一種mes,nhs殘留的hplc檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種MES,NHS殘留的HPLC檢測(cè)方法，是采用反相C18硅膠鍵合色譜柱，流動(dòng)相由pH6.5~6.8的磷酸鹽緩沖液和有機(jī)溶劑組成，檢測(cè)波長(zhǎng)205~210nm；所述有機(jī)溶劑為甲醇或乙腈。該方法樣品無(wú)需特殊處理，操作方法簡(jiǎn)單易行，準(zhǔn)確度高，能夠滿足實(shí)際檢測(cè)中的需要，MES和NHS這兩種物質(zhì)的檢測(cè)能夠達(dá)到微克級(jí)。
【專利說(shuō)明】-種MES, NHS殘留的HPLC檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種MES，NHS殘留的HPLC檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 在現(xiàn)今較為穩(wěn)定的化學(xué)交聯(lián)方法中，碳二亞胺的交聯(lián)體系越來(lái)越受到關(guān)注，碳二 亞胺的交聯(lián)體系能夠應(yīng)用于生物多糖、多肽、蛋白質(zhì)，核酸以及高分子改性等各個(gè)生物、有 機(jī)合成等領(lǐng)域，其本身毒性小，交聯(lián)效果迅速，結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)都極好地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)采用甲 醛，戊二醛交聯(lián)方式所帶來(lái)的安全性等問(wèn)題。相比于熱交聯(lián)等物理交聯(lián)方法而言，碳二亞胺 的交聯(lián)體系更為穩(wěn)定，交聯(lián)出的產(chǎn)品更加均一。2-嗎啉乙磺酸(MES)在交聯(lián)體系中提供較 為穩(wěn)定的PH范圍，為EDC的交聯(lián)反應(yīng)提供穩(wěn)定的酸堿環(huán)境，N-羥基丁二酰亞胺（NHS)為交 聯(lián)反應(yīng)中穩(wěn)定交聯(lián)產(chǎn)生的中間體。這兩種物質(zhì)在碳二亞胺的交聯(lián)體系中為交聯(lián)提供條件的 重要物質(zhì)，在制藥工程中，NHS還是半合成卡那霉素及醫(yī)藥中間體的原料。在交聯(lián)工藝完成 以后，交聯(lián)劑本身的殘留定量檢測(cè)就成為一個(gè)亟待解決的問(wèn)題，在ICH(The International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議)在《Q3AR2:新原料 藥中雜質(zhì)》中規(guī)定，每日最大劑量的藥物中，其含有的雜質(zhì)界定閾值為〇. 1%或者lmg，現(xiàn)今， 對(duì)于MES和NHS作這兩種交聯(lián)物質(zhì)的微量殘留檢測(cè)方法還不完善。這為碳二亞胺交聯(lián)體系 在藥物或者醫(yī)療器械的廣泛應(yīng)用帶來(lái)了限制，篩選一種MES和NHS有效的檢測(cè)方法對(duì)于碳 二亞胺交聯(lián)體系的廣泛應(yīng)用有著重要意義。
[0003] 2-嗎啉乙磺酸（MES)和N-羥基丁二酰亞胺（NHS)這兩種物質(zhì)極性較大，其在水中 的溶解度較大，這實(shí)際上為兩種物質(zhì)實(shí)現(xiàn)單獨(dú)定量增加了困難。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種精確度較高，能夠滿足實(shí)際需求 的MES，NHS殘留的HPLC檢測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明的MES，NHS殘留的HPLC檢測(cè)方法，采用反相C18硅膠鍵合色譜柱，流動(dòng)相由 pH值為6. 5飛.8的磷酸鹽緩沖液和有機(jī)溶劑組成，檢測(cè)波長(zhǎng)205~210nm ;所述有機(jī)溶劑為甲 醇或乙腈。
[0006] 其中所述的磷酸鹽緩沖液為《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版二部，附錄X V D緩 沖液部分記載的pH值在6. 5飛.8范圍內(nèi)的磷酸鹽緩沖液。
[0007] HPLC檢測(cè)方法具有定量準(zhǔn)確、檢測(cè)周期短等優(yōu)點(diǎn)，是較為適于進(jìn)行微量檢測(cè)的方 法之一。而要實(shí)現(xiàn)MES和NHS的HPLC單獨(dú)定量檢測(cè)就必須首先實(shí)現(xiàn)這兩種物質(zhì)之間的分 離度R > 1. 5。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，兩種物質(zhì)的分離度和流動(dòng)相的組分，流動(dòng)相的pH值，流動(dòng)相 配比等多種因素相關(guān)，綜合性考察各方面因素后得出上述檢測(cè)方法，能夠獲得良好的分析 結(jié)果。
[0008] 作為優(yōu)選方案，所述磷酸鹽緩沖液與有機(jī)溶劑的體積比為95:5~98:2。由于MES和 NHS都極易溶于水而從色譜柱中洗脫出來(lái)，會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間不夠而分離度較低，所以有機(jī)溶 劑的體積含量不能太大，水相和有機(jī)相的體積比在95:5~98:2比較合適，滿足MES和NHS兩 種物質(zhì)之間的分離度R > 1. 5的要求。其中以磷酸鹽緩沖液與有機(jī)溶劑體積比為97:3的 比例混合最佳，采用單通道分析，最大程度克服因?yàn)楦咝б合嗌V儀的泵頭計(jì)量等因素，在 水相和有機(jī)相比例懸殊時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致的計(jì)量不準(zhǔn)確問(wèn)題。
[0009] 作為優(yōu)選方案，所述有機(jī)溶劑為甲醇。MES和NHS在甲醇中的保留時(shí)間差別較大， 更有利于兩種物質(zhì)的單獨(dú)定量檢測(cè)，磷酸鹽緩沖液和甲醇體積比為97:3,選擇該比例的混 合液作為流動(dòng)相，MES和NHS的分離度可以達(dá)到2. 3,可以保證檢測(cè)結(jié)果更加精確。
[0010] 作為優(yōu)選方案，磷酸鹽緩沖液的pH值為6. 5,用該pH值的磷酸鹽緩沖液與有機(jī)相 組成的流動(dòng)相，相較于其他PH值分離效果更優(yōu)。
[0011] 作為優(yōu)選方案，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。選擇該檢測(cè)波長(zhǎng)值，能夠進(jìn)一步降低邊緣吸收。
[0012] 作為優(yōu)選方案，流動(dòng)相流速為I. OmL/min。流速過(guò)快會(huì)導(dǎo)致分離物質(zhì)太快出峰，分 離度不好，過(guò)慢會(huì)導(dǎo)致物質(zhì)峰形變寬而影響峰形，本發(fā)明的檢測(cè)方法中I. OmL/min的流速 最為適合。
[0013] 作為優(yōu)選方案，反相C18硅膠鍵合色譜柱可以選擇商品ZORBAX. SB-C18。這種類型 的色譜柱能夠較好適用于本發(fā)明方法且價(jià)格相對(duì)便宜，可以降低檢測(cè)成本。
[0014] 作為優(yōu)選方案，所述色譜柱內(nèi)徑4. 6mm，柱長(zhǎng)250mm，填料粒徑5 iim。柱長(zhǎng)過(guò)短容易 造成分離物質(zhì)出峰太快，保留時(shí)間較短等缺陷，250mm柱長(zhǎng)能夠很好地克服該缺陷，使檢測(cè) 方法更加穩(wěn)定可控。
[0015] 作為優(yōu)選方案，進(jìn)樣量為l〇y L，選擇該進(jìn)樣量能夠使被檢測(cè)物質(zhì)在檢測(cè)波長(zhǎng)段內(nèi) 出的響應(yīng)高低適中，進(jìn)一步增加檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。
[0016] 作為優(yōu)選方案，還包括配制MES的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和NHS的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別注入色譜 儀，記錄色譜圖，繪制MES的標(biāo)準(zhǔn)曲線和NHS的標(biāo)準(zhǔn)曲線；供試樣品按照與標(biāo)準(zhǔn)品溶液相同 的條件進(jìn)行HPLC檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定供試樣中MES和NHS的含量。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明的MES，NHS殘留的HPLC檢測(cè)方法，樣品無(wú)需特殊處理，操作方法簡(jiǎn)單易行，準(zhǔn)確 度高，NHS和MES在20 ii g/mL飛O ii g/mL范圍內(nèi)有較為良好的線性范圍，能夠滿足實(shí)際檢測(cè) 中的需要,這兩種物質(zhì)的檢測(cè)能夠達(dá)到微克級(jí)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1 :流動(dòng)相比例為97:3樣品色譜圖； 圖2 :NHS標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖3 :MES標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖4:標(biāo)準(zhǔn)曲線空白-純化水； 圖5:1#樣品色譜圖； 圖6:2#樣品色譜圖； 圖7:3#樣品色譜圖； 圖8 :4#樣品色譜圖； 圖9:5#樣品色譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 1 ?設(shè)備信息 色譜儀：島津高效液相色譜儀LC-20AB ; 色譜柱：Z0RBAX. SB-C18 4. 6mm*250mm*5 ii m ; 進(jìn)樣量：10iiL。
[0020] 2.高效液相色譜法對(duì)MES和NHS檢測(cè)方法考察 2. I MES和NHS試驗(yàn)液的配制 MES試驗(yàn)液（300ii g/mL):精密稱取樣品30. 09mg，用純化水溶解，定容至100mL。
[0021] NHS試驗(yàn)液（300 ii g/mL):精密稱取樣品30. 07mg，用純化水溶解，定容至100mL。
[0022] 2. 2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 分別取MES和NHS的試驗(yàn)液在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果表明，NHS 從300nm開(kāi)始出現(xiàn)吸收，至200nm處達(dá)到最大，MES自220nm處出現(xiàn)吸收，200nm處達(dá)到最 大，因?yàn)榱鲃?dòng)相的有機(jī)相在200nm處存在邊緣吸收，因此最終選擇210nm作為HPLC的檢測(cè) 波長(zhǎng)。
[0023] 2. 3流動(dòng)相的選擇 在流動(dòng)相中，有機(jī)相和水相，緩沖物質(zhì)以及PH對(duì)于樣品的分離都存在影響。
[0024] 2. 3. 1有機(jī)相選擇 水相為磷酸鹽緩沖液，分別采用甲醇和乙腈進(jìn)行分離，結(jié)果見(jiàn)表1。

【權(quán)利要求】
1. 一種MES，NHS殘留的HPLC檢測(cè)方法，其特征在于，采用反相C18硅膠鍵合色譜柱，流 動(dòng)相由pH值為6. 5飛.8的磷酸鹽緩沖液和有機(jī)溶劑組成，檢測(cè)波長(zhǎng)205~210nm ;所述有機(jī) 溶劑為甲醇或乙腈。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測(cè)方法，其特征在于，磷酸鹽緩沖液 與有機(jī)溶劑的體積比為95:5~98:2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測(cè)方法，其特征在于，磷酸鹽緩沖液 與有機(jī)溶劑的體積比為97:3。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測(cè)方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑 為甲醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測(cè)方法，其特征在于，磷酸鹽緩沖液 的pH值為6. 5。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測(cè)方法，其特征在于，檢測(cè)波長(zhǎng)為 210nm〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測(cè)方法，其特征在于，流動(dòng)相流速為 1. OmT,/mi n 〇
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測(cè)方法，其特征在于，所述色譜柱內(nèi) 徑4. 6mm，柱長(zhǎng)250mm，填料粒徑5 u m。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測(cè)方法，其特征在于，進(jìn)樣量為 10 U L〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測(cè)方法，其特征在于，還包括配制 MES的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和NHS的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別注入色譜儀，記錄色譜圖，繪制MES的標(biāo)準(zhǔn)曲線 和NHS的標(biāo)準(zhǔn)曲線；供試樣品按照與標(biāo)準(zhǔn)品溶液相同的條件進(jìn)行HPLC檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 確定供試樣中MES和NHS的含量。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK104407077SQ201410839225
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月30日
【發(fā)明者】楊中科, 龔彥銘, 陳衛(wèi)英, 丁祥, 李娟 , 李好雨, 張兆利, 楊安順, 蔣小龍, 彭紅衛(wèi) 申請(qǐng)人:蘇州達(dá)普生物技術(shù)有限公司