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      一種食品中李斯特菌的檢測方法與流程

      文檔序號:12167859閱讀:478來源:國知局

      本發(fā)明涉及一種細菌檢測方法,具體是一種食品中李斯特菌的檢測方法。



      背景技術(shù):

      李斯特菌是一種人畜共患病的病原菌,它廣泛存在于自然界中。該菌在4°C的環(huán)境中仍可生長繁殖,是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。食品中存在的李斯特菌威脅著人類的健康,感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。因此,在食品衛(wèi)生微生物檢驗中,必須加以重視。

      目前,對食源性致病菌的檢測主要有標(biāo)準(zhǔn)方法、生化儀器法(API,VETEK)、酶聯(lián)熒光免疫檢測法(VIDAS)、膠體金試紙法、PCR法、基因芯片法等。微生物的傳統(tǒng)檢測方法除操作繁瑣外,檢驗時間也較長,一般需要5-15天的培養(yǎng)鑒定時間,時間上不能滿足快速檢測的要求。

      近年來發(fā)展起來的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強等優(yōu)點在基因定性檢測方面得到廣泛應(yīng)用,并且已經(jīng)成為當(dāng)前病毒核酸定性檢測的重要方法之一。

      環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技術(shù)是一種新型等溫核酸擴增方法,該法針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物,利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶,在恒溫條件(65℃左右)保溫約60min,即可完成核酸擴增反應(yīng),產(chǎn)生肉眼可見的反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀。該技術(shù)具有不需要PCR儀、擴增產(chǎn)物不需要開蓋,用肉眼即可判斷結(jié)果及反應(yīng)時間短,特異性強,靈敏度高等優(yōu)點。



      技術(shù)實現(xiàn)要素:

      本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)構(gòu)簡單、使用方便的食品中李斯特菌的檢測方法,以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

      為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:

      一種食品中李斯特菌的檢測方法,采用LAMP擴增方法,以李斯特菌prfA基因特異序列為靶序列,LAMP Visible Dye為可見光染料,隨后進行熒光定量檢測分析;具體過程包括如下步驟:

      (1)預(yù)處理:

      在無菌環(huán)境下,將食品加入到LB肉湯中,培養(yǎng)溫度為32-38℃,培養(yǎng)時間為18-20h,培養(yǎng)結(jié)束后,反復(fù)使用生理鹽水進行清洗,隨后進行提取總RNA,加入液氮研磨菌體,隨后經(jīng)過乙醇沉淀并溶解在DEPC水中;

      (2)構(gòu)建LAMP擴增反應(yīng)體系:

      DNA模板 2μL,LAMP Visible Dye 0.5μL,10×Buffer 2.5μL,DNA聚合酶 5U,反轉(zhuǎn)錄酶 10U,硫酸鋁鉀溶液0.3μL,dNTP 3μL,隨機引物 2μL,DNA引物 3μL,聚色氨酸溶液 1μL,其余用dd H2O補足至30μL;

      所述DNA模板的OD260/OD280值為1.7-1.9;

      所述LAMP Visible Dye為20-40倍稀釋;

      所述Buffer中含有NaCl、Tris-HCl(pH 8.3)、聚乙烯吡咯烷酮和三聚磷酸鈉;

      所述DNA聚合酶采用Bst聚合酶;

      所述硫酸鋁鉀溶液的濃度為8-15mmol/L;

      所述隨機引物的OD260/OD280值為1.7-1.9;

      所述DNA引物的OD260/OD280值為1.7-1.9;

      所述聚色氨酸溶液的濃度為20-40mmol/L;

      (3)擴增反應(yīng):

      將LAMP擴增加入到LAMP試劑盒中,隨后進行擴增,60-64℃保持1h;

      (4)檢測分析:

      反應(yīng)結(jié)束后,離心,肉眼觀察沉淀,對樣品進行定性分析;所述的結(jié)果判斷在陰性對照反應(yīng)管液體為橙色,陽性對照反應(yīng)管液體呈綠色的條件下:待檢樣品反應(yīng)管液體呈綠色,該樣品結(jié)果為單核增生李斯特氏菌陽性;待檢樣品反應(yīng)管液體呈橙色則可報告單核增生李斯特氏菌檢驗結(jié)果為陰性;若陰陽性對照反應(yīng)管結(jié)果與上述情況不符,則本次檢測結(jié)果無效,應(yīng)重新檢測。

      作為本發(fā)明進一步的方案:具體步驟(1)中培養(yǎng)溫度為35℃,培養(yǎng)時間為19h。

      作為本發(fā)明進一步的方案:具體步驟(2)中所述DNA模板的OD260/OD280值為1.8。

      作為本發(fā)明進一步的方案:具體步驟(2)中所述LAMP Visible Dye為30倍稀釋。

      作為本發(fā)明進一步的方案:具體步驟(2)中所述硫酸鋁鉀溶液的濃度為11mmol/L。

      作為本發(fā)明進一步的方案:具體步驟(2)中所述隨機引物的OD260/OD280值為1.8。

      作為本發(fā)明進一步的方案:具體步驟(2)中所述DNA引物的OD260/OD280值為1.8。

      作為本發(fā)明進一步的方案:具體步驟(2)中所述聚色氨酸溶液的濃度為30mmol/L。

      作為本發(fā)明進一步的方案:具體步驟(3)中62℃保持1h。

      與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果是:

      本發(fā)明具有特異性好,靈敏度高,快速簡便,可重復(fù)性高以及肉眼可判斷結(jié)果等優(yōu)點,可對工業(yè)食品中李斯特菌進行快速定性檢測,可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和血清學(xué)診斷方法。

      具體實施方式

      下面結(jié)合具體實施方式對本專利的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。

      實施例1

      一種食品中李斯特菌的檢測方法,其特征在于,采用LAMP擴增方法,以李斯特菌prfA基因特異序列為靶序列,LAMP Visible Dye為可見光染料,隨后進行熒光定量檢測分析;具體過程包括如下步驟:

      (1)預(yù)處理:

      在無菌環(huán)境下,將食品加入到LB肉湯中,培養(yǎng)溫度為32℃,培養(yǎng)時間為18h,培養(yǎng)結(jié)束后,反復(fù)使用生理鹽水進行清洗,隨后進行提取總RNA,加入液氮研磨菌體,隨后經(jīng)過乙醇沉淀并溶解在DEPC水中;

      (2)構(gòu)建LAMP擴增反應(yīng)體系:

      DNA模板 2μL,LAMP Visible Dye 0.5μL,10×Buffer 2.5μL,DNA聚合酶 5U,反轉(zhuǎn)錄酶 10U,硫酸鋁鉀溶液0.3μL,dNTP 3μL,隨機引物 2μL,DNA引物 3μL,聚色氨酸溶液 1μL,其余用dd H2O補足至30μL;

      所述DNA模板的OD260/OD280值為1.7;

      所述LAMP Visible Dye為20倍稀釋;

      所述Buffer中含有NaCl、Tris-HCl(pH 8.3)、聚乙烯吡咯烷酮和三聚磷酸鈉;

      所述DNA聚合酶采用Bst聚合酶;

      所述硫酸鋁鉀溶液的濃度為8mmol/L;

      所述隨機引物的OD260/OD280值為1.7;

      所述DNA引物的OD260/OD280值為1.7;

      所述聚色氨酸溶液的濃度為20mmol/L;

      (3)擴增反應(yīng):

      將LAMP擴增加入到LAMP試劑盒中,隨后進行擴增,60℃保持1h;

      (4)檢測分析:

      反應(yīng)結(jié)束后,離心,肉眼觀察沉淀,對樣品進行定性分析;所述的結(jié)果判斷在陰性對照反應(yīng)管液體為橙色,陽性對照反應(yīng)管液體呈綠色的條件下:待檢樣品反應(yīng)管液體呈綠色,該樣品結(jié)果為單核增生李斯特氏菌陽性;待檢樣品反應(yīng)管液體呈橙色則可報告單核增生李斯特氏菌檢驗結(jié)果為陰性;若陰陽性對照反應(yīng)管結(jié)果與上述情況不符,則本次檢測結(jié)果無效,應(yīng)重新檢測。

      實施例2

      一種食品中李斯特菌的檢測方法,其特征在于,采用LAMP擴增方法,以李斯特菌prfA基因特異序列為靶序列,LAMP Visible Dye為可見光染料,隨后進行熒光定量檢測分析;具體過程包括如下步驟:

      (1)預(yù)處理:

      在無菌環(huán)境下,將食品加入到LB肉湯中,培養(yǎng)溫度為33℃,培養(yǎng)時間為18h,培養(yǎng)結(jié)束后,反復(fù)使用生理鹽水進行清洗,隨后進行提取總RNA,加入液氮研磨菌體,隨后經(jīng)過乙醇沉淀并溶解在DEPC水中;

      (2)構(gòu)建LAMP擴增反應(yīng)體系:

      DNA模板 2μL,LAMP Visible Dye 0.5μL,10×Buffer 2.5μL,DNA聚合酶 5U,反轉(zhuǎn)錄酶 10U,硫酸鋁鉀溶液0.3μL,dNTP 3μL,隨機引物 2μL,DNA引物 3μL,聚色氨酸溶液 1μL,其余用dd H2O補足至30μL;

      所述DNA模板的OD260/OD280值為1.7;

      所述LAMP Visible Dye為25倍稀釋;

      所述Buffer中含有NaCl、Tris-HCl(pH 8.3)、聚乙烯吡咯烷酮和三聚磷酸鈉;

      所述DNA聚合酶采用Bst聚合酶;

      所述硫酸鋁鉀溶液的濃度為9mmol/L;

      所述隨機引物的OD260/OD280值為1.7;

      所述DNA引物的OD260/OD280值為1.7;

      所述聚色氨酸溶液的濃度為25mmol/L;

      (3)擴增反應(yīng):

      將LAMP擴增加入到LAMP試劑盒中,隨后進行擴增,61℃保持1h;

      (4)檢測分析:

      反應(yīng)結(jié)束后,離心,肉眼觀察沉淀,對樣品進行定性分析;所述的結(jié)果判斷在陰性對照反應(yīng)管液體為橙色,陽性對照反應(yīng)管液體呈綠色的條件下:待檢樣品反應(yīng)管液體呈綠色,該樣品結(jié)果為單核增生李斯特氏菌陽性;待檢樣品反應(yīng)管液體呈橙色則可報告單核增生李斯特氏菌檢驗結(jié)果為陰性;若陰陽性對照反應(yīng)管結(jié)果與上述情況不符,則本次檢測結(jié)果無效,應(yīng)重新檢測。

      實施例3

      一種食品中李斯特菌的檢測方法,其特征在于,采用LAMP擴增方法,以李斯特菌prfA基因特異序列為靶序列,LAMP Visible Dye為可見光染料,隨后進行熒光定量檢測分析;具體過程包括如下步驟:

      (1)預(yù)處理:

      在無菌環(huán)境下,將食品加入到LB肉湯中,培養(yǎng)溫度為35℃,培養(yǎng)時間為19h,培養(yǎng)結(jié)束后,反復(fù)使用生理鹽水進行清洗,隨后進行提取總RNA,加入液氮研磨菌體,隨后經(jīng)過乙醇沉淀并溶解在DEPC水中;

      (2)構(gòu)建LAMP擴增反應(yīng)體系:

      DNA模板 2μL,LAMP Visible Dye 0.5μL,10×Buffer 2.5μL,DNA聚合酶 5U,反轉(zhuǎn)錄酶 10U,硫酸鋁鉀溶液0.3μL,dNTP 3μL,隨機引物 2μL,DNA引物 3μL,聚色氨酸溶液 1μL,其余用dd H2O補足至30μL;

      所述DNA模板的OD260/OD280值為1.8;

      所述LAMP Visible Dye為30倍稀釋;

      所述Buffer中含有NaCl、Tris-HCl(pH 8.3)、聚乙烯吡咯烷酮和三聚磷酸鈉;

      所述DNA聚合酶采用Bst聚合酶;

      所述硫酸鋁鉀溶液的濃度為11mmol/L;

      所述隨機引物的OD260/OD280值為1.8;

      所述DNA引物的OD260/OD280值為1.8;

      所述聚色氨酸溶液的濃度為30mmol/L;

      (3)擴增反應(yīng):

      將LAMP擴增加入到LAMP試劑盒中,隨后進行擴增,62℃保持1h;

      (4)檢測分析:

      反應(yīng)結(jié)束后,離心,肉眼觀察沉淀,對樣品進行定性分析;所述的結(jié)果判斷在陰性對照反應(yīng)管液體為橙色,陽性對照反應(yīng)管液體呈綠色的條件下:待檢樣品反應(yīng)管液體呈綠色,該樣品結(jié)果為單核增生李斯特氏菌陽性;待檢樣品反應(yīng)管液體呈橙色則可報告單核增生李斯特氏菌檢驗結(jié)果為陰性;若陰陽性對照反應(yīng)管結(jié)果與上述情況不符,則本次檢測結(jié)果無效,應(yīng)重新檢測。

      實施例4

      一種食品中李斯特菌的檢測方法,其特征在于,采用LAMP擴增方法,以李斯特菌prfA基因特異序列為靶序列,LAMP Visible Dye為可見光染料,隨后進行熒光定量檢測分析;具體過程包括如下步驟:

      (1)預(yù)處理:

      在無菌環(huán)境下,將食品加入到LB肉湯中,培養(yǎng)溫度為36℃,培養(yǎng)時間為20h,培養(yǎng)結(jié)束后,反復(fù)使用生理鹽水進行清洗,隨后進行提取總RNA,加入液氮研磨菌體,隨后經(jīng)過乙醇沉淀并溶解在DEPC水中;

      (2)構(gòu)建LAMP擴增反應(yīng)體系:

      DNA模板 2μL,LAMP Visible Dye 0.5μL,10×Buffer 2.5μL,DNA聚合酶 5U,反轉(zhuǎn)錄酶 10U,硫酸鋁鉀溶液0.3μL,dNTP 3μL,隨機引物 2μL,DNA引物 3μL,聚色氨酸溶液 1μL,其余用dd H2O補足至30μL;

      所述DNA模板的OD260/OD280值為1.9;

      所述LAMP Visible Dye為35倍稀釋;

      所述Buffer中含有NaCl、Tris-HCl(pH 8.3)、聚乙烯吡咯烷酮和三聚磷酸鈉;

      所述DNA聚合酶采用Bst聚合酶;

      所述硫酸鋁鉀溶液的濃度為13mmol/L;

      所述隨機引物的OD260/OD280值為1.9;

      所述DNA引物的OD260/OD280值為1.9;

      所述聚色氨酸溶液的濃度為35mmol/L;

      (3)擴增反應(yīng):

      將LAMP擴增加入到LAMP試劑盒中,隨后進行擴增,63℃保持1h;

      (4)檢測分析:

      反應(yīng)結(jié)束后,離心,肉眼觀察沉淀,對樣品進行定性分析;所述的結(jié)果判斷在陰性對照反應(yīng)管液體為橙色,陽性對照反應(yīng)管液體呈綠色的條件下:待檢樣品反應(yīng)管液體呈綠色,該樣品結(jié)果為單核增生李斯特氏菌陽性;待檢樣品反應(yīng)管液體呈橙色則可報告單核增生李斯特氏菌檢驗結(jié)果為陰性;若陰陽性對照反應(yīng)管結(jié)果與上述情況不符,則本次檢測結(jié)果無效,應(yīng)重新檢測。

      實施例5

      一種食品中李斯特菌的檢測方法,其特征在于,采用LAMP擴增方法,以李斯特菌prfA基因特異序列為靶序列,LAMP Visible Dye為可見光染料,隨后進行熒光定量檢測分析;具體過程包括如下步驟:

      (1)預(yù)處理:

      在無菌環(huán)境下,將食品加入到LB肉湯中,培養(yǎng)溫度為38℃,培養(yǎng)時間為20h,培養(yǎng)結(jié)束后,反復(fù)使用生理鹽水進行清洗,隨后進行提取總RNA,加入液氮研磨菌體,隨后經(jīng)過乙醇沉淀并溶解在DEPC水中;

      (2)構(gòu)建LAMP擴增反應(yīng)體系:

      DNA模板 2μL,LAMP Visible Dye 0.5μL,10×Buffer 2.5μL,DNA聚合酶 5U,反轉(zhuǎn)錄酶 10U,硫酸鋁鉀溶液0.3μL,dNTP 3μL,隨機引物 2μL,DNA引物 3μL,聚色氨酸溶液 1μL,其余用dd H2O補足至30μL;

      所述DNA模板的OD260/OD280值為1.9;

      所述LAMP Visible Dye為40倍稀釋;

      所述Buffer中含有NaCl、Tris-HCl(pH 8.3)、聚乙烯吡咯烷酮和三聚磷酸鈉;

      所述DNA聚合酶采用Bst聚合酶;

      所述硫酸鋁鉀溶液的濃度為15mmol/L;

      所述隨機引物的OD260/OD280值為1.9;

      所述DNA引物的OD260/OD280值為1.9;

      所述聚色氨酸溶液的濃度為40mmol/L;

      (3)擴增反應(yīng):

      將LAMP擴增加入到LAMP試劑盒中,隨后進行擴增,64℃保持1h;

      (4)檢測分析:

      反應(yīng)結(jié)束后,離心,肉眼觀察沉淀,對樣品進行定性分析;所述的結(jié)果判斷在陰性對照反應(yīng)管液體為橙色,陽性對照反應(yīng)管液體呈綠色的條件下:待檢樣品反應(yīng)管液體呈綠色,該樣品結(jié)果為單核增生李斯特氏菌陽性;待檢樣品反應(yīng)管液體呈橙色則可報告單核增生李斯特氏菌檢驗結(jié)果為陰性;若陰陽性對照反應(yīng)管結(jié)果與上述情況不符,則本次檢測結(jié)果無效,應(yīng)重新檢測。

      上面對本專利的較佳實施方式作了詳細說明,但是本專利并不限于上述實施方式,在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi),還可以在不脫離本專利宗旨的前提下作出各種變化。

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