本發(fā)明涉及一種食品中雙甲脒的檢測方法，特別涉及一種食品中雙甲脒的氣相-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。
背景技術(shù)：
：雙甲脒（N,N-雙(2,4-二甲苯亞氨基甲基)甲胺）是一種殺蟲劑。在棉花中，雙甲脒可用于控制螟蛉蟲、粉虱以及斜紋夜蛾；畜牧業(yè)中，則常用其來控制蜱、螨、虱及其它的動物寄生蟲。普遍認為雙甲脒具有毒性，因此許多國家都制定了雙甲脒在食品中的最大殘留限量。目前雙甲脒的檢測方法有液相色譜法、氣相色譜法、氣相質(zhì)譜聯(lián)用法等。液相色譜法的檢出限高、分離度比較差，而且有干擾峰的影響很難解決。氣相色譜法（GB29707-2013牛奶中雙甲脒殘留標志物殘留量的測定氣相色譜法）用正己烷提取再用七氟丁酸酐衍生生成2,4二甲基苯七氟丁酰胺，ECD檢測器檢測，外標法定量；該方法的回收率、檢出限仍不理想，而且還有假陽性等干擾現(xiàn)象。因此這些方法不能滿足雙甲脒的檢測要求。在農(nóng)業(yè)部公告781-8-2006蜂蜜中雙甲脒殘留量的測定氣相色譜－質(zhì)譜法中，公開了一種氣相質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS法）用于檢測雙甲脒含量。GC-MS法是直接用正己烷提取目標物上機，選擇離子掃描（SIM）模式檢測，方法中前處理簡單，但是SIM模式響應值小、同時檢出限仍比較高，滿足不了基質(zhì)復雜（例如牛奶）及檢出限要求高的樣品的檢測。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種雙甲脒的檢測方法，適用于多種成分的基質(zhì)（如牛奶、蜂蜜、蔬菜、水果和稻谷），且檢出限高。本發(fā)明提供了一種食品中雙甲脒的檢測方法，包括：提取，得到提取液；水解，將提取液水解得到水解液；衍生，水解液和衍生劑反應后得到衍生液；凈化，將衍生液凈化得到凈化液；以及儀器測定步驟，儀器測定為對凈化液進行氣相-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。在食品中雙甲脒的檢測方法的一種示意性實施方式中，提取步驟為：稱取待測食品5±0.05g，于聚丙烯離心管中，加堿性水溶液10mL，漩渦混勻，5000r/分鐘離心10分鐘，取上清液于另一聚丙烯離心管中，殘渣中加堿性水溶液10mL，重復提取一次，合并兩次上清液，得到提取液。在食品中雙甲脒的檢測方法的一種示意性實施方式中，水解步驟為：將提取液放置在70℃恒溫干燥箱中靜置50分鐘，冷卻，加正己烷10mL，漩渦混勻，靜置5分鐘，5000r/分鐘離心10分鐘，取上層正己烷液于試管中，下層液加正己烷5mL重復萃取一次，合并兩次正己烷層液，于45℃氮吹至凈干，用正己烷2.0mL溶解殘余物，得到水解液。在食品中雙甲脒的檢測方法的一種示意性實施方式中，凈化步驟為：衍生液加飽和碳酸氫鈉溶液3mL，混勻，取有機相層，加無水硫酸鈉5g去水，得到凈化液。在食品中雙甲脒的檢測方法的一種示意性實施方式中，衍生劑采用?；瘎?。在食品中雙甲脒的檢測方法的一種示意性實施方式中，?；瘎槠叻∷狒?；其中氣相-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，質(zhì)譜的目標離子為：2，4-二甲基苯七氟丁酰胺目標母離子m/z為317.1，碎片子離子m/z分別為119.8和147.9。在食品中雙甲脒的檢測方法的一種示意性實施方式中，衍生步驟為：取水解液于具塞離心管中，加七氟丁酸酐10μL，混勻，于60℃恒溫90分鐘，其間每隔30分鐘，取出超聲5分鐘，衍生后靜置5分鐘，得到衍生液。在食品中雙甲脒的檢測方法的一種示意性實施方式中，氣相-串聯(lián)質(zhì)譜法測定步驟包括：色譜柱：VF-5MS毛細管柱（長度30m，內(nèi)徑0.25mm,膜厚0.25um）；載氣：氦氣，恒流模式；柱流速：1.0mL/分鐘;進樣方式:不分流進樣,1分鐘后開閥分流比20:1;進樣量1μL,進樣口溫度:280℃;柱溫:初始溫度70℃保持2分鐘，以10℃/分鐘升至160℃，再以20℃/分鐘升到280℃并保持2分鐘；質(zhì)譜條件：電子轟擊源（EI）：70eV；碰撞氣：氬氣；離子源溫度：200℃；接口溫度：280℃；溶劑延遲7.0分鐘；掃描方式：碎片離子掃描（MS/MS），2，4-二甲基苯七氟丁酰胺目標母離子m/z為317.1，碎片子離子m/z為119.8和147.9，對應的碰撞能量分別為30V和20V。在食品中雙甲脒的檢測方法的一種示意性實施方式中，包括：1.1標準曲線的制備：準確量取2,4-二甲基苯胺標準儲備液適量，用正己烷稀釋，配置成濃度為5、10、20、40、80、160ng/ml的系列標準溶液，各取1.0mL，按“1.3衍生和1.4凈化”步驟處理，供氣相色譜測定。以測得峰面積為縱坐標，對應的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。求回歸方程和相關系數(shù)；1.2提?。涸趬A性條件下提取待測物中的雙甲脒，步驟如下：稱取待測食品（5±0.05）g，于聚丙烯離心管中，加堿性水溶液10mL，漩渦混勻，5000r/分鐘離心10分鐘，取上清液于另一聚丙烯離心管中，殘渣中加堿性水溶液10mL，重復提取一次，合并兩次上清液，得到提取液；1.3水解：提取后的雙甲脒水解成2、4-二甲基苯胺，再用正己烷提取水解產(chǎn)物2、4-二甲基苯胺；步驟如下：將提取液放置在70℃恒溫干燥箱中靜置50分鐘，冷卻，加正己烷10mL，漩渦混勻，靜置5分鐘，5000r/分鐘離心10分鐘，取上層正己烷液于試管中，下層液加正己烷5mL重復萃取一次，合并兩次正己烷層液，于45℃氮吹至凈干，用正己烷2.0mL溶解殘余物，得到水解液備用；1.4衍生：水解產(chǎn)物2、4-二甲基苯胺和衍生劑七氟丁酸酐反應生成2、4-二甲基苯七氟丁酰胺，步驟如下：取水解液于具塞離心管中，加七氟丁酸酐10μL，混勻，于60℃恒溫90分鐘，其間每隔30分鐘取出超聲5分鐘。衍生后靜置5分鐘，得到衍生液；1.5凈化：用飽和碳酸氫鈉溶液凈化衍生產(chǎn)物，取有機層上清液（含2、4-二甲基苯七氟丁酰胺的正己烷溶液）再用無水硫酸鈉除水；步驟如下：衍生液中加飽和碳酸氫鈉溶液3mL，混勻，取有機相層，加無水硫酸鈉5g去水，得到凈化液，供氣相色譜質(zhì)譜串聯(lián)儀測定；2.1色譜條件：色譜柱：VF-5MS毛細管柱（長度30m，內(nèi)徑0.25mm,膜厚0.25um），或相當者；載氣：氦氣，恒流模式；柱流速：1.0mL/分鐘;進樣方式:不分流進樣,1分鐘后開閥分流比20:1;進樣量1μL,進樣口溫度:280℃;柱溫:初始溫度70℃保持2分鐘，以10℃/分鐘升至160℃，再以20℃/分鐘升到280℃并保持2分鐘；2.2質(zhì)譜條件：電子轟擊源（EI）：70eV；碰撞氣：氬氣；離子源溫度：200℃；接口溫度：280℃；溶劑延遲7.0分鐘；掃描方式：碎片離子掃描（MS/MS），2，4-二甲基苯七氟丁酰胺目標母離子為m/z317.1，碎片子離子為m/z119.8和147.9并對應的碰撞能量分別為30和20。本發(fā)明提供的一種食品中雙甲脒的檢測方法，使用氣相色譜質(zhì)譜串聯(lián)儀選擇一個母離子和兩個子離子進行準確定性、完全避免了樣品的基質(zhì)影響導致的假陽性。現(xiàn)有的衍生劑如：乙酸酐、乙酰氯、三氟乙酸酐、二氯亞砜和七氟丁酸酐等同樣有?；饔?，都可用于氣相色譜分析（GC）。優(yōu)選的衍生劑七氟丁酸酐作為?；噭?，可以跟目標物（2、4、-二甲基苯胺）上的氨基進行酰化反應。附圖說明圖1是本發(fā)明實施例1氣相-串聯(lián)質(zhì)譜方法（GC-MS/MS）空白樣品和標準品的對比色譜圖。圖2是氣相色譜法的假陽性樣品和標準品的對比色譜圖。圖3是氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）假陽性樣品和標準品對比色譜圖。具體實施方式為了對發(fā)明的技術(shù)特征、目的和效果有更加清楚的理解，現(xiàn)結(jié)合以下實施例說明本發(fā)明的具體實施方式。實施例1：雙甲脒檢測方法。1、試劑及溶液雙甲脒標準品：含量≥99％；2，4-二甲基苯胺標準品：含量≥95％；1mol/L氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉40g,用水溶解并稀釋至1000ml；堿性水溶液：量取水1000ml,用1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)PH至9.0；飽和碳酸氫鈉溶液：取碳酸氫鈉40g,用水溶解并稀釋至1000ml；1mg/ml雙甲脒和2.4-二甲基苯胺標準儲備液：稱取雙甲脒和2,4-二甲基苯胺標準品各10mg,分別于10ml容量瓶中，用正己烷溶解定容到刻度；氫氧化鈉：分析純，碳酸氫鈉：分析純，無水硫酸鈉：分析純，七氯丁酸酐：色譜純，正己烷：色譜純。2、儀器設備氣相色譜質(zhì)譜串聯(lián)儀（GC-MS/MS）,萬分之一分析天平，離心機，漩渦混合器，均質(zhì)機，恒溫干燥箱，聚丙烯離心管，具塞離心管。3、樣品前處理3.1標準曲線的制備準確量取2,4-二甲基苯胺標準儲備液適量，用正己烷稀釋，配置成濃度為5、10、20、40、80、160ng/ml的系列標準溶液，各取1.0mL，按衍生步驟處理，供氣相色譜質(zhì)譜串聯(lián)儀測定。以測得峰面積為縱坐標，對應的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。求回歸方程和相關系數(shù)。3.2提取和水解稱取試樣（5±0.05）g，于聚丙烯離心管中，加堿性水溶液10mL，漩渦混勻，5000rpm離心10分鐘，取上清液于另一聚丙烯離心管中，殘渣中加堿性水溶液10mL，重復提取一次，合并兩次上清液。于70℃恒溫干燥箱中靜置50分鐘，冷卻，加正己烷10mL，漩渦混勻，靜置5分鐘，5000rpm離心10分鐘，取上層正己烷液于試管中，下層液加正己烷5mL重復萃取一次，合并兩次正己烷層液，于45℃氮吹至凈干，用正己烷2.0mL溶解殘余物，得到水解液備用。3.3衍生和凈化取水解液于具塞離心管中，加七氟丁酸酐10μL，混勻，于60℃恒溫90分鐘，其間每隔30分鐘取出超聲5分鐘。衍生后靜置5分鐘，加飽和碳酸氫鈉溶液3mL，混勻，取有機相層，加無水硫酸鈉5g去水，供氣相色譜質(zhì)譜串聯(lián)儀測定。4、色譜條件:色譜柱：VF-5MS毛細管柱（30m×0.25mm,0.25um），或相當者；載氣：氦氣，恒流模式；柱流速：1.0mL/分鐘;進樣方式:不分流進樣,1分鐘后開閥分流比20:1;進樣量1μL,進樣口溫度:280℃;柱溫:初始溫度70℃保持2分鐘，以10℃/分鐘升至160℃，再以20℃/分鐘升到280℃并保持2分鐘。5、質(zhì)譜條件：電子轟擊源（EI）：70eV；碰撞氣：氬氣；離子源溫度：200℃；接口溫度：280℃；溶劑延遲7.0分鐘；掃描方式：碎片離子掃描（MS/MS），2，4-二甲基苯七氟丁酰胺目標母離子為m/z317.1，碎片子離子為m/z119.8和147.9，碰撞能量分別為30和20；（見圖1、2、3）。6、方法檢出限：檢出限試驗：將20個空白樣品通過樣品前處理方法制備成待檢測液，用GC-MS/MS進行檢測，計算20個結(jié)果的標準偏差和平均值得出方法檢出限為0.5ug/kg(s/n>3)。7、準確度和精密度通過不同基質(zhì)樣品中加入不同濃度的標準品進行加標回收率試驗得出回收率范圍在83.2～110.7%之間，RSD(%)范圍在2.34%～6.56%之間；（見表1）。表1：不同基質(zhì)樣品中不同水平加標回收率試驗（N=6）樣品理論加標量（ug/kg）平均檢測結(jié)果（ug/kg）回收率范圍（%）RSD(%)純牛奶0.5000.47983.2%～97.6%4.12%純牛奶1.001.0186.4%～109.1%6.56%純牛奶5.004.9689.7%～102.8%5.97%蜂蜜0.5000.49892,3%～104.2%2.83%蜂蜜1.000.99790,6%～104.3%3.19%蜂蜜5.005.0393.2%～103.9%2.34%蔬菜0.5000.50388.2%～104.9%3.48%蔬菜1.000.99286.7%～110.7%4.41%蔬菜5.004.9794.5%～106.8%2.68%水果0.5000.4989.4%～107.9%4.91%水果1.001.0791.8%～108.1%3.09%水果5.004.8287.6%～107.3%2.97%稻谷0.5000.48284.3%～96.8%5.62%稻谷1.001.0787.5%～109.1%6.03%稻谷5.005.0985.6%～106.2%4.89%對比實施例。對比實施例中氣相色譜法GB29707-2013樣品前處理完全按照國標方法執(zhí)行；氣相色譜-質(zhì)譜方法的前處理步驟跟實施例1完全相同，質(zhì)譜條件：SIM模式，選擇離子為（m/z）：317.1、120、121（定量離子）、148.1。用現(xiàn)有的氣相色譜法GB29707-2013和現(xiàn)有的氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）進行20個不同批次的牛奶做空白樣品進行檢測結(jié)果表明GB29707-2013氣相色譜法中有些批次空白樣品中雙甲脒含量比較高，而且有的結(jié)果高于檢出限（>2ug/kg），氣相色譜-質(zhì)譜法也能夠檢測出一些批次空白樣品中的雙甲脒；本發(fā)明實施例1的方法能夠準確定性，然而其他兩個現(xiàn)有技術(shù)方法沒有準確定性導致有假陽性現(xiàn)象；結(jié)果對比如表2所示。表2：現(xiàn)有方法和實施例1檢測（牛奶空白樣品）結(jié)果對比序號GB29707-2013檢測結(jié)果（ug/kg）氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）檢測結(jié)果（ug/kg）氣相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)（GC-MS/MS）檢測結(jié)果（ug/kg）10.000.000.0020.890.040.0030.000.000.0042.340.140.0051.090.090.0060.070.000.0070.000.000.0082.090.040.0092.110.130.00102.180.140.00110.000.000.00120.290.020.00130.980.090.00142.040.060.00152.270.100.00161.450.050.00172.190.180.00181.020.110.00190.000.000.00201.480.050.00表2數(shù)據(jù)和圖1顯示，氣相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)方法（GC-MS/MS）能夠準確定性空白樣品中的雙甲脒，沒有假陽性現(xiàn)象。然而，通過圖2可以看出，氣相色譜法GB29707-2013中假陽性樣品和標準品的保留時間比較接近現(xiàn)有的方法無法準確定性導致出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象；通過圖3還可以看出，氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）中假陽性樣品含個別定性離子導致出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。在本文中，“示意性”表示“充當實例、例子或說明”，不應將在本文中被描述為“示意性”的任何實施方式解釋為一種更優(yōu)選的或更具優(yōu)點的技術(shù)方案。在本文中，“相等”、“相同”等并非嚴格的數(shù)學和/或幾何學意義上的限制，還包含本領域技術(shù)人員可以理解的且生產(chǎn)或使用等允許的誤差。除非另有說明，本文中的數(shù)值范圍不僅包括其兩個端點內(nèi)的整個范圍，也包括含于其中的若干子范圍。應當理解，雖然本說明書是按照各個實施例描述的，但并非每個實施例僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術(shù)人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。上文所列出的一系列的詳細說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實施例的具體說明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實施方案或變更，如特征的組合、分割或重復，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3