催化三聯(lián)體，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道如何使用標(biāo)準(zhǔn)分子模擬或其它技術(shù)來(lái)鑒定肽、擬肽和小分子，所述肽、擬肽和小分子例如通過(guò)結(jié)合到和/或抑制GS的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)含有的一個(gè)或兩個(gè)催化三聯(lián)體的活性，可以結(jié)合到和/或抑制GS的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)，從而抑制親核進(jìn)攻活性。例如，小分子可以與位點(diǎn)中的某些氨基酸(例如催化三聯(lián)體氨基酸)直接作用來(lái)抑制假設(shè)反應(yīng)機(jī)理，或者可在變構(gòu)位點(diǎn)作用，所述變構(gòu)位點(diǎn)即不直接參與催化活性但化合物與其結(jié)合會(huì)導(dǎo)致(例如通過(guò)誘導(dǎo)分子中構(gòu)象發(fā)生變化)活性抑制的分子區(qū)域。"分子模擬"是指基于三維結(jié)構(gòu)信息和作用模型的物理作用的結(jié)構(gòu)和功能的定量和/或定性分析。這包括常規(guī)的基于數(shù)字的分子動(dòng)力學(xué)和能量最小化模型、交互式計(jì)算機(jī)圖形模型、修飾分子力學(xué)模型、距離幾何和基于其它結(jié)構(gòu)的約束模型。通常使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行分子模擬以及可以使用已知方法進(jìn)一步優(yōu)化。設(shè)計(jì)特異性(例如以高的親合力)結(jié)合到包括一個(gè)或兩個(gè)催化三聯(lián)體的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的化合物的方法，通常也是基于計(jì)算機(jī)，并且涉及使用具有能產(chǎn)生原子模型的程序的計(jì)算機(jī)。使用X射線結(jié)晶數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)程序?qū)τ谠O(shè)計(jì)這些化合物尤其有用。例如，程序(例如RasMol)可用于產(chǎn)生以下物質(zhì)的三維模型，例如去腺苷酰化或腺苷?；腉S、去腺苷?；蛳佘挣；疓S的片段、或構(gòu)成去腺苷?；蛳佘挣；疓S的全部或部分谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的一組殘基，例如構(gòu)成去腺苷?；蛳佘挣；疓S的催化三聯(lián)體活性位點(diǎn)的殘基。計(jì)算機(jī)程序，例如INSIGHT(Accelrys，Burlington,MA)、Auto-Dock(Accelrys)和DiscoveryStudio1.5(Accelrys)允許進(jìn)一步處理并且具備引入新結(jié)構(gòu)的能力?？墒褂美缬?jì)算機(jī)硬件或軟件或二者的組合設(shè)計(jì)化合物。然而，優(yōu)選以一個(gè)或多個(gè)程序式計(jì)算機(jī)上執(zhí)行的一個(gè)或多個(gè)計(jì)算機(jī)程序來(lái)實(shí)施設(shè)計(jì)，每個(gè)程序式計(jì)算機(jī)均包括處理器和至少一個(gè)輸入設(shè)備。計(jì)算機(jī)優(yōu)選還包括數(shù)據(jù)存儲(chǔ)系統(tǒng)(包括非永久性和永久性的存儲(chǔ)器和/或存儲(chǔ)元件)以及至少一個(gè)輸出設(shè)備。使用程序代碼輸入數(shù)據(jù)來(lái)實(shí)現(xiàn)上述功能并產(chǎn)生輸出信息。以已知的方式將輸出信息應(yīng)用到一個(gè)或多個(gè)輸出設(shè)備上。計(jì)算機(jī)例如可以是常規(guī)設(shè)計(jì)的個(gè)人計(jì)算機(jī)、微機(jī)或工作站。優(yōu)選以高水平的過(guò)程化程序設(shè)計(jì)語(yǔ)言或面向?qū)ο蟮某绦蛟O(shè)計(jì)語(yǔ)言來(lái)執(zhí)行每個(gè)程序從而與計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行交流。然而，若需要，可以匯編語(yǔ)言或機(jī)器語(yǔ)言來(lái)執(zhí)行程序。在任何情況下，所述語(yǔ)言可以是編譯型語(yǔ)言或解釋型語(yǔ)言。優(yōu)選將每個(gè)計(jì)算機(jī)程序存儲(chǔ)使用通用的或?qū)Ｓ玫目删幊逃?jì)算機(jī)即可讀取的存儲(chǔ)介質(zhì)或設(shè)備(例如ROM或磁盤)上。當(dāng)程序被計(jì)算機(jī)讀取時(shí)，該計(jì)算機(jī)程序的作用是設(shè)置和操作計(jì)算機(jī)執(zhí)行本文所述的程序。還可通過(guò)設(shè)置計(jì)算機(jī)程序的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法，其中如此設(shè)置的所述存儲(chǔ)介質(zhì)使計(jì)算機(jī)以特定和預(yù)設(shè)的方式操作從而實(shí)現(xiàn)本文所述的功能。例如，在設(shè)計(jì)試驗(yàn)化合物的方法中需要計(jì)算機(jī)的步驟可包括(a)例如通過(guò)鍵盤、磁盤或磁帶向輸入設(shè)備輸入數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)(例如原子坐標(biāo))限定結(jié)合到第二分子或復(fù)合物的第一分子或復(fù)合物的三維(3-D)結(jié)構(gòu)，所述第一分子或復(fù)合物例如是腺苷酰化的GS、去腺苷酰化GS;去腺苷?；疓S或腺苷酰化GS的一部分(例如構(gòu)成一些或全部谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的一組殘基，例如構(gòu)成一個(gè)或兩個(gè)催化三聯(lián)體的殘基)，它們中的任一個(gè)可包括一個(gè)或多個(gè)結(jié)合的ATP、ADP、谷氨酰胺或谷氨酸分子，所述第二分子或復(fù)合物例如是ATP、ADP、谷氨酰胺、谷氨酸、"谷氨酰磷酸；以及(b)使用處理器測(cè)定參與結(jié)合到第二分子或復(fù)合物的第一分子或復(fù)合物上的位點(diǎn)的3-D結(jié)構(gòu)(例如原子模型)。應(yīng)該注意的是，盡管原始的GS3-D結(jié)構(gòu)來(lái)自一個(gè)種，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，例如同源性比對(duì)或分子模擬來(lái)確定其它種的GS所關(guān)注的相應(yīng)殘基。從由此方式獲得的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員能設(shè)計(jì)和制造具有適合3-D結(jié)構(gòu)的抑制性化合物(例如肽、非肽小分子、擬肽和適體(例如核酸適體))。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)計(jì)與第一分子或復(fù)合物的某些殘基可相互作用的抑制性化合物。因此，在步驟(b)后，基于三維結(jié)構(gòu)，可設(shè)計(jì)能抑制例如谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)和Y-谷氨酰磷酸中間體之間相互作用的試驗(yàn)化合物，例如能抑制谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的腺苷酰化催化三聯(lián)體位點(diǎn)和Y-谷氨酰磷酸中間體之間相互作用的試驗(yàn)化合物，或能抑制谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的去腺苷?；呋?lián)體位點(diǎn)和Y-谷氨酰磷酸中間體之間相互作用的試驗(yàn)化合物。在有些實(shí)施方式中，可將試驗(yàn)化合物設(shè)計(jì)為能抑制谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的腺苷酰化催化三聯(lián)體位點(diǎn)中?；?酶中間體的形成，或能抑制谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的去腺苷?；呋?lián)體位點(diǎn)中酰基-酶中間體的形成。此外，如果獲得用于候選化合物的計(jì)算機(jī)可用的3-D數(shù)據(jù)(例如，X-射線結(jié)晶數(shù)據(jù))，結(jié)合上述基于計(jì)算機(jī)的步驟(a)和(b)，可進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)以下基于計(jì)算機(jī)的步驟(c)例如通過(guò)鍵盤、磁盤或磁帶向輸入設(shè)備輸入限定候選化合物三維(3-D)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)(例如原子坐標(biāo))；(d)使用處理器測(cè)定所述候選化合物的3-D結(jié)構(gòu)(例如原子模型)；(e)使用所述處理器確定候選化合物是否結(jié)合到第一分子或復(fù)合物上的位點(diǎn)；以及(f)將候選化合物鑒定為抑制第一和第二分子或復(fù)合物之間相互作用的化合物。該方法可包括另外的步驟，即向輸出設(shè)備輸出該化合物的3-D結(jié)構(gòu)的模型。此外，可將候選化合物的3-D數(shù)據(jù)與例如在數(shù)據(jù)存儲(chǔ)系統(tǒng)中存儲(chǔ)的3-D結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)相比較。在有些實(shí)施方式中，產(chǎn)生谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)(例如催化三聯(lián)體活性)的試驗(yàn)抑制劑的計(jì)算機(jī)輔助方法可包括(a)向輸入設(shè)備輸入包括GS的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)或亞結(jié)構(gòu)(例如催化三聯(lián)體)的數(shù)據(jù)；(b)使用處理器將試驗(yàn)抑制劑分子對(duì)接到該結(jié)構(gòu)內(nèi)；以及(c)基于所述對(duì)接，確定試驗(yàn)抑制劑分子是否抑制谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)(例如催化三聯(lián)體)的活性。使用其它基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)/模擬技術(shù)(參見(jiàn)例如Jackson(1997)Sem,"fl^s/"0"co/ow24:L164-172;和Jones等人(1996)丄A/ecf.C/zew.39:卯4-917)，由本文所述化合物的結(jié)構(gòu)信息還可交互設(shè)計(jì)本發(fā)明的化合物。還可通過(guò)例如使用計(jì)算機(jī)模擬鑒定候選化合物以將本發(fā)明的化合物和多肽鑒定為在空間上且選擇性地(即以高的親合力)與谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)相配合。然后，以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞抑制方法、或無(wú)細(xì)胞酶抑制方法、或酶抑制方法來(lái)檢測(cè)上述鑒定的候選化合物。本文描述了示例性的方法。可由通過(guò)各種方法獲得的數(shù)據(jù)來(lái)測(cè)定生物大分子(例如GS、腺苷酰化GS、核酸、碳水化合物和脂質(zhì))的3-D結(jié)構(gòu)。已經(jīng)最有效地用于評(píng)價(jià)蛋白3-D結(jié)構(gòu)的這些方法包括(a)X射線晶體法；(b)核磁共振(NMR)光譜法；(c)大分子上確定位點(diǎn)之間形成的物理距離約束的分析，例如蛋白上殘基之間的分子內(nèi)化學(xué)交聯(lián)(例如國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US00/14667，其公開(kāi)內(nèi)容以整體引入本文作為參考)，以及(d)基于所關(guān)注蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)知識(shí)的分子模擬方法，例如使用計(jì)算機(jī)程序例如MONSSTER(ModelingOf^[ewStructuresfromSecondaryandIertiaryRestraints)(參見(jiàn)例如國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US99/11913，其公開(kāi)內(nèi)容以整體引入本文作為參考)的同源建模技術(shù)、線程算法或從頭開(kāi)始結(jié)構(gòu)建模。還可使用符合本發(fā)明的其它分子模擬技術(shù)(例如Cohen等人(19%)J.Med.Chem.33:883-894;Navia等人(1992)CurrentOpinionsinStructuralBiology,2，202-210，其公開(kāi)內(nèi)容以整體引入本文作為參考)。所有這些方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)均可受計(jì)算機(jī)分析的指導(dǎo)。還可用于本發(fā)明方法、但目前不提供有關(guān)生物分子原子水平結(jié)構(gòu)詳情的其它光譜法，包括圓二色譜法、熒光色譜法以及紫外/可見(jiàn)光吸收光譜法。優(yōu)選的分析方法是X射線晶體法。下面對(duì)該方法和NMR光譜法進(jìn)行描述。X射線晶體法X射線晶體法是在所關(guān)注區(qū)域的晶體中，通過(guò)圍繞原子核的電子云，基于特征波長(zhǎng)的X射線衍射。該技術(shù)使用純化的生物大分子(但是這些生物大分子常常包括溶劑組分、輔因子、底物或其它配體)的晶體來(lái)測(cè)定構(gòu)成特定生物大分子的原子的接近原子級(jí)的分辨率。通過(guò)X射線晶體法揭示大分子3-D結(jié)構(gòu)的先決條件是能強(qiáng)烈衍射X射線的有序晶體。該方法將一束X射線照射到許多相同分子的有序、重復(fù)的陣列以使X射線由該陣列以可恢復(fù)單個(gè)分子結(jié)構(gòu)的模式衍射。有序晶體，例如球蛋白分子的有序晶體是具有不規(guī)則表面的、大的、球形物或橢圓形物。在單個(gè)分子之間，晶體含有大孔道。這些通常占到晶體體積一半以上的孔道被無(wú)序的溶劑分子所填充，蛋白分子只在少數(shù)小區(qū)域處彼此接觸。這就是為何晶體內(nèi)蛋白結(jié)構(gòu)通常與溶液中蛋白結(jié)構(gòu)相同的一個(gè)原因。GS已被多次結(jié)晶化，例如來(lái)自鼠傷寒沙門氏桿菌的GS(Almassy，R.J.等人(1986)Nature(London)323:304-309，Liaw，S-H.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90:4996-5000);在活性位點(diǎn)中帶有甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸的GS(Liaw，S-H和D.Eisenberg(1994)J.Biol.Chem.33:675-681);在5個(gè)結(jié)構(gòu)的活性位點(diǎn)中帶有AMPPNP、谷氨酸、L-蛋氨酸-S-亞砜酰亞胺、谷氨酰胺和ADP的GS(Liaw，S-H.，Jun，G.和D,Eisenberg(1993)ProteinScience,2:470-471);以及在活性位點(diǎn)中帶有ATP的GS(Liaw，S-H.，Jun，G和D.Eisenberg(1994)Biochemistry33:11184-11188)。以下描述或本領(lǐng)域技術(shù)人員己熟知獲得GS或GS片段包括腺苷酰化的GS的方法。晶體的形成依賴于一些不同的參數(shù)，包括pH、溫度、生物大分子濃度、溶劑和沉淀劑的性質(zhì)、以及存在的添加離子或蛋白配體。需要許多常規(guī)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)以篩選用于所有這些參數(shù)的組合，所述參數(shù)的組合可得到適于X射線衍射分析的晶體。結(jié)晶自動(dòng)機(jī)械可以使結(jié)晶實(shí)驗(yàn)的大量再現(xiàn)性工作實(shí)現(xiàn)自動(dòng)操作并得到加速(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,790,421)。多肽結(jié)晶發(fā)生在多肽濃度超過(guò)其最大溶解度的溶液中(即，多肽溶液是過(guò)飽和的)。該溶液可通過(guò)降低多肽濃度恢復(fù)平衡，所述降低多肽濃度優(yōu)選通過(guò)多肽晶體的沉淀。通常，通過(guò)添加改變多肽表面電荷或干擾多肽與本體水之間相互作用的試劑以促進(jìn)引起結(jié)晶的締合，誘導(dǎo)多肽從過(guò)飽和溶液中結(jié)晶。結(jié)晶通常在4。C到20。C之間進(jìn)行。常常使用已知用作"沉淀劑"的物質(zhì)，通過(guò)在多肽分子周圍形成在能量上不利的沉淀耗盡層，來(lái)減小多肽在濃溶液中的溶解度(Weber(1991)AdvancesinProteinChemistry,41:1-36)。除沉淀劑之外，有時(shí)還向多肽結(jié)晶溶液添加其它物質(zhì)。這些物質(zhì)包括調(diào)節(jié)溶液pH的緩沖劑和降低多肽溶解度的鹽。本領(lǐng)域已知有各種沉淀劑，包括以下所列乙醇、3-乙基-2,4戊二醇和許多聚乙二醇類例如聚乙二醇(PEG)。沉淀溶液可包括例如13-24%PEG4000、5-41%硫酸銨和1.0-1.5M氯化鈉，并且pH在5-7.5范圍。其它添加劑可包括O.IMHepes、2-4%丁醇、O.IM或20mM醋酸鈉、50-70mM檸檬酸、120-130mM磷酸鈉、ImM乙二胺四乙酸(EDTA)和ImM二硫蘇糖醇(DTT)。將這些試劑在緩沖液中制備，并以各種組合逐滴添加到結(jié)晶緩沖液中。通常使用的多肽結(jié)晶方法包括以下技術(shù)間歇式結(jié)晶、懸滴式結(jié)晶、晶種引發(fā)式結(jié)晶以及透析。在上述每種方法中，重要的是通過(guò)保持溶液過(guò)飽和而形成晶核后促進(jìn)連續(xù)結(jié)晶。在間歇式結(jié)晶方法中，多肽與沉淀劑混合以達(dá)到過(guò)飽和，將容器密封并擱置直至晶體出現(xiàn)。在透析方法中，將多肽保留在密封透析膜中，將所述密封透析膜置于含有沉淀劑的溶液中。膜的整體平衡增大了多肽和沉淀劑的濃度，由此使多肽達(dá)到過(guò)飽和水平。在優(yōu)選的懸滴式結(jié)晶技術(shù)(McPhe醒(1976)J.Biol,Chem.，251:6300-6306)中，將沉淀劑添加到多肽濃溶液中生成初始多肽混合物。多肽和沉淀劑的濃度應(yīng)為使多肽在此初始形式下不結(jié)晶。將一小滴該混合物置于載玻片上，將所述載玻片倒置并懸掛于第二溶液的貯液池上方。然后將系統(tǒng)密封。通常，第二溶液含有較高濃度的沉淀劑或其它脫水劑。沉淀劑濃度的差異使該蛋白溶液的蒸汽壓比第二溶液高。因?yàn)楹袃煞N溶液的系統(tǒng)是密封的，所以建立平衡，水由多肽混合物轉(zhuǎn)移到第二溶液。該平衡使多肽溶液中的多肽和沉淀劑的濃度增大。在多肽和沉淀劑的臨界濃度，可形成多肽的晶體。結(jié)晶的另一方法將晶核形成位點(diǎn)引進(jìn)多肽濃溶液。通常，制備多肽濃溶液并將多肽晶種引入該溶液。如果多肽和任意沉淀劑的濃度適宜，晶種會(huì)提供晶核形成位點(diǎn)，較大晶體在此晶核形成位點(diǎn)周圍形成。此外，結(jié)晶的另一方法是電結(jié)晶法，在該方法中，利用在電極鄰近的Helmholtz層內(nèi)自動(dòng)排列(self-align)的蛋白大分子的偶極矩(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,597,457)。有些蛋白可能抗拒結(jié)晶。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用幾種技術(shù)誘導(dǎo)結(jié)晶。例如，除去蛋白氨基或羧基端的柔性多肽部分可促進(jìn)生成結(jié)晶蛋白樣品?？墒褂梅肿由飳W(xué)技術(shù)或使用蛋白酶例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶處理蛋白以除去這些部分。在衍射實(shí)驗(yàn)中，由X射線源獲取窄且平行的X射線光束并照射到晶體上以產(chǎn)生衍射光束。入射主射束對(duì)大分子和溶劑分子均造成損害。因此，使晶體冷卻(例如冷卻到-220。C至-50。C)以延長(zhǎng)其壽命。主射束必須從多個(gè)方向射擊晶體以產(chǎn)生所有可能的衍射點(diǎn)，因此，在實(shí)驗(yàn)期間，晶體在光束內(nèi)旋轉(zhuǎn)。將衍射點(diǎn)記錄在膠片上或通過(guò)電子檢測(cè)器記錄。必須將曝光的膠片在掃描設(shè)備內(nèi)進(jìn)行數(shù)字化和量化，而電子檢測(cè)器將其檢測(cè)到的信號(hào)直接輸入計(jì)算機(jī)。電子區(qū)域檢測(cè)器顯著減少采集和測(cè)量衍射數(shù)據(jù)所需的時(shí)間。以膠片上的點(diǎn)得以記錄的每束衍射光使用三種性質(zhì)來(lái)定義振幅，根據(jù)點(diǎn)的強(qiáng)度來(lái)測(cè)量；波長(zhǎng)，根據(jù)X射線源來(lái)設(shè)定；以及相位，其在X射線實(shí)驗(yàn)中損失。為了測(cè)定引起衍射光束的原子位置，所有衍射光束均需要所有這三種性質(zhì)。測(cè)定相位的一種方式叫作多重同晶置換(MIR)，它需要將外源X射線散射體(例如金屬原子等重原子)引入晶體的晶胞。關(guān)于MIR更為詳細(xì)的描述，參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6,093,573的第15欄。原子坐標(biāo)是指由涉及數(shù)據(jù)傅立葉合成的數(shù)學(xué)方程式得到的笛卡爾坐標(biāo)(x、y和z位置)，所述數(shù)據(jù)是由晶體形式的所關(guān)注的生物大分子的原子(散射中心)的單色X射線衍射而獲得的圖案得到的。衍射數(shù)據(jù)用于計(jì)算晶體內(nèi)重復(fù)單元(晶胞)的電子密度圖。電子密度圖用于確定晶體的晶胞內(nèi)各個(gè)原子的位置(原子坐標(biāo))。因?yàn)闅w屬于原子坐標(biāo)的絕對(duì)值可通過(guò)延x、y和/或z軸一起或分別轉(zhuǎn)動(dòng)和/或平移而改變，但卻保持原子之間的相對(duì)空間關(guān)系不變，因此原子坐標(biāo)的絕對(duì)值表示原子之間的空間關(guān)系。因此，生物大分子(例如蛋白)，其一組絕對(duì)原子坐標(biāo)值可通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)和/或平移調(diào)節(jié)為與另一樣品分析的一組在先測(cè)定值相符，可認(rèn)為該生物大分子的原子坐標(biāo)與由該另一樣品獲得的原子坐標(biāo)相同。由美國(guó)專利號(hào)6,093,573以及國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US99/18441、PCT/US99/11913和PCT/US00/03745可獲得有關(guān)X射線晶體法的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。NMR光譜法X射線晶體法需要所關(guān)注的大分子的單晶，但是NMR測(cè)量卻在接近生理?xiàng)l件下的溶液中進(jìn)行。然而，NMR得到的結(jié)構(gòu)沒(méi)有晶體得到的結(jié)構(gòu)那樣詳細(xì)。雖然NMR光譜法的使用直至最近仍限于闡述相對(duì)小的分子(例如100-150個(gè)氨基酸殘基的蛋白)的3-D結(jié)構(gòu)，但包括對(duì)所關(guān)注的分子進(jìn)行同位素標(biāo)記以及橫向弛豫-優(yōu)化譜法(TROSY)的最新進(jìn)展使得已將該方法擴(kuò)展到分析更大的分子，例如110kDa分子量蛋白(Wider(2000)BioTechniques，29:1278-1294)。NMR使用射頻輻射來(lái)檢驗(yàn)由特定射頻來(lái)脈沖的均一磁場(chǎng)內(nèi)的磁性原子核的環(huán)境。該脈沖干擾具有非零自旋核的那些原子的核磁化。當(dāng)系統(tǒng)恢復(fù)平衡時(shí)，檢測(cè)瞬態(tài)時(shí)域信號(hào)。將該瞬態(tài)信號(hào)的傅立葉變化為頻域獲得一維NMR光譜。這些光譜的峰代表各種活性核的化學(xué)位移。原子的化學(xué)位移由其局部電子環(huán)境來(lái)決定。二維NMR實(shí)驗(yàn)可提供有關(guān)在結(jié)構(gòu)和三維空間中各種原子接近程度的信息。通過(guò)進(jìn)行一些二維(有時(shí)是三維或四維)NMR實(shí)驗(yàn)以及使用所得信息作為系列蛋白折疊模擬中的約束因素可測(cè)定蛋白結(jié)構(gòu)。關(guān)于NMR光譜法的更多信息，包括關(guān)于如何將NMR實(shí)驗(yàn)獲得的原始數(shù)據(jù)用于測(cè)定大分子3-D結(jié)構(gòu)的詳細(xì)描述可參見(jiàn)下列文獻(xiàn)ProteinNMRSpectroscopy,PrinciplesandPractice,J.Cavanagh等人，AcademicPress,SanDiego，1996;Gronenborn等人(1990)Anal.Chem.62(1):2-15;和Wider(2000)，同上。使用上述計(jì)算機(jī)，由X射線結(jié)晶圖的數(shù)據(jù)和/或NMR數(shù)據(jù)，可使用任何可用的方法構(gòu)建所關(guān)注的GS區(qū)域的3-D模型。通過(guò)輸入設(shè)備輸入計(jì)算機(jī)的分析數(shù)據(jù)點(diǎn)和通過(guò)使用己知軟件包的處理器可構(gòu)建該模型，所述軟件包例如CATALYST(Accelrys)、INSIGHT(Accelrys)和CeriusII、HKL、MOSFILM、XDS、CCP4、SHARP、PHASES、HEAVY、XPLOR、TNT、畫RCOMPASS、畫RPIPE、DIANA、畫RDRAW、FELIX、VNMR、MADIGRAS、QUANTA、BUSTER、SOLVE、O、FRODO或CHAIN。通過(guò)計(jì)算機(jī)輸出設(shè)備，使用可利用的系統(tǒng)，可使由這些數(shù)據(jù)構(gòu)建的模型顯示出來(lái)，所述可用的系統(tǒng)例如SiliconGraphics、EvansandSutherland、SUN、HewlettPackard、AppleMacintosh、DEC、IBM或Compaq。設(shè)計(jì)本發(fā)明的化合物一旦使用上述方法中的任一種建立了結(jié)合到和/或抑制所關(guān)注GS區(qū)域(例如腺苷?；蛉ハ佘挣；腉S谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)，包括腺苷?；蛉ハ佘挣；拇呋?lián)體位點(diǎn))的化合物的3-D結(jié)構(gòu)，就可制備具有與所鑒定的化合物基本相同的3-D結(jié)構(gòu)(或包括結(jié)構(gòu)基本相同的域)的化合物。在本文中，"具有基本相同的3-D結(jié)構(gòu)"是指具有類似于所鑒定的化合物的氫鍵結(jié)合區(qū)域和疏水性特征的化合物。在有些情況下，具有與所鑒定的化合物基本相同的3-D結(jié)構(gòu)的化合物可包括具有與"谷氨酰磷酸結(jié)構(gòu)和電荷分布類似的氫鍵鍵合區(qū)域，或能與Ser52或Ser53(或除大腸桿菌之外的其它菌種得到的GS上的相應(yīng)殘基)形成酰基-酶中間體。具備上述的3-D結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)并且知道所關(guān)注區(qū)域的化學(xué)結(jié)構(gòu)(例如，對(duì)蛋白而言是氨基酸序列)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道如何制造具有上述性質(zhì)的化合物。這些方法包括化學(xué)合成法，對(duì)于蛋白而言是重組法(參照上文)。例如，可使用被適當(dāng)置于化合物內(nèi)以形成二硫鍵的半胱氨酸殘基來(lái)將化合物或化合物的域約束為適當(dāng)?shù)?-D結(jié)構(gòu)。此外，在本身是多肽或包括多肽域的化合物中，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道為了產(chǎn)生例如多肽骨架中的a-螺旋、p結(jié)構(gòu)、或轉(zhuǎn)角或彎曲，所述化合物包括何種氨基酸以及以何種序列來(lái)包含這些氨基酸。雖然基于計(jì)算機(jī)的方法不是必需的，但其可用于設(shè)計(jì)本發(fā)明的化合物。適合的計(jì)算機(jī)程序包括InsightII(Accelrys)、CATALYST(Accelrys)、LUDI(Accelrys.，SanDiego，CA)、Aladdin(DaylightChemicalInformationSystems,Irvine,CA);禾卩LEGEND[Nishibata等人(1985)J.Med.Chem.36(20):2921-2928]。本身是肽的本發(fā)明化合物也包括上述結(jié)構(gòu)，但是經(jīng)修飾后才可在體內(nèi)使用，即通過(guò)在氨基和/或羧基端添加阻斷劑以利于相關(guān)多肽在體內(nèi)的存活。這對(duì)于那些在細(xì)胞攝入之前肽末端容易被蛋白酶降解的情形很有用。該阻斷劑可以包括但不限于附加的相關(guān)的或不相關(guān)的肽序列，這些序列可被連接到將要給予的肽的氨基和/或羧基端殘基上。這可在合成肽的過(guò)程中通過(guò)化學(xué)方式來(lái)完成，或者通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的方法使用重組DNA技術(shù)來(lái)完成?；蛘?，可將阻斷劑(例如焦谷氨酸)或本領(lǐng)域已知的其它分子連接到氨基端殘基和/或羧基端殘基，或者可用不同部分來(lái)取代氨基端的氨基或羧基端的羧基。此外，在給予前，可將肽化合物共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)于藥學(xué)上可接受的"載體"蛋白。另外所關(guān)注的是，基于本發(fā)明的肽化合物的氨基酸序列而設(shè)計(jì)的擬肽化合物。擬肽化合物是具有與所選肽的三維構(gòu)象基本相同的三維構(gòu)象(即"肽基序")的合成化合物。擬肽化合物可具有增強(qiáng)其體內(nèi)效用的附加特性，例如增加細(xì)胞通透性和延長(zhǎng)生物半衰期。擬肽通常具有部分非肽的骨架或完全非肽的骨架，但是具有與其所基于的肽內(nèi)存在的氨基酸殘基的側(cè)基相同的側(cè)基。在構(gòu)建抗蛋白酶的擬肽中，本領(lǐng)域已知的幾類化學(xué)鍵通常是有用的肽鍵取代物，這些化學(xué)鍵例如酯鍵、硫酯鍵、硫代酰胺鍵、逆酰胺(retroamide)鍵、還原羰基鍵、二亞甲基鍵和酮亞甲基(ketomethylene)鍵。假設(shè)依賴于GS腺苷?；癄顟B(tài)的催化三聯(lián)體之間存在所認(rèn)為的轉(zhuǎn)換，則已知或假設(shè)為蛋白酶抑制劑，尤其是絲氨酸蛋白酶抑制劑，或該蛋白酶抑制劑的類似物的小分子、肽或擬肽化合物具有特殊意義。為了設(shè)計(jì)其它試驗(yàn)抑制劑分子，這些分子可用于本文所述的基于計(jì)算機(jī)的方法，例如作為分子對(duì)接到例如谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)或催化三聯(lián)體位點(diǎn)內(nèi)，或者這些分子可用于下文所述的治療方法、或體內(nèi)或體外抑制方法。示例性化合物包括WO99/12935、WO02/22575、WO97/46576、WO99/50263、和WO99/50257中公開(kāi)的那些化合物。已知的絲氨酸蛋白酶抑制劑包括肽基-精氨酸醛衍生物、吡咯并吡啶垸衍生物、喹啉酮衍生物或1-甲基苯并咪唑衍生物。篩選分析以下提供的是用于鑒定化合物的體外方法，所述化合物例如通過(guò)抑制腺苷?；?或去腺苷酰化GS的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)，和/或通過(guò)抑制腺苷?；蛉ハ佘挣；呋?lián)體之一或兩者的活性來(lái)抑制GS活性。因?yàn)榛钚源呋?lián)體結(jié)構(gòu)的差異，腺苷?；疓S的抑制特異性可與去腺苷?；疓S的抑制特異性不同。在篩選抑制GS的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的化合物(所述化合物包括抑制催化三聯(lián)體之一或兩者的化合物)的方法中，可將方法設(shè)計(jì)成篩選以下化合物抑制氨對(duì)GS酶反應(yīng)機(jī)理的第一步產(chǎn)生的"谷氨酰磷酸中間體進(jìn)行親核進(jìn)攻的化合物；抑制在形成谷氨酰?；?酶中間體過(guò)程中，催化三聯(lián)體的活化絲氨酸對(duì)"谷氨酰磷酸進(jìn)攻的化合物；或抑制氨對(duì)谷氨酰-?；虚g體進(jìn)行親核進(jìn)攻的化合物。例如，在一個(gè)方法中，在對(duì)谷氨酰胺形成有效的特定分析條件下，可使GS多肽與試驗(yàn)化合物接觸。通常使用抑制劑在下列條件下對(duì)谷氨酰胺合成酶多肽進(jìn)行檢測(cè)對(duì)于腺苷酰化形式的酶，在溶解于10mM咪唑-HCl緩沖溶液(pH6.3)中的濃度為0.6mMATP、1.8mMMnCl2、7.2mMNaHC03、4mM谷氨酸和4mMNH4Cl的溶液中進(jìn)行；對(duì)于去腺苷?；问降拿?，在溶解于10mM咪唑-HCl緩沖溶液(pH7.2)中的0.6mMATP、0.6mMMgCl2、4mM谷氨酸、4mMNH4C1的溶液進(jìn)行。所有的分析在37。C下進(jìn)行。對(duì)腺苷?；疓S的分析法與對(duì)去腺苷酰化GS的分析法不同。可在pH6.3和HC(V:Mn2+:ATP的濃度比為12:3:1的條件下分析腺苷?；疓S，而在pH7.2和Mg^:ATP的濃度比為1:1的條件下分析去腺苷?；疓S。腺苷酰化GS的典型分析條件為20mM咪唑緩沖液(pH6.3)、lmMATP、3mMMnCl2、12mMNaHC03和2mM谷氨酸鈉；去腺苷?；疓S的典型分析條件為20mM咪唑緩沖液(pH7.2)、lmMATP、lmMMgCl2、12mMNaCl和2mM谷氨酸鈉。上述分析可在37°C下進(jìn)行。可在試驗(yàn)化合物存在和不存在的條件下測(cè)量ATP的水解、ADP的產(chǎn)生和/或谷氨酸的利用和谷氨酰胺的產(chǎn)生。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，一種體外篩選試驗(yàn)化合物以確定其是否抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)活性的方法，包括-(a)在對(duì)谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)產(chǎn)生活性有效的條件下，使谷氨酰胺合成酶多肽(例如腺苷?；腉S或去腺苷酰化的GS)與試驗(yàn)化合物接觸；以及(b)確定相對(duì)于還沒(méi)有與試驗(yàn)化合物接觸過(guò)的谷氨酰胺合成酶多肽的活性，所述谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的活性是否有所降低。如本文所述，可通過(guò)谷氨酰酰基-酶中間體來(lái)調(diào)節(jié)谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的活性。如果使用腺苷酰化的GS多肽，可以使任何抑制活性與試驗(yàn)化合物抑制去腺苷酰化谷氨酰胺合成酶所獲得的抑制相比較，反之亦然?；衔锖退幬锝M合物本文還提供化合物，例如，本文所述的藥物組合物所包含的化合物和/或用于本文所述方法中的化合物。如本文和以下實(shí)施例中所示的那樣，基于GS的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)信息和機(jī)理信息，如上所述，可篩選已知的蛋白酶抑制劑包括已知的絲氨酸蛋白酶抑制劑的GS抑制活性。在有些實(shí)施方式中，可類似地篩選欲評(píng)價(jià)其蛋白酶抑制活性的化合物，也就是本文所指的"試驗(yàn)"蛋白酶抑制劑。例如，可篩選試驗(yàn)蛋白酶抑制劑的文庫(kù)，例如試驗(yàn)絲氨酸蛋白酶抑制劑的文庫(kù)。然后，具有適合抑制活性的化合物可用于治療、預(yù)防或改善與哺乳動(dòng)物的細(xì)菌感染有關(guān)的一種或多種癥狀。在WO99/12935、WO02/22575、WO97/46576、WO99/50263和WO99/50257中記載了有用的絲氨酸蛋白酶抑制劑。藥物組合物的配制本文提供的藥物組合物含有治療有效量的一種或多種化合物以及藥學(xué)上可接受的載體，所述化合物例如絲氨酸蛋白酶抑制劑用于治療、預(yù)防或改善與細(xì)菌感染(例如含有GSI-P基因的細(xì)菌，例如結(jié)核分枝桿菌；或含有GSI-a基因的細(xì)菌，例如炭疽芽孢桿菌)有關(guān)的一種或多種癥狀，或與細(xì)菌感染有關(guān)的障礙、病癥或失調(diào)。適于給予本文提供的化合物的藥物載體包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適于特定給予方式的任何載體。此外，可將所述化合物作為單一藥學(xué)活性成分而配制成的組合物或與其它活性成分組合。例如，所述化合物可以進(jìn)行配制或與已知的抗菌化合物、抗炎癥化合物、類固醇類和/或抗病毒劑類組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，將所述化合物配制成合適的藥物制劑，例如用于口服給藥的溶液劑、混懸劑、片劑、分散片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、緩釋劑或酏劑，或用于胃腸外給藥的無(wú)菌溶液或混懸液形式，以及透皮貼劑和干粉吸入劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)和工藝，將上述化合物配制成藥物組合物(參見(jiàn)例如AnselIntroductiontoPharmaceuticalDosageForms,第四版，1985，126)。在這些組合物中，將有效濃度的一種或多種化合物或其藥學(xué)上可接受的衍生物與適當(dāng)?shù)乃幬镙d體混合。如上所述，在配制前，可將化合物衍生為相應(yīng)的鹽、酯、烯醇醚或烯醇酯、縮醛、縮酮、原酸酯、半縮醛、半縮酮、酸、堿、溶劑合物、水合物或前體藥物。組合物中化合物的濃度為給予后的輸送量對(duì)治療、預(yù)防或改善一種或多種細(xì)菌感染癥狀有效。在一個(gè)實(shí)施方式中，將組合物配制為單劑量給予。為配制組合物，將重量分?jǐn)?shù)的化合物以有效濃度溶解、混懸、分散于所選的載體中或以另外的方式混合于所選的載體中，使所治療的病癥得到緩解或一種或多種癥狀得到改善?；钚曰衔镆猿渥愕挠昧堪谒帉W(xué)上可接受的載體中，從而對(duì)治療的患者在無(wú)不利副作用的條件下發(fā)揮治療的有益作用。可通過(guò)體外系統(tǒng)、間接體內(nèi)(exvivo)系統(tǒng)和體內(nèi)系統(tǒng)測(cè)試該化合物，經(jīng)驗(yàn)性地確定治療有效濃度，然后由此推斷用于人的劑量。藥物組合物中活性化合物的濃度將取決于活性化合物的吸收率、失活率和排泄率、化合物的物化特性、劑量安排(dosageschedule)、給予量以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。制備藥物的單元型制劑(dosageunitforms),使每單元型制劑含有約(O.Olmg、O.lmg或lmg)至約(500mg、lOOOmg或2000mg)的活性成分或基本成分的組合，在一個(gè)實(shí)施方式中，為約lOmg-約500mg?？梢淮涡越o予活性成分，或可分成多個(gè)小劑量在時(shí)間間隔內(nèi)給予?？梢岳斫獾氖?，精確的劑量和治療周期與所治療的障礙有密切關(guān)系，并且可使用已知的試驗(yàn)技術(shù)或通過(guò)體內(nèi)或體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行推斷來(lái)進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性地確定。應(yīng)該注意的是濃度和劑量值還可隨待減輕病癥的嚴(yán)重程度而改變。還應(yīng)該理解的是對(duì)于任何特定的受試者，根據(jù)個(gè)人需要以及給予組合物或監(jiān)督組合物給予的人士的專業(yè)判斷，應(yīng)該隨時(shí)間調(diào)整特定的劑量方案，并且本文提出的濃度范圍只是示例性的并無(wú)意限制所要求保護(hù)的組合物的范圍和實(shí)施。對(duì)于化合物顯示溶解度不足的情況，可使用溶解化合物的方法。該方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括使用助溶劑，例如二甲基亞砜(DMSO);使用表面活性劑，例如TWEEN85或溶于碳酸氫鈉水溶液，但不限于此。還可使用化合物的衍生物，例如化合物的前體藥物配制有效的藥物組合物?；衔锘旌匣蛱砑雍?，所得混合物可以是溶液、混懸液、乳液等。所得混合物的形式依賴于一些因素，包括所期望的給予方式和化合物在所選載體或賦形劑中的溶解度。有效濃度足以改善疾病癥狀、障礙或治療的病癥，并且可經(jīng)驗(yàn)性地確定該有效濃度?？梢园凑諉卧椭苿┑男问较蛉撕蛣?dòng)物給予所述藥物組合物，所述單元型制劑例如含有適量的化合物或其藥學(xué)上可接受的衍生物的片劑、膠囊劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、無(wú)菌的胃腸外溶液劑或混懸劑和口服液劑或混懸劑以及油-水乳液。在一個(gè)實(shí)施方式中，以單劑量形式(unit-dosageforms)或多劑量形式(multiple-dosageform)配制和給予藥學(xué)上具有治療活性的化合物及其衍生物。如本領(lǐng)域所知，本文所用的單劑量形式是指適于人和動(dòng)物受試者并單獨(dú)包裝的物理離散單元。每個(gè)單劑量形式含有預(yù)定量的具有治療活性的化合物，結(jié)合所需要的藥物載體、賦形劑或稀釋劑，足以產(chǎn)生所希望的治療效果。單劑量形式的例子包括安瓿和注射器以及單獨(dú)包裝的片劑或膠囊劑?？刹糠只虺杀兜亟o予單劑量形式。多劑量形式是包裝在單一容器內(nèi)的多個(gè)相同的單劑量形式，從而以分隔的多劑量形式給予。多劑量形式的例子包括片劑或膠囊劑的瓶、小瓶或以品脫或加侖裝的瓶。因此，多劑量形式是在包裝中不分隔的多個(gè)單劑量形式。藥學(xué)上可給予的液體組合物可以例如通過(guò)在載體中溶解、分散或以另外的方式混合如上定義的活性化合物和可選的藥用輔料來(lái)制備，由此形成溶液劑或混懸劑，所述載體例如水、鹽水、右旋糖水溶液、甘油、乙二醇、乙醇等。若需要，欲給予的藥物組合物還可含有少量的無(wú)毒助劑，例如潤(rùn)濕劑、乳化劑、增溶劑、pH緩沖劑等，例如醋酸鹽、檸檬酸鈉、環(huán)糊精衍生物、失水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺、醋酸鈉、油酸合三乙醇胺以及其它此類試劑。制備該劑型的現(xiàn)行方法已為或?qū)楸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員所知；例如，參見(jiàn)Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton，Pa.，第十五版，1975?？芍苽渑c無(wú)毒載體平衡的含有0.005%-100%的活性成分的劑型或組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知制備這些組合物的方法。預(yù)期的組合物可含有0.001%-100%的活性成分，或者在一個(gè)實(shí)施方式中為含有0.1-95%的活性成分。帝!j品可將化合物或藥學(xué)上可接受的衍生物包裝成制品(例如試劑盒)，所述制品含有包裝材料、位于包裝材料內(nèi)的本文提供的化合物或其藥學(xué)上可接受的衍生物以及標(biāo)簽，所述標(biāo)簽顯示化合物或組合物、或其藥學(xué)上可接受的衍生物用于治療、預(yù)防或改善與細(xì)菌感染包括結(jié)核分枝桿菌感染有關(guān)的一種或多種癥狀或障礙。本文提供的制品含有包裝材料。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已熟知用于包裝藥品的包裝材料。參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5，323，907、5,052,558和5,033,252。藥物包裝材料的例子包括泡罩包裝(blisterpacks)、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器和適于所選配方和希望的給予方式和治療方式的任何包裝材料，但不限于此?；衔锏幕钚栽u(píng)價(jià)本文提供的作為GS活性(例如腺苷酰化GS的活性、去腺苷酰化GS的活性、谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的活性或一個(gè)或多個(gè)催化三聯(lián)體的活性)抑制劑的化合物的活性，和/或作為治療、預(yù)防或改善與細(xì)菌感染(例如結(jié)核分枝桿菌感染)有關(guān)的一種或多種癥狀、病癥或障礙的化合物的活性，均可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分析法來(lái)測(cè)量或評(píng)價(jià)。酶抑制法(例如，谷氨酰轉(zhuǎn)移酶法、ATP水解法、ADP形成以及谷氨酸利用和谷氨酰胺形成法)、細(xì)菌例如結(jié)核分支桿菌的生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞的細(xì)胞保護(hù)、存活以及細(xì)胞毒性分析，所有這些均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知和/或如下文所述?；衔锖徒M合物的使用方法使用本文所述的化合物和組合物可以實(shí)施體外或體內(nèi)方法。本發(fā)明化合物的體外應(yīng)用可用于例如GS反應(yīng)機(jī)理的基礎(chǔ)科學(xué)研究、或用于治療、預(yù)防、減弱或抑制細(xì)菌污染或感染、或用于抑制GS的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的體外方法。該化合物還可用作體內(nèi)治療試劑以治療細(xì)菌感染，包括病原菌或機(jī)會(huì)致病菌的感染。尤其是，該化合物可用作治療試劑以治療由GSI-p細(xì)菌引起的感染或由GSI-a細(xì)菌引起的感染，所述GSI-p細(xì)菌例如白喉棒狀桿菌、淋球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌、傷寒沙門氏桿菌、肺炎克雷伯菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、普通變形桿菌、痢疾志賀菌、霍亂弧菌、銅綠假單孢菌、糞產(chǎn)堿桿菌、幽門螺桿菌、流感嗜血桿菌、百日咳桿菌、支氣管炎博德特菌、腦膜炎奈瑟菌、羊布魯氏菌、結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、梅毒密螺旋體、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體、衣氏放線菌、星形諾卡菌、氧化亞鐵硫桿菌、巴西固氮螺菌、魚(yú)腥藻、Fremyelladiplosiphon和天藍(lán)色鏈霉菌，所述GSI-a細(xì)菌例如蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、破傷風(fēng)梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌。該化合物可用于預(yù)防和/或治療涉及細(xì)胞內(nèi)微生物(即在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的感染性因子)，例如細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌(例如結(jié)核分支桿菌)的疾病。本發(fā)明方法可用于范圍的物種，例如哺乳動(dòng)物例如人、非人靈長(zhǎng)類例如猴子、馬、牛、豬、綿羊、山羊、狗、貓、兔、豚鼠、倉(cāng)鼠、大鼠和小鼠。因?yàn)榧?xì)菌的GSI-l3酶通過(guò)腺苷?；?去腺苷酰化級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)，而哺乳動(dòng)物的GSII酶卻不是這樣，并且本文的某些抑制劑被假設(shè)選擇性地靶向腺苷?；腉S，所以該化合物和組合物可用于選擇性地抑制細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)而最低限度地對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響。在一種體內(nèi)方法中，可將本文所述的化合物或藥物組合物給予受試者，例如哺乳動(dòng)物，例如懷疑遭受細(xì)菌感染或正在遭受細(xì)菌感染的哺乳動(dòng)物。通常，將本發(fā)明化合物混懸于藥學(xué)上可接受的載體(例如生理鹽水)中，并經(jīng)口服給予、或經(jīng)皮給予、或進(jìn)行靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸內(nèi)、葉鞘內(nèi)、鼻內(nèi)、胃內(nèi)、氣管內(nèi)或肺內(nèi)注射(或輸注)。可將它們直接輸送到適當(dāng)?shù)氖芗膊∏忠u的組織。所用的抑制性化合物和輔助藥劑的劑量依賴于給予途徑的選擇；制劑的性質(zhì)；患者疾病的性質(zhì)；受試者的體型、體重、表面積、年齡和性別；給予的其它藥物；以及主治醫(yī)師的判斷。適合的劑量通常為0.0001-100.0mg/kg?？紤]到可用的化合物和輔助藥劑的種類以及各種給予途徑的不同效率，預(yù)計(jì)所需劑量會(huì)有很大變化。例如，預(yù)計(jì)口服給予比靜脈注射給予需要更大的劑量。這些劑量水平的變化可使用本領(lǐng)域熟知的用于優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)常規(guī)方式來(lái)調(diào)節(jié)?？梢詥蝿┬突蚨鄤┬?例如2倍、3倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、50倍、100倍、150倍或更多倍)的形式給予化合物和/或輔助藥劑。實(shí)施例實(shí)施例l由結(jié)構(gòu)和分子動(dòng)力學(xué)研究鑒定催化三聯(lián)體對(duì)來(lái)自大腸桿菌的谷氨酰胺合成酶活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和分子動(dòng)力學(xué)分析使兩個(gè)類蛋白酶催化三聯(lián)體得以鑒定。來(lái)源于GSI-a和GSI-p種的GS序列的DNAMAN序列比對(duì)顯示構(gòu)成催化三聯(lián)體的假設(shè)的氨基酸殘基在所有種中均是保守的。使用INSIGHTII成套軟件的DISCOVER_3進(jìn)行能量最小化，然后使用該能量最小化設(shè)法對(duì)構(gòu)成每個(gè)活性位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行分組并確認(rèn)由定點(diǎn)突變獲得的發(fā)現(xiàn)。對(duì)已變?yōu)槎垠w的GS分子進(jìn)行能量最小化以確保獲得完整的活性位點(diǎn)，但卻要減少原子總數(shù)以方便計(jì)算。原核微生物GS蛋白序列的高度保守促進(jìn)了大腸桿菌谷氨酰胺合成酶的分子模擬操作。所用的晶體結(jié)構(gòu)模型為由Brookhaven蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的lf52.pdb(Gi11HS和DEisenberg(2001)Biochemistry7:1903-1912)。該二聚體還是手動(dòng)腺苷?；?。在兩個(gè)亞基界面處存在的谷氨酰胺合成酶的活性位點(diǎn)內(nèi)，發(fā)現(xiàn)一簇絲氨酸和組氨酸殘基。這些殘基是Ser52、Ser53、His210和His211(使用大腸桿菌殘基編號(hào))。使假設(shè)的催化三聯(lián)體完整所需的一些酸性殘基Asp50、Glul29、Glu327和Glu357也位于活性位點(diǎn)內(nèi)。因此，認(rèn)為所提出的催化三聯(lián)體包括來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立亞基(指定為A和B)的下列殘基<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的那樣，可使用一些已知技術(shù)例如分子模擬和/或同源性比對(duì)，以及所提出的催化三聯(lián)體機(jī)理的知識(shí)來(lái)測(cè)定來(lái)自大腸桿菌以外其它種的GS的相應(yīng)殘基。實(shí)施例2定點(diǎn)突變和突變基因的表達(dá)對(duì)來(lái)自大腸桿菌的谷氨酰胺合成酶活性位點(diǎn)的分子模擬使兩個(gè)類蛋白酶催化三聯(lián)體得以鑒定。為了考察這些殘基對(duì)調(diào)節(jié)來(lái)自大腸桿菌的谷氨酰胺合成酶方面所起的作用，使用定點(diǎn)突變(SDM)特異性地耙向這些殘基，隨后評(píng)價(jià)改變這些殘基對(duì)谷氨酰胺合成酶催化活性的影響。兩個(gè)不同的系統(tǒng)用于SDM。第一個(gè)系統(tǒng)是Promega的AlteredSitesII體外突變系統(tǒng)，而第二個(gè)系統(tǒng)是來(lái)自于Stratagene的QuikChangeXL定點(diǎn)突變系統(tǒng)。因?yàn)锳lteredSitesTM系統(tǒng)提供用于產(chǎn)生和選擇寡核苷酸介導(dǎo)的突變株的高效步驟，所以使用該系統(tǒng)進(jìn)行大多數(shù)的突變。該系統(tǒng)允許雙鏈模板DNA的突變，并且無(wú)需亞克隆即允許連續(xù)多輪突變(sequentialroundsofmutagenesis)。該程序使用抗生素選擇作為獲得高頻突變株的方式。載體含有兩種抗生素抗性標(biāo)記物有活性的四環(huán)素抗性標(biāo)記物和無(wú)活性的氨節(jié)青霉素抗性標(biāo)記物。試劑盒中提供了恢復(fù)和敲除兩種標(biāo)記物的寡核苷酸。在第一輪突變期間，四環(huán)素抗性基因失活而氨芐青霉素抗性恢復(fù)。倘若第二輪突變需要在第一輪突變產(chǎn)生的突變株上進(jìn)行，那么氨芐青霉素抗性基因?qū)⒂质セ钚远沫h(huán)素抗性恢復(fù)。因此，很容易進(jìn)行多輪突變，而突變株的收率有所提高。因?yàn)樯贁?shù)突變不能使用該系統(tǒng)獲得，所以使用Stratagene的QuikChange，系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于聚合酶鏈反應(yīng)的步驟，該步驟可用于將突變引入幾乎所有的載體中。該基本步驟利用含有所關(guān)注的插入物的超螺旋雙鏈載體以及含有所希望的突變的兩種合成的互補(bǔ)寡核苷酸引物。每個(gè)互補(bǔ)于載體相反鏈的引物在使用戶/"7W"60DNA聚合酶的溫度循環(huán)期間延伸。寡核苷酸引物的引入產(chǎn)生了含有交錯(cuò)切口的突變質(zhì)粒。溫度循環(huán)以后，用Z^"I處理產(chǎn)物。該限制性內(nèi)切酶對(duì)甲基化和半甲基化DNA特異并酶切親代DNA模板，由此選擇用于含有突變的合成DNA。然后，引入所希望突變的帶切口的載體DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主菌株中，隨后可篩選單菌落用于突變。在設(shè)計(jì)的所有寡核苷酸引物中均發(fā)生沉默突變，允許引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)以利于篩選突變基因。因此無(wú)需進(jìn)行一一測(cè)序即可簡(jiǎn)單、快速地為每個(gè)突變反應(yīng)篩選所得的一些菌落。突變一經(jīng)完成，就在大腸桿菌谷氨酰胺合成酶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株內(nèi)表達(dá)每個(gè)突變基因。因?yàn)橥ㄟ^(guò)將AMP基共價(jià)添附到酶每個(gè)亞基中的酪氨酸殘基上以調(diào)節(jié)谷氨酰胺合成酶的催化活性，所以提出為了生成人工合成的去腺苷酰化形式的酶，首先將酪氨酸397殘基(腺苷?；稽c(diǎn))改變?yōu)槔i氨酸397。然后在腺苷酰化和去腺苷?；问降拿钢袡z驗(yàn)每個(gè)突變。表1示出了其它靶向殘基及變化的總結(jié)。表l.產(chǎn)生的氨基酸變化以顯示催化三聯(lián)體存在的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>材料和方法除非另有說(shuō)明，將所有大腸桿菌培養(yǎng)物保持在LM培養(yǎng)基(5g/lNaCl、10g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨；pH7.2)上。若需要，則添加濃度為15g/l的瓊脂。對(duì)于pAlter-l，用50fig/ml氨芐青霉素或12.5嗎/ml四環(huán)素補(bǔ)充培養(yǎng)基，而對(duì)于pBluescriptlISK+,用100pg/ml氨芐青霉素補(bǔ)充。表2列出了本研究中所用的菌株和質(zhì)粒。表2.使用的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>使用QiaPrepSpinMiniprep試劑盒(Qiagen)或通過(guò)堿裂解法(Sambrook,J.，F(xiàn)ritsch,.E.F.和T.Maniatis(1989)In:MolecularCloning:ALaboratoryManual.,第二版.ColdSpringHaborLaboratoryLaboratoryPress)小規(guī)模分離DNA。使用QiagenMidiDNA分離試劑盒(Qiagen)來(lái)完成大規(guī)模DNA分離。使用購(gòu)自AmershamBiosciences的限制性內(nèi)切酶并按照廠商說(shuō)明來(lái)進(jìn)行DNA酶切。堿性磷酸酶來(lái)自AmershamBiosciences。T4DNA連接酶來(lái)自Promega并按照該酶提供的方案來(lái)使用。用于DNA電泳的瓊脂糖為分子生物學(xué)級(jí)。7bg聚合酶(r7bg)來(lái)自TaKaRaBioInc.并用于一般篩選。高忠實(shí)性的ra《聚合酶(Ex7b《)也來(lái)自TaKaRaBioInc.并用于擴(kuò)增用來(lái)克隆的基因。使用標(biāo)準(zhǔn)步驟(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和T.Maniatis(1989)In:MolecularCloning:ALaboratoryManual.,第二版.ColdSpringHaborLaboratoryPress1989)進(jìn)行限制性酶切和瓊脂糖凝膠電泳。lkbDNA梯狀條帶用于所有電泳。按照每個(gè)試劑盒提供的方案，使用來(lái)自Promega公司的AlteredSitesTM體外突變?cè)噭┖?，或?lái)自Stratagene的QuikChangeXL定點(diǎn)突變?cè)噭┖羞M(jìn)行定點(diǎn)突變。所有的化學(xué)品為分析級(jí)或分子生物學(xué)級(jí)，并且無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用。除非另有說(shuō)明，所有化學(xué)品來(lái)自Merck或Sigma。大腸桿菌谷氨酰胺合成酶基因的克隆將引物設(shè)計(jì)到由Genbank(登錄號(hào)X05173)獲得的大腸桿菌glnA基因序列。將引物設(shè)計(jì)成在5'端帶有Nsil限制酶切位點(diǎn)(黑體字示出的)。以下示出了該引物5'引物5'-GATATGCATCCGTCAAATGCG-S'(SEQIDNO:1)3'引物5'-GCGATGCATAAAGTTTCCACGG-3'(SEQIDNO:2)使用pGLn6的DNA為模板以及上述引物來(lái)進(jìn)行PCR。PCR混合物含有1^1質(zhì)粒DNA(50ng)、5pl每種引物(2.5pmol/nl)、化l2.5mMdNTP、含有20mMMgCl2的5^110X緩沖液和0.5^1高忠實(shí)性的化《聚合酶(2.5個(gè)單位)。按如下步驟進(jìn)行PCR，即先對(duì)模板DNA在95°C下預(yù)變性5分鐘，隨后在95°C下變性5分鐘、55。C下退火1分鐘以及72°C下延伸2分鐘，共進(jìn)行30個(gè)這樣的循環(huán)。將72°C下進(jìn)行10分鐘的最后延伸步驟也加入過(guò)程中。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以驗(yàn)證PCR產(chǎn)生的片段長(zhǎng)度。使用高純PCR純化試劑盒(RocheDiagnostics)純化PCR產(chǎn)物，并使用Nsil對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行酶切。為構(gòu)建使用AlteredSites系統(tǒng)進(jìn)行SDM的模板，用尸Wl對(duì)pAlter-1線性化并在連接前去磷酸化。以插入物:載體比為3:1連接插入物和載體。按照廠商說(shuō)明，使用Bio-Rad基因脈沖儀通過(guò)電穿孔將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中。在補(bǔ)充有12.5ng/ml四環(huán)素、80ng/mlX-Gal和ImMIPTG的LM瓊脂培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化株。隨后通過(guò)使用堿裂解法分離DNA、然后酶切并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來(lái)篩選由轉(zhuǎn)化平板上獲得的幾種白色菌落。進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)大腸桿菌glnA基因的存在及其序列。除了使用M13/F和M13/R通用引物外，還由已知的基因序列設(shè)計(jì)基因特異性內(nèi)引物。表3示出了這些引物。表3.對(duì)克隆的大腸桿菌glnA基因進(jìn)行測(cè)序使用的序列特異性引物艦引物序列GlnSeq15'-GCTGAACACGTACTGACGATG-3'(SEQDDNO:3)GlnSeq25，-GTGGGAACCGGAGATAGATGATC-3'(SEQIDNO:4)GlnSeq35，-CGATGTTCGGTGATAACGGCTC-3'(SEQIDNO:5)GlnSeq45,-CGTACTTCGATACGACGTGCTTTC-3'(SEQIDNO:6)為使用QuikChange頂系統(tǒng)構(gòu)建用于SDM的模板，由pAlter構(gòu)建體亞克隆谷氨酰胺合成酶基因作為片段。用手術(shù)刀片將含有g(shù)lnA基因的條帶從凝膠上切下來(lái)，通過(guò)2ml的注射器推入Eppendorf管從而粉碎瓊脂糖。將lml苯酚(平衡至pH8.0)加入該管，然后將混懸液渦旋1分鐘。在-70。C下冷凍樣品至少30分鐘。樣品一解凍，就將其在Eppendorf微量離心機(jī)中以13000rpm離心15分鐘。將水相移至潔凈管，然后用苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)提取一次，接著用氯仿:異戊醇(24:1)提取一次。用乙醇將DNA沉淀并重懸于TE緩沖液。然后將該片段以插入物:載體比為3:1連接到pBluescriptIISK+中，再用Sacl和進(jìn)行酶切。將該連接反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue中，并在含有100pg/ml氨芐青霉素的LM瓊脂平板上進(jìn)行平板培養(yǎng)。通過(guò)堿裂解法分離質(zhì)粒DNA、使用S"mHI酶切DNA以及隨后使用瓊脂糖凝膠電泳分析這些片段來(lái)篩選單轉(zhuǎn)化體菌落(singletransformantcolonies)o定點(diǎn)突變(SDM)使用QiagenMidiPrep試劑盒由大腸桿菌JM109分離pAlter-1中的野生型glnA基因的DNA。表4列出了使用該系統(tǒng)進(jìn)行g(shù)lnA基因突變所設(shè)計(jì)的寡核苷酸。將引入限制酶切位點(diǎn)以利于突變初級(jí)篩選的沉默突變構(gòu)建到SDM寡核苷酸中。這些也顯示在表4中。表4.使用AlteredSitesTM系統(tǒng)進(jìn)行的大腸桿菌glnA基因的突變。改變氨基酸殘基的突變以黑體字示出，限制酶切位點(diǎn)以下劃線標(biāo)出。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>突變發(fā)生后，為所選擇的突變篩選單菌落，所述篩選通過(guò)從過(guò)夜培養(yǎng)液中分離DNA，并且使用所篩選的特定突變的酶進(jìn)行限制酶切分析。突變基因的表達(dá)通過(guò)使用S"cl和進(jìn)行酶切，由pAlter-l克隆體分離突變基因。然后對(duì)酶切下來(lái)的物質(zhì)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以分離載體和插入物條帶。如上所述，將含有基因的條帶從凝膠上切下來(lái)并使用苯酚提取DNA。用Sad和///m/III酶切pBluescriptIISK+，然后以插入物:載體為3:1將每個(gè)突變基因連接到載體中。將連接反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化到谷氨酰胺合成酶營(yíng)養(yǎng)缺陷株大腸桿菌YMC11中，并且在補(bǔ)充有50ng/ml氨芐青霉素的LM瓊脂培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化株。通過(guò)使用M13/F和M13/R通用引物的PCR，對(duì)在轉(zhuǎn)化平板上獲得的單菌落實(shí)施篩選步驟。在該步驟中，將單菌落重懸于20]al蒸餾水中。將1^1該菌落混懸液加入PCR反應(yīng)體系中，所述的PCR反應(yīng)體系含有2.5^1每種引物(2.5pmol/nl)、22.5mMdNTP、2.5nllOX緩沖液、2^125mMMgCl2和0.1pl7i^聚合酶(0.5u)。如上所述進(jìn)行PCR循環(huán)。隨后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，并且基于正確的條帶大小選擇陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體。將陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照引入該步驟以驗(yàn)證獲得的結(jié)果。突變的確認(rèn)由外部機(jī)構(gòu)進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)每個(gè)突變。為此目的，由已知的基因序列來(lái)設(shè)計(jì)正向和反向的基因特異性引物。這些示于表5中。表5.用于確認(rèn)大腸桿菌glnA基因中各種突變的存在所使用的序列特異性引物QuikChangeTM突變<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>QuikChangeTM突變使用QiagenMidiPrep試劑盒將所選模板的DNA(pBluescript構(gòu)建體)從大腸桿菌XL1-Blue中分離出來(lái)。表6列出了使用該系統(tǒng)進(jìn)行SDM所設(shè)計(jì)的寡核苷酸。因?yàn)檫@是基于PCR的系統(tǒng)，所以每個(gè)反應(yīng)需要兩種寡核苷酸(正義的和反義的)。表6.使用QuikChangeTM系統(tǒng)進(jìn)行的大腸桿菌glnA基因的突變。改變氨基酸殘基的突變以黑體字示出，限制酶切位點(diǎn)以下劃線標(biāo)出。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>突變發(fā)生后，為所選擇的突變篩選單菌落，所述篩選通過(guò)從過(guò)夜培養(yǎng)液中分離DNA，并且使用所篩選的特定突變的酶進(jìn)行限制酶切分析。使用QuikChange系統(tǒng)將獲得的正突變株轉(zhuǎn)化到大腸桿菌YMC11中用于表達(dá)。由外部機(jī)構(gòu)進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)每個(gè)突變。使用GlnSeq5和GlnSeq6對(duì)D50A和E129A進(jìn)行測(cè)序。使用GlnSeq9和GlnSeq10對(duì)E357A進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果大腸桿菌谷氨酰胺合成酶基因的克隆將大腸桿菌野生型glnA基因擴(kuò)增為2.1kb片段，編碼長(zhǎng)度為471個(gè)氨基酸的蛋白。以插入物:載體為3:1將含有A^'i側(cè)翼限制酶切位點(diǎn)的2124bp的PCR擴(kuò)增的glnA基因連接到尸M酶切的SDM載體pAlter-l中。從一些轉(zhuǎn)化體中分離DNA并使用5amHI和五coRI進(jìn)行限制酶切分析。根據(jù)基因和載體的已知序列，用5"mHI對(duì)構(gòu)建體(在所需的正確的5'端至3'端取向上帶有該glnA基因)進(jìn)行限制酶切，會(huì)產(chǎn)生6012bp和1797bp的片段。以這種方式鑒定了正確的構(gòu)建體，并命名為pGln12。為構(gòu)建使用QuikChange系統(tǒng)進(jìn)行突變的野生型模板，將glnA基因從pGlnl2切下來(lái)作為SacI-iy/"dII片段，并以插入物:載體為3:1將其連接到經(jīng)過(guò)類似酶切的pBluescriptIISK+中。將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue中，并在補(bǔ)充有100ng/ml氨節(jié)青霉素、80嗎/mlX-Gal和lmMIPTG的LM瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)。為了鑒定出陽(yáng)性亞克隆株，從一些白色菌落中分離DNA并用Sacl、///"JIII和5amHI對(duì)其進(jìn)行限制酶切分析。以這種方式鑒定正確的構(gòu)建體并將其命名為pBSK-ECgln。在進(jìn)行任何SDM之前，對(duì)兩個(gè)克隆體進(jìn)行序列分析以驗(yàn)證野生型基因的完整性。定點(diǎn)突變(SDM)AlteredSites頂系統(tǒng)按照上述方案進(jìn)行定點(diǎn)突變。使用對(duì)突變特異的酶對(duì)從突變體分離出來(lái)的DNA進(jìn)行酶切，并且進(jìn)行大小分級(jí)(size-fractionated)以確認(rèn)存在突變。由于加入限制酶切位點(diǎn)，突變的存在通常產(chǎn)生額外的片段。在任何情況下，使用相同的酶對(duì)野生型構(gòu)建體(pGlnl2)進(jìn)行酶切作為對(duì)比對(duì)照。帶有各自引入的限制酶切位點(diǎn)和所期望的片段長(zhǎng)度的突變?nèi)绫?所列。表7.使用AlteredSitesTM系統(tǒng)引入pGlnl2中的突變的列表，顯示出所期望的限制性片段突變引入的限制酶切位點(diǎn)限制性片段(bp)有突變無(wú)突變Y397V591818917809S52Aa。i609517147809S53A601293586260121797S52AS53APvwl54201352103764571352'H210V443914781189703443918921478H211VPvmII3047225414931015304725082254E327V69268837809由于得到所期望的DNA片段長(zhǎng)度，瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)存在突變。這9個(gè)單突變一經(jīng)確認(rèn)，就產(chǎn)生雙突變體。在每種情況下，將Y397V突變體加入S52A、S53A、S52AS53A、H210V和H211V中的每一個(gè)中，分別產(chǎn)生S52AY397V、S53AY397V、S52AS53AY397V、H210VY397V和H211VY397V。帶有各自引入的限制酶切位點(diǎn)和所期望的片段長(zhǎng)度的突變?nèi)绫?所列。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>由于得到所期望的DNA片段長(zhǎng)度，瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)存在突變。突變基因的表達(dá)將突變基因(來(lái)自pAlter)亞克隆到pBluescriptlISK+中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌YMCll中，以促進(jìn)蛋白純化和酶研究。通過(guò)PCR篩選確認(rèn)亞克隆基因存在于載體中。經(jīng)檢測(cè)，含有突變glnA基因的轉(zhuǎn)化株菌落為瓊脂糖凝膠上的2170bp條帶。PCR篩選中包括由轉(zhuǎn)化到大腸桿菌YMCll中的載體組成的陰性對(duì)照，并且該陰性對(duì)照作為條帶呈現(xiàn)于凝膠上，該條帶具有載體多克隆位點(diǎn)的大小。PCR篩選還包括也在大腸桿菌YMC11中的pBSK-ECglnDNA的陽(yáng)性對(duì)照。其作為條帶呈現(xiàn)于凝膠上，與任何陽(yáng)性突變亞克隆體的大小相同。然后用對(duì)突變特異的限制性內(nèi)切酶對(duì)以這種方式鑒定的來(lái)自每個(gè)突變體的單亞克隆體的DNA進(jìn)行酶切，以確認(rèn)存在特異性突變。表9.突變glnA亞克隆體所期望的限制性片段的列表<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>由于得到期望的DNA片段長(zhǎng)度，瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)亞克隆體內(nèi)存在突變。QuikChange頂突變按照如上所述的方案，使用QuikChangeTM系統(tǒng)進(jìn)行SDM。從可能的突變體中分離DNA,使用對(duì)突變特異的酶對(duì)DNA進(jìn)行酶切，并且進(jìn)行大小分級(jí)以確認(rèn)存在突變。使用相同的酶對(duì)由親代模板組成的對(duì)照進(jìn)行酶切作為對(duì)比對(duì)照。帶有各自的限制酶切位點(diǎn)和所期望的片段長(zhǎng)度的突變?nèi)绫?0所列。pBSK-ECgln作為模板用于D50A、E129A、E327V和E357A突變。在pBSK-Y397V內(nèi)產(chǎn)生雙突變體D50AY397V、E129AY397V、E327VY397V和E357AY397V。表10.使用QuikChange系統(tǒng)引入到各模板中的突變的列表，顯示所期望的限制性片段<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>由于得到所期望的DNA片段長(zhǎng)度，瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)存在突變。結(jié)論使用所選擇的定點(diǎn)突變系統(tǒng)能成功地產(chǎn)生所有希望的突變。所設(shè)計(jì)的用于突變發(fā)生的寡核苷酸中包括編碼限制酶切位點(diǎn)的沉默突變。這就允許初級(jí)篩選而無(wú)需對(duì)每個(gè)潛在的突變進(jìn)行測(cè)序。大腸桿菌谷氨酰胺合成酶基因中發(fā)生以下突變Y397V、S52A、S52AY397V、S53A、S53AY397V、S52AS53A、S52AS53AY397V、H210V、H210VY397V、H211V、H211VY397V、D50A、D50AY397V、E129A、E129AY397V、E327V、E327VY397V、E357A和E357AY397V。實(shí)施例3谷氨酰胺合成酶的補(bǔ)償研究和純化構(gòu)建突變體以改變認(rèn)為參與上述蛋白水解催化三聯(lián)體的殘基。這些殘基是絲氨酸殘基S52和S53、組氨酸殘基H210和H211、以及D50、E129、E327和E357。通過(guò)大腸桿菌YMCll的谷氨酰胺合成酶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的補(bǔ)償作用來(lái)檢測(cè)所有構(gòu)建的突變體。組合使用硫酸鏈霉素沉淀、pH變化和硫酸銨沉淀來(lái)純化各種重組突變體谷氨酰胺合成酶，直至獲得純酶制劑。還研發(fā)親和柱層析法并用于純化某些酶。使用兩種酶分析法來(lái)評(píng)價(jià)谷氨酰胺合成酶活性。所用的第一分析法叫作"谷氨酰轉(zhuǎn)移酶分析法，是谷氨酰胺合成酶催化反應(yīng)的逆反應(yīng)的變形，所述的谷氨酰胺合成酶的催化反應(yīng)為谷氨酸+NH/+ATP—谷氨酰胺+ADP+Pi+H20在該逆反應(yīng)中，在ADP、砷酸鹽和錳或鎂的存在下，羥胺和谷氨酰胺反應(yīng)生成，谷氨酰羥肟酸和游禽氨(ShapiroBM和StadtmanER(1970)MethodsinEnzymol.17A:910-922)。這形成了谷氨酰胺合成酶活性分析法的基礎(chǔ)。在測(cè)定酶等電點(diǎn)所得的正確pH下，谷氨酰胺合成酶的腺苷?；腿ハ佘挣；瘍煞N形式的轉(zhuǎn)移酶活性相同。然而，這兩種形式的酶可以得到區(qū)分，因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)時(shí)，完全腺苷?；墓劝滨０泛铣擅副?0mMMgZ+完全抑制，而去腺苷?；拿竸t不受影響。此外，使用HPLC來(lái)評(píng)價(jià)由ATP、谷氨酸和氨轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺和ADP的轉(zhuǎn)化率。這稱為"正"反應(yīng)或"生物合成"反應(yīng)，并使用兩種不同的分析法來(lái)分析一種是測(cè)量在ATP存在下，谷氨酰胺合成酶將谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺的能力，而第二種測(cè)定在相同的分析混合物中ATP向ADP和AMP的轉(zhuǎn)化。方法和材料所有的化學(xué)品為分析級(jí)或分子生物學(xué)級(jí)，并且無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用。除非另有說(shuō)明，所有化學(xué)品均來(lái)自Merck或Sigma。Mn(HC03)-ATP由Na2ATP(來(lái)自Roche)自制得到，所述Na2ATP溶解于水中至濃度約為80mM。然后，通過(guò)使該溶液流過(guò)Dowex50WX2型強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，以從ATP中除去Na+離子。收集合并含有酸-ATP的所有樣品并與相同摩爾濃度的Mn(HC03)反應(yīng)。攪拌溶液直至所有的MnC03溶解。然后用NaHC03調(diào)節(jié)Mn(HC03)-ATP溶液的pH至7.0。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案(LaemmliUK(1970)Nature227:680-685)進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。以40%丙烯酰胺:雙丙烯酰胺混合物(19:1的比率)形式存在的丙烯酰胺購(gòu)自Sigma。用于所有PAGE凝膠的寬分子量的蛋白標(biāo)記物來(lái)自Fermentas。大腸桿菌YMCll中的谷氨酰胺營(yíng)養(yǎng)缺陷的補(bǔ)償作用將大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株YMCll中的pBluescripUISK+內(nèi)的每個(gè)突變體重組谷氨酰胺合成酶構(gòu)建體的單菌落平板培養(yǎng)于M9基本培養(yǎng)基中(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和T.Maniatis(1989)In:MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版.ColdSpringHaborLaboratoryPress.),以評(píng)價(jià)其補(bǔ)償大腸桿菌YMC11營(yíng)養(yǎng)缺陷性的能力。將濃度為250mg/1的谷氨酰胺添加到一個(gè)平板中，而重復(fù)的平板不含谷氨酰胺。將濃度為100嗎/ml的氨芐青霉素添加到兩個(gè)平板中。將用非重組pBluescriptIISK+轉(zhuǎn)化的大腸桿菌YMC11用作陰性對(duì)照。將野生型重組構(gòu)建體pBSK-ECgln用作陽(yáng)性對(duì)照。在37。C下培養(yǎng)該平板，并在48小時(shí)內(nèi)觀察是否生長(zhǎng)。大腸桿菌谷氨酰胺合成酶的純化在補(bǔ)充有70mML-谷氨酸、5mML-谷氨酰胺和100嗎/ml氨芐青霉素的2L修飾的M9培養(yǎng)基(6g/lNa2HP04、3g/lKH2P04、0.5g/lNaCl)中，培養(yǎng)用于分離GS的所有重組構(gòu)建體。在37。C、轉(zhuǎn)速為220rpm下對(duì)所有培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。在4。C、10OOOrpm下離心，從培養(yǎng)基中收集細(xì)胞。然后立即使用該生物質(zhì)或在-20。C下存儲(chǔ)直至需要使用時(shí)。此外，由生物質(zhì)純化得到腺苷?；腿ハ佘挣；瘍煞N形式存在的野生型谷氨酰胺合成酶(來(lái)自pBSK-ECgln)，所述生物質(zhì)從作為另一研究的一部分而進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)獲得。在氮限量和碳過(guò)量的條件下生成腺苷酰化酶，而在氮過(guò)量和碳限量條件下生成去腺苷?；?SeniorPJ(1975)JournalofBacteriology123:407-418)。在4。C、10000rpm下離心10分鐘收集獲得的細(xì)胞，并在-20。C下存儲(chǔ)直至需要使用時(shí)。用于純化谷氨酰胺合成酶的方法由報(bào)道的方法(ShapiroBM和StadtmanER(1970)MethodsEnzymol.17A:910-922.)發(fā)展而來(lái)。將生物質(zhì)重懸于10ml重懸緩沖劑A或RBA(10mM咪唑-HCl、2mM卩-巰基乙醇、10mMMnCl2'4H2O;pH7.0)中。將細(xì)胞在50%占空比(dutycycle)下超聲10分鐘。將該超聲溶液在10OOOrpm下離心10分鐘，并保留上清液。加入硫酸鏈霉素(10。/。w/v的10%)，并在4。C下攪拌混懸液10分鐘。然后在10OOOrpm下離心10分鐘，并保留上清液。用硫酸調(diào)節(jié)上清液pH至5.15。在4。C下攪拌該混合物15分鐘，然后在13OOOrpm下離心IO分鐘。再次保留上清液。添加飽和硫酸銨(體積的30%)并用硫酸調(diào)節(jié)pH至4.6。在4。C下攪拌混懸液15分鐘，然后在13000rpm下離心10分鐘。將獲得的沉淀重懸于2-5mlRBA并用硫酸調(diào)節(jié)pH至5.7。在4。C下攪拌該混懸液過(guò)夜以使得谷氨酰胺合成酶得以重懸，然后在13OOOrpm下離心IO分鐘。保留上清液并將混懸液pH調(diào)節(jié)至7.0。使用AKTAExplorer(AmershamBiosciences)利用親和層析使野生型酶和Y397V酶得到進(jìn)一步純化。使用長(zhǎng)度為10cm和內(nèi)徑為10mm的HR10/10柱以5'AMP瓊脂糖樹(shù)脂實(shí)現(xiàn)分離。將谷氨酰胺合成酶制劑(約為2ml)加樣到制備柱上，所述制備柱用10mM咪唑(pH7.0)、150mMNaCl和10mMMnCV4H20來(lái)平衡。在整個(gè)線性梯度從150mM至500mM的40mlNaCl，使用2.5mMADP將結(jié)合的谷氨酰胺合成酶從柱上洗脫下來(lái)，并收集lml組分。然后收集合并含有純谷氨酰胺合成酶的組分并用RBA透析過(guò)夜。按照標(biāo)準(zhǔn)方案，在7.5。/。SDS-PAGE凝膠上對(duì)每個(gè)蛋白混懸液的等分試樣進(jìn)行電泳。使用Lowry蛋白檢測(cè)法測(cè)量蛋白濃度。對(duì)純化的蛋白進(jìn)行MALDI-TOF分析使用MALDI-TOF質(zhì)譜分析每個(gè)突變蛋白。將所希望的蛋白條帶從7.5。/。SDS-PAGE凝膠切下來(lái)(為獲得足夠蛋白，進(jìn)行同一蛋白多條泳道操作)。將所希望的條帶從凝膠上切下來(lái)并置于Eppendorf管中。將溶解于40%乙醇中的75mMNH4HC03溶液加入凝膠堵劑中并渦旋30分鐘。取出液體并棄去。重復(fù)該脫色步驟直至凝膠堵劑中不含有的考馬斯藍(lán)。然后用乙腈浸沒(méi)該凝膠堵劑，并在室溫下培養(yǎng)15分鐘，隨后，從管中除去所有液體，保留凝膠堵劑。然后將足夠體積的溶解于50mM碳酸氫銨的5mM二硫蘇糖醇溶液加入管中以浸沒(méi)凝膠堵劑，并在60。C下培養(yǎng)30分鐘。然后將該混懸液在Eppendorf微量離心機(jī)中于13000rpm下離心5分鐘，取出上清液并棄去。將10nl溶解于50mM碳酸氫銨的55mM碘代乙酰胺溶液添加到凝膠堵劑中，并在室溫下于暗處培養(yǎng)60分鐘。培養(yǎng)后，將混懸液在13000rpm下離心5分鐘，取出上清液并棄去。用60^11乙腈浸沒(méi)該凝膠堵劑，使該混懸液擱置10分鐘。在13000rpm下離心5分鐘后，棄去上清液，并在Speedvac中干燥該凝膠堵劑10分鐘。然后添加溶解于50mMNH4HC03W、濃度為0.01pg/pl的新制備的牛胰蛋白酶(5-20pl)。添加量依賴于Eppendorf管中的凝膠量。將其在冰上培養(yǎng)60分鐘。在簡(jiǎn)單離心后，取出上清液，并將10nl50mMNH4HCO3加入凝膠堵劑中。將其在37。C下培養(yǎng)過(guò)夜。然后將樣品在超聲浴中超聲IO分鐘，并在Eppendorf微量離心機(jī)中離心5分鐘后收集上清液。加入10nl三氟乙酸(TFA)/乙腈溶液(50%的2%TFA和50%乙腈)，并將樣品再超聲10分鐘。離心后，收集上清液。加入乙腈(l(Hil)，并使樣品渦旋10分鐘。將樣品在13000rpm下離心5分鐘并保留上清液。然后將制備蛋白樣品和10mg/ml溶解于乙腈的處于0.1%TFA中的a-氰基羥基肉桂酸溶液進(jìn)行等體積合并。將其劇烈混合，并將lpl該溶液用于樣品培養(yǎng)板。然后通過(guò)MALDITOFMS分析蛋白。谷氨酰轉(zhuǎn)移酶分析法測(cè)定谷氨酰胺合成酶活性因?yàn)樵贛^+存在下，在，谷氨酰轉(zhuǎn)移酶分析法中腺苷酰化和去腺苷?；问降拿妇谢钚?，所以該分析法用于測(cè)量存在的谷氨酰胺合成酶的總量。當(dāng)向同一分析法中補(bǔ)充60mMMg^時(shí)，只能測(cè)定去腺苷?；傅幕钚浴Ｒ虼耍訫i^+或Mg^存在時(shí)的活性差異為基礎(chǔ)，可將這兩種形式的酶活性區(qū)分開(kāi)來(lái)。分析混合物對(duì)ShapiroB.M.和StadtmanE.R.(1970)AnnualReviewsinMicrobiology24:501-524中記載的分析混合物進(jìn)行了改變。在兩種不同的分析混合物中測(cè)量谷氨酰胺合成酶活性一種只含有Mn，而第二種含有Mn和Mg。所有試劑在咪唑緩沖液(pH7.0)中制備。在總體積600pl中實(shí)施兩種分析法。如下表ll所示，建立Mn分析法。表ll.基于Mn的谷氨酰轉(zhuǎn)移酶分析法的分析混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>如表12所示，建立組合(Mn和Mg)分析法。表12.基于Mn和Mg的谷氨酰轉(zhuǎn)移酶分析法的分析混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>以與Mn反應(yīng)相同的方式制備空白反應(yīng)物，但是用水替代ADP和砷酸鹽溶液。在37°C下使分析混合物平衡5分鐘，然后添加50^酶制劑開(kāi)始反應(yīng)。使該反應(yīng)進(jìn)行30分鐘，然后添加900StopMix(1MFeCl3'6H20、0.2M三氯乙酸和7.1%v/vHC1)終止該反應(yīng)。接下來(lái)，將樣品在Eppendorf微量離心機(jī)中于13000rpm下離心2分鐘以除去可能形成的任何沉淀，并在540nm下測(cè)量吸光度。所有吸光度讀數(shù)輸入電子數(shù)據(jù)表，結(jié)果表示為以pmole酶/min/mg蛋白表示的比活性?？紤]亞基的數(shù)目，由去腺苷?；痀-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性與總Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性(Mr^+反應(yīng))之比來(lái)計(jì)算腺苷?；潭?。通過(guò)HPLC測(cè)定谷氨酰胺合成酶活性按照正反應(yīng)建立該分析法以測(cè)量谷氨酰胺合成酶活性，并測(cè)量在MnHC03-ATP(第一個(gè)反應(yīng)的基礎(chǔ))和MgATP(第二個(gè)反應(yīng)的基礎(chǔ))存在下，由4mmolL-谷氨酸形成的谷氨酰胺的量。此外，還可使用相同試劑，在單獨(dú)的分析法中測(cè)量形成的ADP量。分析的設(shè)置如表13所示。表13.用于HPLC分析法以測(cè)定谷氨酸和ATP轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺和ADP的轉(zhuǎn)化率的分析組分<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>將所有酶制劑調(diào)節(jié)為具有相同的蛋白濃度，并以5(Hil的體積加入分析混合物中。酶的加入啟動(dòng)了反應(yīng)，然后使其反應(yīng)l小時(shí)。通過(guò)加入6pl50%三氯乙酸溶液終止該反應(yīng)。然后將每個(gè)分析物均分到4個(gè)HPLC小瓶(150nl/小瓶)進(jìn)行分析，在Agilent100HPLC設(shè)備上使用PhenomenexLunaC18柱對(duì)其中的兩個(gè)進(jìn)行谷氨酸和谷氨酰胺分析。還使用Agilent100HPLC設(shè)備在ChromolithPerformanceRP-C18柱上進(jìn)行ATP/ADP分析。因?yàn)橛腥苏J(rèn)為，與絲氨酸蛋白酶內(nèi)的催化三聯(lián)體類似的兩個(gè)假設(shè)的催化三聯(lián)體參與了谷氨酰胺合成酶反應(yīng)機(jī)理，因此為了評(píng)價(jià)絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)酶的影響，在絲氨酸蛋白酶抑制劑AEBSF和PMSF存在下，還通過(guò)HPLC來(lái)分析某些突變體。被評(píng)價(jià)的酶是腺苷?；吧?WT)酶、去腺苷?；疻T酶和突變酶S52A、S52AY397V、S53A、S53AY397V、S52AS53A和S52AS53AY397V。在lmMPMSF或lmMAEBSF存在下，預(yù)培養(yǎng)該酶60分鐘。為每種酶建立不含抑制劑的對(duì)照反應(yīng)。然后將每種酶加入如上所述設(shè)置的分析法中。使該分析法進(jìn)行60分鐘，然后通過(guò)加入6ml50。/。TCA終止該分析，隨后通過(guò)HPLC對(duì)其進(jìn)行分析。所有分析重復(fù)進(jìn)行三次。結(jié)果補(bǔ)償作用研究在有或無(wú)谷氨酰胺的條件下，使突變谷氨酰胺合成酶基因構(gòu)建體在M9瓊脂基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并評(píng)價(jià)其對(duì)大腸桿菌YMC11的glnA突變的補(bǔ)償能力。在37。C下培養(yǎng)48小時(shí)后，觀察到雖然陰性對(duì)照(YMC11中的pBluescriptIISK+)在無(wú)谷氨酰胺的條件下不能生長(zhǎng)，但是陽(yáng)性對(duì)照(pBSK-ECgln)能補(bǔ)償YMC11中的營(yíng)養(yǎng)缺陷性。常常遇到的問(wèn)題是250mg/l谷氨酰胺顯得不足以支持YMCll菌株的生長(zhǎng)，因此YMC11中的載體獨(dú)自抗?fàn)幎L(zhǎng)。在陽(yáng)性對(duì)照ECgln中，存在的功能性多拷貝谷氨酰胺合成酶基因顯得能克服此問(wèn)題。重組去腺苷?；瘶?gòu)建體pBSK-Y397V也能補(bǔ)償YMC11的營(yíng)養(yǎng)缺陷性。因此WT酶和Y397V酶均能是功能性的。S52A和S53A突變體以及雙突變體S52AY397V和S53AY397V均能補(bǔ)償大腸桿菌YMC11的營(yíng)養(yǎng)缺陷性，因而顯示其功能性。在雙絲氨酸突變體S52AS53A及其對(duì)應(yīng)物S52AS53AY397V中也發(fā)現(xiàn)相同情形。兩種組氨酸突變體H210V和H211V在補(bǔ)充有谷氨酰胺的基本培養(yǎng)板上生長(zhǎng)很好，但是在不含谷氨酰胺的培養(yǎng)板上生長(zhǎng)很差，因而顯示了該酶幾乎沒(méi)有功能性。另一方面，雙組氨酸突變體H210VY397V和H211VY397V甚至在補(bǔ)充有谷氨酰胺的培養(yǎng)板上生長(zhǎng)也很差，并且在不含谷氨酰胺的培養(yǎng)板上根本不生長(zhǎng)。因此，認(rèn)為這兩種酶基本上不具有功能性，并且這些突變產(chǎn)生了營(yíng)養(yǎng)缺陷性，因此它們完全需要谷氨酰胺。突變體D50A和D50AY397V顯示在兩種培養(yǎng)板上生長(zhǎng)很好，均具有功能性。然而，E129A和E357A不能補(bǔ)償YMC11的營(yíng)養(yǎng)缺陷性，并且顯示甚至在補(bǔ)充有谷氨酰胺的培養(yǎng)板上生長(zhǎng)也很差。雙突變體E129AY397V和E357AY397V也如此。E327V和E327VY397V顯示在兩種培養(yǎng)板上均生長(zhǎng)很好，均具有功能性的谷氨酰胺合成酶。大腸桿菌GS的純化對(duì)于突變蛋白的純化，使每個(gè)突變體在補(bǔ)充有作為唯一氮源的谷氨酸的修飾的M9基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。因?yàn)閅MC11菌株為谷氨酰胺營(yíng)養(yǎng)缺陷體，添加少量谷氨酰胺以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。使所有培養(yǎng)液在37。C下生長(zhǎng)48小時(shí)，然后檢查是否受污染。通過(guò)分離質(zhì)粒DNA、進(jìn)行限制酶切分析、然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢査重組質(zhì)粒的完整性。有人發(fā)現(xiàn)因?yàn)樯L(zhǎng)很差，對(duì)于一些雙突變體，即H210VY397V、H211VY397V和E357AY397V，需要向基本培養(yǎng)基添加10mM谷氨酰胺以得到足夠的生物質(zhì)從而能進(jìn)行酶純化。從所有突變體，將谷氨酰胺合成酶成功純化到至少90%的均一性。在任何情況下，在約55kDa處存在的單條帶可證明存在純化的谷氨酰胺合成酶。驗(yàn)證純化的谷氨酰胺合成酶對(duì)所有純化的突變體谷氨酰胺合成酶進(jìn)行MALDITOF分析以驗(yàn)證該酶是谷氨酰胺合成酶。在7.5o/。SDS-PAGE凝膠上運(yùn)行每種酶，將預(yù)計(jì)是谷氨酰胺合成酶的條帶切下，并按照上述方法來(lái)純化蛋白。將純化的蛋白樣品移液至樣品板上，通過(guò)MALDITOF質(zhì)譜進(jìn)行分析。然后使用蛋白質(zhì)組學(xué)和序列分析工具鑒定蛋白，并將獲得的值輸入SwissInstituteofBioinformatics(瑞士生物信息研究院)的ExPASy蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器的數(shù)據(jù)庫(kù)中。所有的分離蛋白均以此方式被鑒定為谷氨酰胺合成酶。谷氨酰轉(zhuǎn)移酶分析法使用，谷氨酰轉(zhuǎn)移酶或"逆"反應(yīng)來(lái)評(píng)價(jià)每個(gè)突變體的活性。該方法在比色法分析中測(cè)定鐵-異羥肟酸絡(luò)合物的存在，在所述比色分析法中，于540nm下讀取吸光度。該分析法測(cè)定了含M一+反應(yīng)中的總酶活性。此外，因?yàn)橄佘挣；问降拿冈贛g^存在下受抑制，所以在含有Mn2+和Mg^兩者的反應(yīng)中，還可測(cè)定篩選的谷氨酰胺合成酶的腺苷?；潭?ShapiroBM和StadtmanER(1970)AnnualReviewsinMicrobiology24:501-524;BenderRA，KAJanssen,ADResnick,MBlumberg,FFoor和BMagasanik(1977)JournalofBacteriology129:1001-1009)。以這種方式，可測(cè)定谷氨酰胺合成酶的腺苷?；潭?。分析結(jié)果如表14所示，以pmole/min/mg蛋白表示酶活性。表14.大腸桿菌WT和構(gòu)建的突變體的谷氨酰轉(zhuǎn)移酶分析結(jié)果。WT酶是指在修飾的M9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株，WT(AD)和WT(DD)分別是指連續(xù)培養(yǎng)產(chǎn)生的腺苷?；负腿ハ佘挣；?。所顯示的值代表至少三次試驗(yàn)的平均值，其中活性偏差小于10%。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>在Mg^存在的條件下，以與突變體相同的方式在修飾的M9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的WT酶(表中的WT)，因其大部分活性受到抑制，由91pmole/min/mg蛋白到20nmole/min/mg蛋白，約為4倍的抑制，所以其基本上以腺苷?；问酱嬖?，腺苷?；陌俜?jǐn)?shù)為78%。在N過(guò)量和C限量的連續(xù)培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的WT菌株中，可觀察到相同的腺苷酰化百分?jǐn)?shù)，其中谷氨酰胺合成酶大部分被腺苷酰化(表中的WT(AD))。在N限量和C過(guò)量的連續(xù)培養(yǎng)中生長(zhǎng)的WT酶應(yīng)當(dāng)是以去腺苷酰化形式(表中的WT(DD))存在，這反映在分析結(jié)果中。在只存在Mn2+(55.8)的條件下進(jìn)行的分析中，該特定菌株的比活性幾乎相同，而在Mi^+和Mg2+(56.1)均存在的條件下，正如所預(yù)計(jì)的那樣，腺苷酰化的百分?jǐn)?shù)為0。因?yàn)門yr397已被纈氨酸殘基取代，所以預(yù)計(jì)突變酶Y397V以去腺苷?；问酱嬖?。突變體顯示出64.5nmole/min/mg蛋白這樣非常高的總酶活性，但不顯示是去腺苷酰化的；因?yàn)樵贛i^+和Mg2+(5.1)均存在下的酶活性比只有Mn2+(64.5)存在下檢測(cè)到的酶活性低得多，所以實(shí)際上顯示腺苷?；陌俜?jǐn)?shù)更高，結(jié)果是腺苷?；陌俜?jǐn)?shù)為92%。這是因?yàn)橄佘辙D(zhuǎn)移酶不能使纈氨酸殘基腺苷?；蛉ハ佘挣；?，因此產(chǎn)生不正確折疊的谷氨酰胺合成酶。有假設(shè)認(rèn)為通過(guò)腺苷轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行的腺苷?；腿ハ佘挣；枰ㄟ^(guò)腺苷轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行谷氨酰胺合成酶環(huán)的特異性折疊，折疊成酶每種狀態(tài)所需的兩種構(gòu)象中的任一種，并且腺嘌呤基的空間效應(yīng)促使該酶折疊為正確的構(gòu)象。因?yàn)橄佘辙D(zhuǎn)移酶不會(huì)將Y397環(huán)折疊為去腺苷?；璧?正確"構(gòu)象，因此，Y397V突變體酶可能具有類似于腺苷?；问矫傅沫h(huán)構(gòu)象。因此，該腺苷?；问降拿缚哨呌诔蔀槟J(rèn)結(jié)構(gòu)。兩種絲氨酸殘基52和53在兩種突變菌株內(nèi)單獨(dú)發(fā)生改變，并且這兩種突變導(dǎo)致總Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性分別降至35.5和47.8fimole/min/mg蛋白，表明這些殘基對(duì)于催化活性是必需的。將兩種絲氨酸殘基改變?yōu)楸彼?，由此產(chǎn)生雙突變體S52AS53A，該突變強(qiáng)化了上述結(jié)論。在該突變體中，，谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的活性急劇降至7.2pmole/min/mg蛋白。在Y397V突變的同時(shí)，分別改變各絲氨酸殘基從而產(chǎn)生S52AY397V和S53AY397V，這導(dǎo)致了在兩種單獨(dú)的絲氨酸突變體中可觀察到的Mn2+活性增加到與WT酶相當(dāng)?shù)乃?78.6和86.2nmole/min/mg蛋白)。S52A和S52AY397V中腺苷?；陌俜?jǐn)?shù)與由WT獲得的腺苷酰化的百分?jǐn)?shù)類似(均在75-80%范圍)。改變S53導(dǎo)致兩種突變體(S53A和S53AY397V)中腺苷?；陌俜?jǐn)?shù)降至60-65%，可能表明S53是去腺苷酰化的重要?dú)埢?。同時(shí)改變兩種絲氨酸殘基產(chǎn)生S52AS53A，導(dǎo)致了r谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性大幅降至7.2pmole/min/mg蛋白。當(dāng)對(duì)三突變體S52AS53AY397V進(jìn)行分析時(shí)，"谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的一些活性得以恢復(fù)(29.9^imole/min/mg蛋白)，但是該活性仍小于WT菌株獲得的活性。這似乎表明，正如所懷疑的那樣，這些絲氨酸殘基在谷氨酰胺合成酶中發(fā)揮重要作用。如果這些絲氨酸殘基發(fā)揮類似于在絲氨酸蛋白酶中構(gòu)成催化三聯(lián)體的絲氨酸殘基的催化作用，那么可預(yù)計(jì)的是，雙絲氨酸突變體(S52AS53A)將產(chǎn)生非功能性的酶，除非該酶使用其它反應(yīng)機(jī)理或它們?cè)?逆反應(yīng)"或"谷氨酰轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中發(fā)揮的作用可能是純結(jié)構(gòu)性的而非催化性的，即在絲氨酸殘基處，沒(méi)有通過(guò)?；虚g體進(jìn)行谷氨酰轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)。經(jīng)鑒定作為催化三聯(lián)體潛在組成部分的兩種組氨酸殘基被證明對(duì)酶的催化活性至關(guān)重要。H210V顯示出非常小的Mr^+依賴性，谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性(2.8[imole/min/mg蛋白)，在雙突變體H210VY397V中，這種依賴性減小至不存在。H211V突變體也根本不顯示任何活性。H210V被完全腺苷酰化(腺苷?；陌俜?jǐn)?shù)為100。/。)。當(dāng)除去雙突變體H210VY397V中使該酶發(fā)生腺苷酰化或去腺苷?；哪芰r(shí)，不能得到活性。經(jīng)鑒定為催化三聯(lián)體潛在的酸性殘基的四個(gè)殘基，即D50A、E129A、E328V和E357A，均顯示不同大小的活性。D50A和D50AY397V顯示總，谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性很小(分別為1.28禾卩1.78pmole/min/mg蛋白)，但顯示出不同程度的腺苷?；129A顯示活性很小(2.38^imole/min/mg蛋白)，但其在雙突變體E129AY397V中增加到12.06pmole/min/mg蛋白。突變體E328V、E328VY397V、E357A和E357AY397V均沒(méi)有顯示大的，谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性，最大活性是由E357A顯示出的3.3[imole/min/mg蛋白。盡管不含有非常低活性的堿基，兩種E357A突變體均顯示出0%的腺苷酰化。正如在文獻(xiàn)中觀察到的，當(dāng)在任何情況下引入突變導(dǎo)致活性降低時(shí)，這四個(gè)殘基對(duì)于催化活性很重要(LiawS-H，CPan和DEisenberg(1993a)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences90:4996-5000;LiawS-H和DEisenberg(1994a)Biochemistry33:675-681;AlibhaiM和JJVillafranca(1994)Biochemistry33:682-686)。HPLC分析法除Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶分析法外，還研發(fā)了通過(guò)HPLC測(cè)量ATP和谷氨酸轉(zhuǎn)化為ADP和谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率的分析法。這些將建立成單一方法，但單獨(dú)分析谷氨酸、谷氨酰胺、ATP和ADP。在Mn2lQMg^均存在的條件下，谷氨酸通過(guò)谷氨酰胺合成酶轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率被稱為基于谷氨酰胺的比活性，并且表示為pmole/min/mg蛋白。在Mn"和Mg2+均存在的條件下，ATP通過(guò)谷氨酰胺合成酶轉(zhuǎn)化為ADP的轉(zhuǎn)化率被稱為基于ADP的比活性，并且表示為pmole/min/mg蛋白。用基于谷氨酰胺的比活性除以基于ADP的比活性也可計(jì)算轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)，并且該值可解釋為酶以相同水平的效率完成兩個(gè)反應(yīng)步驟的能力，該兩個(gè)反應(yīng)步驟即谷氨酸向谷氨酰胺以及ATP向ADP反應(yīng)的步驟。在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的WT酶顯示出接近的基于谷氨酰胺的比活性和基于ADP的比活性(分別為1.3058和1.3651nmole/min/mg蛋白)，并且轉(zhuǎn)化率為100%。在氮限量和碳過(guò)量條件下生長(zhǎng)以進(jìn)行腺苷?；腤T酶在Mn和Mg兩種分析法中顯示了非常接近的活性水平，并且轉(zhuǎn)化率為100%。在氮過(guò)量和碳限量條件下生長(zhǎng)以進(jìn)行去腺苷?；腤T酶在Mg分析法中的活性(谷氨酰胺分析中為0.4412pmole/min/mg蛋白，而在ADP分析中為0.4537nmole/min/mg蛋白)比在Mn分析法中的活性(谷氨酰胺分析中為0.1425pmole/min/mg蛋白，而在ADP分析中為0.1409nmole/min/mg蛋白)更強(qiáng)。Mn分析法和Mg分析法均顯示轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)接近于100%。因?yàn)槿ハ佘挣；副认佘挣；笐?yīng)顯示更大的Mg活性，所以該結(jié)果是所預(yù)期的。Y397V酶在Mi^+分析法中比在Mg^分析法中活性更強(qiáng)，轉(zhuǎn)化率只有50%。該低轉(zhuǎn)化效率可能是因?yàn)門yr397柔性環(huán)的不正確折疊，所述Tyr397柔性環(huán)產(chǎn)生含有非結(jié)合水的活性位點(diǎn)。該水可作為親核劑，與高度不穩(wěn)定的谷氨酰磷酸中間體反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為谷氨酸和P04，由此發(fā)生低效轉(zhuǎn)化。此外，正如所假設(shè)的那樣，通過(guò)腺苷轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行的酶的腺苷?；枰猅yr397柔性環(huán)的腺苷?；?，并且通過(guò)腺嘌呤基的空間效應(yīng)誘導(dǎo)了該環(huán)的特異性構(gòu)象，促使該酶折疊為正確的構(gòu)象。S52A和S52AY397V均非常活潑，并且顯示出比篩選的WT酶更強(qiáng)的谷氨酰胺合成酶活性。在基于谷氨酰胺和基于ADP的Mn和Mg分析法中，S52A產(chǎn)生了水平接近的活性(在2.0-2.8pmole/min/mg蛋白的范圍內(nèi))，對(duì)Mn分析法的轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)為91%，對(duì)Mg分析法的轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)為85%。另一方面，S52AY397V比S52A活潑，產(chǎn)生基于谷氨酰胺的Mn比活性為5.366[imole/min/mg蛋白以及基于ADP的Mn比活性為6.241(Himole/min/mg蛋白。這相當(dāng)于轉(zhuǎn)化率為91%。Mg分析法得到基于谷氨酰胺的Mg比活性為5.3063pmole/min/mg蛋白以及基于ADP的Mg比活性為7.6781nmole/min/mg蛋白，代表轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)為69%。S53A產(chǎn)生的活性水平稍高于WT菌株產(chǎn)生的活性水平，即對(duì)于基于谷氨酰胺的Mi^+分析法，為5.80^imole/min/mg蛋白；對(duì)于基于ADP的Mi^+分析法，為6.36nmole/min/mg蛋白；對(duì)于基于谷氨酰胺的Mg2+分析法，為4.88pmole/min/mg蛋白以及對(duì)于基于ADP的Mg^分析法，為6.96jamole/min/mg蛋白。這些代表轉(zhuǎn)化率分別為91%和70%。在S53AY397V中發(fā)現(xiàn)的活性水平顯著高于在WT菌株中發(fā)現(xiàn)的活性水平。對(duì)于基于谷氨酰的分析，Mr^+活性增加到15.45pmole/min/mg蛋白，而對(duì)于基于ADP的分析，Mi^+活性增加到21.32^imole/min/mg蛋白。對(duì)于基于谷氨酰胺的分析，MgZ+活性為10.66pmole/min/mg蛋白，而對(duì)于基于ADP的分析，Mg2+活性為15.42nmole/min/mg蛋白。S52AS53A的活性不如兩個(gè)S53A突變體的活性。對(duì)于谷氨酰胺分析，其產(chǎn)生的Mn活性為2.2873pmole/min/mg蛋白，而對(duì)于ADP分析，Mn活性為2.5904pmole/min/mg蛋白，轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)為88%。然而，該酶確實(shí)顯示出在Mn存在下，將ATP直接轉(zhuǎn)化為AMP的能力，對(duì)于ADP向AMP的轉(zhuǎn)化，獲得的比活性為0.3858^imole/min/mg蛋白。S52AS53A確實(shí)顯示出很低的Mg活性水平，目卩，對(duì)于谷氨酰胺分析，Mg活性為0.卯9化mole/min/mg蛋白，而對(duì)于ADP分析，Mg活性為1.2676Hmole/min/mg蛋白。在歸于腺苷酰化形式酶的活性位點(diǎn)內(nèi)可產(chǎn)生該較低活性。能將ATP轉(zhuǎn)化為AMP的酶可由ADP合成谷氨酰胺(數(shù)據(jù)未示出)。當(dāng)S52AS53A突變與Y397V突變組合時(shí)，相比于S52AS53A突變，Mn活性水平增加(對(duì)于谷氨酰胺分析，Mn活性增加到3.095pmole/min/mg蛋白，而對(duì)于ADP分析，Mn活性增加到4.5381nmole/min/mg蛋白)。然而，對(duì)該三突變體，Mg基于谷氨酰胺和基于ADP的比活性非常顯著地減小到0.1075和0.2986pmole/min/mg蛋白。此外，該酶在分析法中表現(xiàn)出生成AMP的能力，顯示出比活性為0.3583pmole/min/mg蛋白。這些結(jié)果顯示出兩種絲氨酸殘基對(duì)該酶的催化活性非常重要。正如所預(yù)計(jì)的那樣，雙突變S52AS53A在菌株中不產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)缺陷。然而，如下事實(shí)可對(duì)此作出解釋，即這些酶能由ADP以及ATP產(chǎn)生谷氨酰胺。當(dāng)這些酶的轉(zhuǎn)化效率受到嚴(yán)重?fù)p害時(shí)，將可能出現(xiàn)直接由Y-谷氨酰磷酸而不是酰基酶中間體發(fā)生反應(yīng)，因?yàn)榱姿狒贖20存在下不穩(wěn)定，使得，谷氨酰磷酸水解并發(fā)生低效轉(zhuǎn)化。通常，認(rèn)為形成部分催化三聯(lián)體的兩種組氨酸殘基顯示出非常低水平的活性。H210V是唯一顯示出活性水平與WT酶相當(dāng)?shù)耐蛔?，并且只是在Mn分析法中(對(duì)于基于谷氨酰胺的分析，為0.1525nmole/min/mg蛋白，而對(duì)于基于ADP的分析，為0.1355pmole/min/mg蛋白)。在Mg分析法中產(chǎn)生的活性水平非常低，可認(rèn)為相當(dāng)于沒(méi)有活性(對(duì)于基于谷氨酰胺的分析，為0.0348nmole/min/mg蛋白，而對(duì)于基于ADP的分析，為0.0173pmole/min/mg蛋白)。雙突變體H210VY397V在任何分析中均顯示非常小的活性，即，在基于谷氨酰胺的Mn分析法中，為0.007化mole/min/mg蛋白、在基于ADP的Mn分析法中，為0.0025pmole/min/mg蛋白、在基于谷氨酰胺的Mg分析法中，為0.0036nmole/min/mg蛋白以及在基于ADP的Mg分析法中，為0.0073nmole/min/mg蛋白。H211V或H211VY397V均顯示在任何分析中沒(méi)有多少活性，表明它們?cè)诠劝滨０泛铣擅富钚晕稽c(diǎn)中的重要性。這四種突變體在所有分析法中的比活性均少于0.1pmole/min/mg蛋白。然而，有趣的是，盡管比雙絲氨酸突變體產(chǎn)生的AMP水平低，這四種突變體均可自始至終將ATP轉(zhuǎn)化為AMP。在經(jīng)鑒定為是假設(shè)的催化三聯(lián)體中潛在的酸殘基的殘基中，即D50AE129A、E327V和E357A均顯示活性水平降低并且轉(zhuǎn)化率不同。D50A顯示比WT克隆體活性小。當(dāng)該突變與Y397V突變組合時(shí)，導(dǎo)致在所有分析法中相對(duì)于D50A活性增大?；诠劝滨０返腗^+分析法的比活性和基于ADP的Mi^+分析法的比活性分別由D50A中的0.62nmole/min/mg蛋白和0.92pmole/min/mg蛋白增至D50AY397V中的2.82pmole/min/mg蛋白和4.90nmole/min/mg蛋白。Mg^活性顯示出類似的趨勢(shì)，分別由D50A中的0.29|imole/min/mg蛋白和0.85nmole/min/mg蛋白增至D50AY397V中的1.98nmole/min/mg蛋白和4.19pmole/min/mg蛋白。兩種突變體的轉(zhuǎn)化率均低，表明酶不是完全功能性的。E129A在任何分析法中均顯示無(wú)活性。在雙突變體E129AY397V中，有些活性可檢測(cè)到。E327V在Mr^+分析法中顯示出低比活性(在基于谷氨酰胺的分析中，為0.32^imole/min/mg蛋白，而在基于ADP的分析中，為0.42nmole/min/mg蛋白)，但該水平在Mg^分析法中均降低。另一方面，E327VY397V具有類似于在E327V中獲得的基于谷氨酰胺的Mi^+的比活性和基于ADP的Mn"的比活性，但是Mg^活性顯著高于E327V的Mg^活性。這可表明該殘基在腺苷酰化形式的酶中很重要。E357A在Mi^+分析法中產(chǎn)生的比活性，對(duì)基于谷氨酰胺的活性為0.36pmole/min/mg蛋白，而對(duì)基于ADP的活性為0.21iimole/min/mg蛋白。在任一Mg&法分析中均檢測(cè)不到活性。當(dāng)E357A與Y397V組合時(shí)，雙突變體顯示出比E357A更低的Mr^+活性，但Mg^活性得到恢復(fù)(基于谷氨酰胺的活性為0.04nmole/min/mg蛋白，而基于ADP的活性為0.01nmole/min/mg蛋白)。表15.顯示使用HPLC測(cè)定的ATP和谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺、ADP和Pi的轉(zhuǎn)化率的HPLC分析結(jié)果。WT酶是指在修飾的M9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株，而WT(AD)和WT(DD)是指在連續(xù)培養(yǎng)中產(chǎn)生的腺苷酰化和去腺苷?；?。所示值代表三次不同分析的平均值，其中該值的偏差小于5%。比活性Mn分析法(pmole/niin/邁g蛋白)基于ADP的比活性Mn分析法(fimole/min/mg蛋白)轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)Mn分析法基于M跌胺的比活性Mg分析法(拜ole/min/mg蛋白)基于ADP的比活性Mg分析法(拜ole/min/mg蛋白)轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)Mg分析法基于AMP的比活性Mn2+分析法(limole/min/mg蛋白)WT98《264*21100-WT(AD)3,763.651003,023.1297WT(DD)4*984,6210014.5413.92100Y397V2.814.9S57(U20.23SO-工聯(lián)休S52A2*082*30912.412.8585-S52AY397V5376.24865317.68訴SS3A5'抑914.886.9670-SS3AY397V15452132731(U615.4269-S52AS53A2,291S9880.911.27720.39S52ASS3AY397V3.014.54660.110,3036H210V0-150.14則0.030.06620.05H210VY297V0,010.001000.000.01490.01H211V0,020.021000.050.06870.08H211VY397V0,090.09W0.02O.OS40O.OSDSOA0.620.92670.290.8534-D50AY397V2,824.卯581.984.1947-E129A0.000.00-0.000.040-E129AY397V0,000.00"210370-E328V(U2(K42780.000.030-E328VY397V0.53861.71咖-E357A0360.211000.000.00■-E357AY397V0.040.060.040.01100絲氨酸蛋白酶抑制劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表16所示。表16.使用絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF和AEBSF在實(shí)驗(yàn)中獲得的HPLC數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)表示為在無(wú)抑制劑的對(duì)照反應(yīng)與在有抑制劑的反應(yīng)之間比活性降低的百分?jǐn)?shù)。正百分?jǐn)?shù)的降低表示相對(duì)于無(wú)抑制劑的對(duì)照反應(yīng)，活性增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>ND=未檢測(cè)DI-數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確；獲得的活性水平極低，使得對(duì)該結(jié)果的解釋不準(zhǔn)確數(shù)值表示為在無(wú)抑制劑下獲得的結(jié)果與在有抑制劑下獲得的結(jié)果之間活性降低的百分?jǐn)?shù)。還示出了反映酶轉(zhuǎn)化效率的轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)。獲得的正百分?jǐn)?shù)的降低值表示與對(duì)照下所得活性水平相比，有抑制劑下所得活性提高。這在ATP水解反應(yīng)中特別明顯，表明作為"谷氨酰磷酸水解的結(jié)果，在有抑制劑存在時(shí)，反應(yīng)的第一步以增大的速率發(fā)生，同時(shí)在ATP水解速率增大的任何情況下，伴隨著轉(zhuǎn)化效率的降低?！?5%的降低百分?jǐn)?shù)可解釋為分析法中可變性的反映，因此，可認(rèn)為蛋白酶抑制劑具有很小的影響或沒(méi)有影響。在基于Mt^+和基于Mg"的分析法中，均發(fā)現(xiàn)PMSF抑制腺苷?；疻T酶、以及突變體Y397V、S52A、S52AY397V和S53A。AEBSF表現(xiàn)出在腺苷?；疻T酶、以及突變體Y397V、S52A、S52AY397V、S53A、S53AY397V、S52AS53A和S52AS53AY397V中產(chǎn)生抑制，抑制水平顯著高于在ATP水解反應(yīng)中的抑制水平。當(dāng)AEBSF沒(méi)有引起基于谷氨酰胺的比活性的顯著降低時(shí)，其在活性位點(diǎn)中的存在確實(shí)表現(xiàn)出增加了基于ADP的比活性。PMSF沒(méi)有顯著抑制S52AS53A或S52AS53AY397V的活性。這正是所預(yù)計(jì)的那樣，因?yàn)閮煞N絲氨酸均已從活性位點(diǎn)除去。因?yàn)锳EBSF確實(shí)抑制了這兩種突變酶，因此，表現(xiàn)出不同的作用機(jī)理。發(fā)現(xiàn)PMSF和AEBSF均結(jié)合到活性位點(diǎn)，同時(shí)仍使ATP發(fā)生水解。這可解釋為絲氨酸蛋白酶抑制劑與谷氨酸位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，同時(shí)仍使ATP發(fā)生水解。尤為重要的是，在任何情況下，當(dāng)發(fā)現(xiàn)發(fā)生抑制時(shí)，還伴隨著轉(zhuǎn)化效率的降低。已由SDM數(shù)據(jù)鑒定出來(lái)的組成各催化三聯(lián)體的氨基酸對(duì)于腺苷酰化形式的酶是S52、H211和E327，而對(duì)于去腺苷?；问降拿甘荢53、H210和D50。為了分析在腺苷酰化時(shí)，酶在催化三聯(lián)體間可能會(huì)如何轉(zhuǎn)換，將由Brookhaven蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的晶體結(jié)構(gòu)模型lf52.pdb(GillHS和DEisenberg(2001)Biochemistry7:1卯3-1912)減少到4個(gè)亞基，指定為A、B、G和H，以分析在假設(shè)的基于催化三聯(lián)體的反應(yīng)機(jī)理中亞基之間的相互作用。亞基H的腺苷?；疶yr397與亞基B上的Trp57'相對(duì)，處于絲氨酸柔性環(huán)中。有人認(rèn)為在腺苷?；瘯r(shí)，在腺苷?；疶yr397和Trp57'的芳族側(cè)鏈之間發(fā)生相互作用，以及在Tyr397(亞基H)和Tyr397(亞基A)的腺嘌呤殘基之間發(fā)生相互作用，這使酶"轉(zhuǎn)換"催化三聯(lián)體。有人認(rèn)為，在亞基A的Tyr397腺苷?；^(guò)程中，ADP腺嘌呤基和色氨酸殘基的芳環(huán)之間的亞基G上的Trp57，使得亞基G上含有柔性環(huán)的絲氨酸旋轉(zhuǎn)，從而將Ser52帶到與亞基H上的Glu327更為鄰近的區(qū)域。如果亞基H上的Tyr397也被腺苷酰化，則它與亞基A的Tyr397上的腺嘌呤環(huán)相互作用，將亞基H上的Glu327帶到與活性位點(diǎn)更為鄰近的區(qū)域。存在于亞基H和G之間的活性位點(diǎn)殘基之間所得的該構(gòu)象變化以及亞基A上Tyr397的腺苷?；沟没钚晕稽c(diǎn)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生足夠的變化，使得His211移動(dòng)到位。結(jié)論谷氨酰胺合成酶的結(jié)構(gòu)和分子動(dòng)力學(xué)分析提出酶的腺苷?；?去腺苷?；癄顟B(tài)影響酶對(duì)MgATP或Mn2ATP和NH4+或NHs特異性的可能機(jī)制是通過(guò)使兩個(gè)假設(shè)的催化三聯(lián)體之間發(fā)生轉(zhuǎn)換。如果催化三聯(lián)體在催化中發(fā)揮作用，則反應(yīng)應(yīng)該經(jīng)過(guò)Y-谷氨酰?；钢虚g體。經(jīng)鑒定在這些催化三聯(lián)體中發(fā)揮作用的一些殘基的定點(diǎn)突變導(dǎo)致了以下的研究。Ser52和Ser53對(duì)酶的催化活性均很重要。測(cè)定發(fā)現(xiàn)Ser52表現(xiàn)出具有腺苷?；δ埽鳶er53具有去腺苷?；δ?。然而，有可能的是這些絲氨酸殘基彼此相鄰，在腺苷酰化和去腺苷?；问降拿钢芯馨l(fā)揮作用。當(dāng)兩種絲氨酸殘基均被除去時(shí)，導(dǎo)致谷氨酰胺合成酶活性降低，由此強(qiáng)化了這些殘基在活性位點(diǎn)中的重要性。因?yàn)樵谝种苿┐嬖谙旅富钚允艿揭种?，所以在絲氨酸蛋白酶抑制劑AEBSF和PMSF的存在下評(píng)價(jià)這些絲氨酸突變酶而產(chǎn)生的結(jié)論是Ser52和Ser53確實(shí)顯示出形成部分催化三聯(lián)體。雙絲氨酸突變體不受PMSF或AEBSF的顯著抑制。AEBSF和PMSF均表現(xiàn)出使ATP水解率增大并伴隨谷氨酰胺的形成和轉(zhuǎn)化效率的降低。這可解釋為絲氨酸蛋白酶抑制劑與谷氨酸位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，同時(shí)仍使得ATP發(fā)生水解。尤為重要的是，在任何情況下，當(dāng)發(fā)現(xiàn)發(fā)生抑制時(shí)，也伴隨著轉(zhuǎn)化效率降低。發(fā)現(xiàn)His210和His211對(duì)酶的功能性同樣重要，并且結(jié)合模型考慮該結(jié)果，產(chǎn)生的結(jié)論是His210具有去腺苷?；钚远鳫is211具有腺苷?；钚?。所有潛在的酸殘基在被除去時(shí)均影響活性。此外，考慮模型產(chǎn)生的結(jié)論是填充各催化三聯(lián)體中酸殘基功能的兩種酸殘基，對(duì)于酶的腺苷?；问绞荊lul29，而對(duì)于酶的去腺苷?；问绞荊lu357。在谷氨酰胺合成酶兩個(gè)亞基(指定為A和B)之間的界面處發(fā)現(xiàn)兩個(gè)假設(shè)的催化三聯(lián)體，并且認(rèn)為包括以下殘基(其中，給出了大腸桿菌的殘基編號(hào))<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>去腺苷?；疓S在氮限量和低NHg濃度下生成；將酶進(jìn)行去腺苷?；?，轉(zhuǎn)換為含有殘基Ser53(亞基B)的催化三聯(lián)體；在高NH3濃度下，將酶進(jìn)行腺苷?；D(zhuǎn)換為含有殘基Ser52的催化三聯(lián)體。使用Ser52'的催化位點(diǎn)必須使NH4+去質(zhì)子化以生成氨親核體。有人提出可通過(guò)Asp50發(fā)生NH4+的去質(zhì)子化(LiawS-H，IKuo和DEisenberg(1995)ProteinScience4:2358-2365)。然而，一旦形成?；钢虚g體，可通過(guò)陽(yáng)碳離子發(fā)生該NH4+的去質(zhì)子化。下面討論提出的這兩種反應(yīng)機(jī)理，通過(guò)該兩種機(jī)理，催化三聯(lián)體機(jī)理促進(jìn)了氨對(duì)"谷氨酰-?；钢虚g體的親核進(jìn)攻。在使用由綿羊腦分離的谷氨酰胺合成酶進(jìn)行研究之前，已經(jīng)對(duì)?；钢虚g體進(jìn)行了假設(shè)，其中證明了"C-谷氨酸在沒(méi)有NH3的條件下與谷氨酰胺合成酶結(jié)合(KrishnaswamyPR，VPamiljans和AMeister(1962)JournalofBiologicalChemistry.237:2932-2940)。如上所述，氨親核進(jìn)攻的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)顯示了兩套動(dòng)力學(xué)常數(shù)。所提出的一個(gè)催化三聯(lián)體反應(yīng)機(jī)理是通過(guò)對(duì)在反應(yīng)第一步形成的谷氨酰磷酸的羧基-磷酸酐中的酯鍵的羰基碳上進(jìn)行親核進(jìn)攻，使Ser52'或Ser53'的一個(gè)"氧與谷氨酸形成共價(jià)鍵。通過(guò)從各Ser0Y中除去質(zhì)子，His210和His211可作為一般的堿催化劑。該結(jié)合NS的質(zhì)子與SerC^和底物磷酸的氧形成氫鍵。可通過(guò)Arg339來(lái)穩(wěn)定所得的四面體含氧陰離子中間體。在下一步中，His210和His211的NS-質(zhì)子轉(zhuǎn)移到橋氧底物，釋放酸性磷酸，并伴隨形成?；钢虚g體。這發(fā)生在形成Ser52'或Ser53'的第一?；钢虚g體之后，顯示出在氨的親核進(jìn)攻和其后的酶的去酰作用以及谷氨酰胺的形成的這些反應(yīng)機(jī)理之間存在基本差異。有人認(rèn)為絲氨酸的"選擇"受活性位點(diǎn)的腺苷?；癄顟B(tài)和由ATP向谷氨酸轉(zhuǎn)移磷酸過(guò)程中Mg^或Mi^+的使用的調(diào)節(jié)。可通過(guò)經(jīng)鑒定為n2金屬離子配體的His269調(diào)節(jié)的磷?；D(zhuǎn)移來(lái)進(jìn)行磷酸向谷氨酸的轉(zhuǎn)移(Abell，LM，JSchineller,PJKeck和JVillafranca(1995)Biochemistry34:16695-16702)。His269在磷?；D(zhuǎn)移中的作用也已在通過(guò)His269進(jìn)行的新的磷酰基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中得到證明(Kenyon，C.P.，等人(2006)，標(biāo)題為"ModulationofPhosphorylTransferaseActivity"的PCT申請(qǐng)，代理人案號(hào)(AttorneyDocketNumber)19690-004WO1,以此同時(shí)提出申請(qǐng))。在轉(zhuǎn)換機(jī)理中可發(fā)揮作用的另一個(gè)因素是因?yàn)锳TP使用與N7構(gòu)成腺嘌呤環(huán)的方法最接近的方法，在二元復(fù)合物內(nèi)Mn"離子周圍折疊，所以Mn2ATP具有不同于MgATP的結(jié)構(gòu)。Mn2ATP和MgATP可使GluS羰基的不同氧發(fā)生磷酸化。在水溶液中，這些通常是相同的。然而，在活性位點(diǎn)內(nèi)，作為酰基中間體的GluO"和GluO"本質(zhì)上不對(duì)稱，保持它們的立體化學(xué)性。這種不對(duì)稱在確定親核進(jìn)攻性質(zhì)中可能很重要。因此，可以想象的是，Glu(^或GluO。磷酸化產(chǎn)生的定向的結(jié)果是，可能發(fā)生Swl或Sw2親核進(jìn)攻。因此，圖1示出了用于酶的腺苷?；问降目赡艿哪Ｐ蜋C(jī)理，該酶的腺苷?；问绞褂肧er52VHis211/Glul29催化三聯(lián)體，在氮過(guò)量和碳限量條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)形成。谷氨酸?；虚g體的Y-羧基可在NH4+的去質(zhì)子化中發(fā)揮作用。在Y-谷氨酰磷酸去磷酸化過(guò)程中生成第一四面體過(guò)渡態(tài)。該質(zhì)子在激活羧基的該兩性離子形式中增加了其對(duì)親核進(jìn)攻的敏感性。發(fā)現(xiàn)腺苷?；冈贛n2ATP存在下的總活性通常低于去腺苷酰化酶的總活性。然而，可將腺苷酰化酶的高活化能與必須在高NH4+濃度下將NH/去質(zhì)子化為NH3+H+的酶相聯(lián)系以生成親核體。圖2示出了用于酶的去腺苷?；问娇赡艿哪Ｐ蜋C(jī)理，該酶的去腺苷?；问绞褂肧er537His210/E357催化三聯(lián)體，在氮限量和碳過(guò)量條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)形成。在形成第一四面體過(guò)渡態(tài)后，以及在His210的N6質(zhì)子已被轉(zhuǎn)移到底物后，釋放酸性磷酸，形成?；钢虚g體?？赏ㄟ^(guò)含氧陰離子穴中的Arg339來(lái)穩(wěn)定酰基酶復(fù)合物。然后發(fā)生氨的親核進(jìn)攻。因?yàn)槊傅娜ハ佘挣；问接稍诘蘖織l件下的細(xì)胞產(chǎn)生，所以認(rèn)為NH4+完全離解為NH3+H+，是NH3而不是NH/被帶到活性位點(diǎn)。已經(jīng)顯示出(NH4)2S04水溶液離解為2NH4+和S042+。然而，在稀釋溶液中，因?yàn)闈舛融呌跓o(wú)限稀釋，所以認(rèn)為2NH4+進(jìn)一步離解為2NH3和2H+。因此，有可能發(fā)生可能的第三種機(jī)理，所述機(jī)理涉及促進(jìn)氨對(duì)?；傅挠H核進(jìn)攻。這是"氣相"或"無(wú)溶劑"的反應(yīng)。涉及陰離子和極性分子的雙分子親核取代反應(yīng)的速率從氣相到極性介質(zhì)(溶劑)改變20個(gè)數(shù)量級(jí)以上(Olmstead，W.N.和J.I.Brauman(1977)J.Am.Chem.Soc.99:4219-4228;Pellerite，M.J.和J.I.Brauman(1980)J.Am.Chem.Soc.102:5993-5999;Shaik，S.S.和A.Pross(1982)J,Am.Chem.Soc.104:2708-2719;Chandrasekhar，J.，Smith,S.F.和W.L.Jorgensen(1984)J.Am.Chem.Soc.106:3049-3050;Chandrasekhar,J.，Smith,S.F.和W.L.Jorgensen(1985)J.Am.Chem.Soc.107:154-163;Chandrasekhar,J.和W.L.Jorgensen(1985)J.Am.Chem.Soc.107:2974-2975)。有人認(rèn)為這歸因于氫鍵強(qiáng)度降低引起的水化導(dǎo)致活化能的提高。離子(親核體)去溶劑化所需的能量消除了離子偶極力。水化產(chǎn)生的具有分散電荷分布的過(guò)渡態(tài)與溶劑形成較弱氫鍵。由此產(chǎn)生了具有顯著大于氣相的、大而窄的中心能壘的單峰能量圖譜。因此有假設(shè)認(rèn)為在氨濃度非常低的情況下，活性位點(diǎn)"關(guān)閉"，由此降低或消除了活性位點(diǎn)內(nèi)的溶劑可接近區(qū)域，使得氣相類型的反應(yīng)發(fā)生。當(dāng)酶去腺苷?；⑶乙訫g"形式發(fā)揮作用時(shí)可能發(fā)生此現(xiàn)象。這也解釋了在低底物濃度時(shí)，酶對(duì)氨具有非常低的Km的原因。因?yàn)锳TP水解為生成的谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化效率低至36%，因此，在突變酶Y397V、S52AS53AY397V、H210VY397V和H211VY397V的酶反應(yīng)中，H20的不利影響很明顯?？傊?，數(shù)據(jù)顯示谷氨酰胺合成酶在由第一步反應(yīng)合成的Y-谷氨酰磷酸形成谷氨酰胺過(guò)程中使用的反應(yīng)機(jī)理通過(guò)類似于絲氨酸蛋白酶使用的兩個(gè)催化三聯(lián)體而發(fā)生。對(duì)于腺苷?；问降拇竽c桿菌酶，這些催化三聯(lián)體包括Ser52'、His211和Glul29，而對(duì)于去腺苷?；问降拇竽c桿菌酶包括Ser53'、His210和Glu357。本文已經(jīng)描述了本發(fā)明的一些實(shí)施方式。然而，可以理解的是，在不偏離本發(fā)明精神和保護(hù)范圍的條件下，可作出各種修改。因此，其它實(shí)施方式也落在以下權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種產(chǎn)生谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)活性的試驗(yàn)抑制劑的計(jì)算機(jī)輔助方法，所述方法使用包括處理器和輸入設(shè)備的程序式計(jì)算機(jī)，所述方法包括(a)向所述輸入設(shè)備輸入包括谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)；(b)使用所述處理器將試驗(yàn)抑制劑分子對(duì)接到所述谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)內(nèi)；以及(c)基于所述對(duì)接，確定所述試驗(yàn)抑制劑分子是否抑制所述谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的活性。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，進(jìn)一步包括將，谷氨酰磷酸部分對(duì)接到所述活性位點(diǎn)內(nèi)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括生成由步驟(c)確定的試驗(yàn)抑制劑以抑制所述谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的活性并體外評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)谷氨酰胺合成酶多肽的抑制活性。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述體外評(píng)價(jià)包括使用能測(cè)量ATP水解、ADP形成、AMP形成、谷氨酸利用或谷氨酰胺形成的分析法。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，進(jìn)一步包括體外評(píng)價(jià)相對(duì)于去腺苷?；墓劝滨０泛铣擅付嚯?，所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)腺苷酰化的谷氨酰胺合成酶多肽有差別的抑制活性。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，進(jìn)一步包括生成所述試驗(yàn)抑制劑并評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)含有GSI-a或GSI-p谷氨酰胺合成酶基因的細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制活性。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述GSI-P細(xì)菌選自GSI-p細(xì)菌可選自白喉棒狀桿菌、淋球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌、傷寒沙門氏桿菌、肺炎克雷伯菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、普通變形桿菌、痢疾志賀菌、霍亂弧菌、銅綠假單孢菌、糞產(chǎn)堿桿菌、幽門螺桿菌、流感嗜血桿菌、百日咳桿菌、支氣管炎博德特菌、腦膜炎奈瑟菌、羊布魯氏菌、結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、梅毒密螺旋體、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體、衣氏放線菌、星形諾卡菌、氧化亞鐵硫桿菌、巴西固氮螺菌、魚(yú)腥藻、Fremyelladiplosiphon和天藍(lán)色鏈霉菌，以及其中所述GSI-a細(xì)菌可選自蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、破傷風(fēng)梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述GSI-P細(xì)菌是結(jié)核分枝桿菌。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，進(jìn)一步包括評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)真核細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。11.一種產(chǎn)生抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)活性的化合物的方法，所述方法包括(a)提供谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)；以及(b)基于所述三維結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)能抑制所述谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)和"谷氨酰磷酸中間體之間相互作用的試驗(yàn)化合物。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述試驗(yàn)化合物能抑制所述谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的腺苷?；呋?lián)體位點(diǎn)和，谷氨酰磷酸中間體之間的相互作用，或者能抑制所述谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的去腺苷?；呋?lián)體位點(diǎn)和，谷氨酰磷酸中間體之間的相互作用。13.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的方法，其中所述試驗(yàn)化合物能抑制在所述谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的腺苷酰化催化三聯(lián)體位點(diǎn)中?；?酶中間體的形成，或者能抑制在所述谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的去腺苷?；呋?lián)體位點(diǎn)中?；?酶中間體的形成。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，進(jìn)一步包括生成步驟(b)的所述試驗(yàn)化合物并體外評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)化合物對(duì)谷氨酰胺合成酶多肽的抑制活性。15.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，進(jìn)一步包括生成步驟(b)的所述試驗(yàn)化合物并評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)化合物對(duì)含有GSI-a或GSI-卩谷氨酰胺合成酶基因的細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制活性。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中含有GSI-P基因的所述細(xì)菌選自白喉棒狀桿菌、淋球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌、傷寒沙門氏桿菌、肺炎克雷伯菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、普通變形桿菌、痢疾志賀菌、霍亂弧菌、銅綠假單孢菌、糞產(chǎn)堿桿菌、幽門螺桿菌、流感嗜血桿菌、百曰咳桿菌、支氣管炎博德特菌、腦膜炎奈瑟菌、羊布魯氏菌、結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、梅毒密螺旋體、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體、衣氏放線菌、星形諾卡菌、氧化亞鐵硫桿菌、巴西固氮螺菌、魚(yú)腥藻、Fremydladiplosiphon和天藍(lán)色鏈霉菌，其中含有GSI-a基因的所述細(xì)菌選自蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、破傷風(fēng)梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌。17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，進(jìn)一步包括評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)化合物對(duì)真核細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。19.一種產(chǎn)生抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的催化三聯(lián)體位點(diǎn)活性的試驗(yàn)化合物的方法，所述方法包括(a)提供包括谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的催化三聯(lián)體位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)；以及(b)基于所述三維結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)能形成帶有所述催化三聯(lián)體位點(diǎn)的殘基的?；?酶中間體的試驗(yàn)化合物。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述試驗(yàn)化合物能形成帶有對(duì)應(yīng)于大腸桿菌的谷氨酰胺合成酶多肽的Ser52或Ser53的所述結(jié)構(gòu)中的殘基的?；?酶中間體。21.—種體外篩選試驗(yàn)蛋白酶抑制劑化合物以確定所述試驗(yàn)蛋白酶抑制劑化合物是否抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)活性的方法，所述方法包括(a)使谷氨酰胺合成酶多肽與試驗(yàn)蛋白酶抑制劑化合物接觸；以及(b)確定相對(duì)于還沒(méi)有與所述試驗(yàn)絲氨酸蛋白酶抑制劑化合物接觸過(guò)的谷氨酰胺合成酶多肽的活性，所述谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)的活性是否有所降低。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中通過(guò)使用能測(cè)量ATP水解、ADP形成、AMP形成、谷氨酸利用或谷氨酰胺形成的分析法，測(cè)量所述谷氨酰胺形成位點(diǎn)的活性。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述試驗(yàn)蛋白酶抑制劑化合物是試驗(yàn)絲氨酸蛋白酶抑制劑化合物。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中在步驟(a)中，試驗(yàn)蛋白酶抑制劑化合物的文庫(kù)逐一與所述谷氨酰胺合成酶多肽接觸。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述文庫(kù)是試驗(yàn)絲氨酸蛋白酶抑制劑化合物的文庫(kù)。26.—種用于抑制GS多肽的谷氨酰胺形成活性位點(diǎn)活性的體外方法，所述方法包括使GS多肽與含有絲氨酸蛋白酶抑制劑的組合物接觸。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述絲氨酸蛋白酶抑制劑是肽基-精氨酸醛衍生物、吡咯并吡啶垸衍生物、喹啉酮衍生物或1-甲基苯并咪唑衍生物。28.—種用于抑制含有GSI-a或GSI-p基因的細(xì)菌生長(zhǎng)的體外方法，所述方法包括使所述細(xì)菌與含有絲氨酸蛋白酶抑制劑的組合物接觸。29.—種用于治療、預(yù)防或改善與哺乳動(dòng)物細(xì)菌感染有關(guān)的一種或多種癥狀或障礙的方法，其中所述細(xì)菌感染由含有GSI-a或GSI-P基因的細(xì)菌引起，所述方法包括將含有絲氨酸蛋白酶抑制劑的組合物給予所述哺乳動(dòng)物。30.—種用于抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成位點(diǎn)活性的體內(nèi)方法，所述方法包括將含有絲氨酸蛋白酶抑制劑的組合物給予懷疑遭受或正在遭受細(xì)菌感染的哺乳動(dòng)物，其中所述細(xì)菌感染由含有GSI-a或GSI-I3基因的細(xì)菌引起。31.根據(jù)權(quán)利要求28-30中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述含有GSI-P基因的細(xì)菌選自白喉棒狀桿菌、淋球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌、傷寒沙門氏桿菌、肺炎克雷伯菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、普通變形桿菌、痢疾志賀菌、霍亂弧菌、銅綠假單孢菌、糞產(chǎn)堿桿菌、幽門螺桿菌、流感嗜血桿菌、百日咳桿菌、支氣管炎博德特菌、腦膜炎奈瑟菌、羊布魯氏菌、結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、梅毒密螺旋體、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體、衣氏放線菌、星形諾卡菌、氧化亞鐵硫桿菌、巴西固氮螺菌、魚(yú)腥藻、Fremyelladiplosiphon和天藍(lán)色鏈霉菌。32.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。全文摘要本發(fā)明提供一種篩選和設(shè)計(jì)作為谷氨酰胺合成酶抑制劑的化合物的方法。本發(fā)明還提供對(duì)治療、預(yù)防和/或改善包括結(jié)核分枝桿菌的細(xì)菌感染有用的化合物以及含有該化合物的組合物，所述化合物例如為絲氨酸蛋白酶抑制劑。文檔編號(hào)G01N33/68GK101443353SQ200680054601公開(kāi)日2009年5月27日申請(qǐng)日期2006年3月15日優(yōu)先權(quán)日2006年3月15日發(fā)明者林登·凱里·奧德菲爾德,科林·彼得·凱尼恩申請(qǐng)人:Csir公司