本發(fā)明屬于小球藻功能成分CPE篩選、制備提取技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種小球藻功能成分CPE的高通量篩選系統(tǒng)、篩選方法，以及基于高壓破壁法制備小球藻功能成分CPE的方法。

背景技術(shù)：

微藻由于具有生長周期短、生物質(zhì)產(chǎn)率高、二氧化碳固定能力強、單位土地生產(chǎn)效率高且不與糧爭地等優(yōu)勢，正逐漸超越傳統(tǒng)能源作物，成為第三代新一代生物能源。雖然目前微藻能源的產(chǎn)業(yè)化研究已經(jīng)進入中試階段，但仍困難重重，其中最主要的問題是成本高。

小球藻(Chlorella)，俗稱綠藻，是國內(nèi)外大力發(fā)展和培育的微藻能源與微藻固碳這一戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)的主要藻種之一。小球藻本身是一種營養(yǎng)豐富又安全的食物，在免疫調(diào)節(jié)等許多方面具有功效。因此，若從提取油脂后的藻渣中能提取到具有免疫調(diào)節(jié)等多種功效的高附加值產(chǎn)品，則會大幅降低以小球藻為藻種的微藻能源的生產(chǎn)成本，進一步推動微藻能源產(chǎn)業(yè)化的進程。

小球藻中含有多種活性物質(zhì)，如多糖、糖蛋白、氨基酸和多肽等，具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、促進有益菌生長、增強免疫、解毒、降血壓等。國內(nèi)外關(guān)于小球藻熱水提取物的應用研究較多，研究主要集中在免疫活性的研究及通過免疫活性介導的抗腫瘤活性。蛋白核小球藻熱水提取物(Hot water extract of Chlorella pyrenoidosa，CPE)主要是水溶性物質(zhì)的混合物，包括核酸、多糖、多肽、蛋白、水溶性維生素等。由于CPE在小球藻中含量豐富，對于開發(fā)免疫類保健品更有價值。

Hidaka發(fā)現(xiàn)CPE可以提高營養(yǎng)不良小鼠的免疫能力，建議把小球藻作為功能食品。Yamagishi等發(fā)現(xiàn)小球藻可以治療糖代謝失調(diào)的疾病，具有治療糖尿病等人類疾病的潛在價值。但在CPE的眾多成分中究竟哪些成分具有促進動物生長和提高免疫力功能的研究方面至今仍然是一個空白，因此進一步研究確定CPE中的有效成分組成、結(jié)構(gòu)和作用機理不僅具有基礎(chǔ)研究意義，而且具有廣泛的應用價值。

目前，小球藻與螺旋藻、鹽藻等微藻的開發(fā)利用構(gòu)成了我國食品領(lǐng)域的一個重要分支，具有廣闊的前景。小球藻粉蛋白質(zhì)含量很高，是優(yōu)良的單細胞蛋白源，其中含有的小球藻糖蛋白大量存在于藻粉蛋白生產(chǎn)的廢水之中，若采用適當?shù)氖侄螌⑵浞蛛x提取，將產(chǎn)生顯 著的經(jīng)濟效益和社會效益。

目前CPE提取方法種類繁多，造成了產(chǎn)物活性差異大，難以確定主組分等情況。因此在開發(fā)小球藻高附加值產(chǎn)品前，必須對眾多CPE提取方法進行比較，從中篩選出一種適于工業(yè)化生產(chǎn)的方法。例如，由于堅韌細胞壁的存在，從小球藻中提取有效成分存在著是否破壁的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種小球藻功能成分CPE的高通量篩選系統(tǒng)、篩選方法及其制備方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種小球藻功能成分CPE的高通量篩選系統(tǒng)，包括：

1)抗氧化測試：采用Griess試劑進行測試，通過分光光度法檢測樣品的總抗氧化能力和對自由基的清除作用；

2)細胞免疫調(diào)節(jié)測試：

a.四噻唑藍MTT法檢測組分對小鼠巨噬細胞Ana-1存活率的影響；

b.中性紅NR染色法檢測組分對Ana-1吞噬功能的影響；

c.熒光探針法檢測樣品對Ana-1細胞內(nèi)NO分泌的改變；

3)氧化還原金屬離子螯合測試：

a.采用菲洛嗪作為Fe²⁺螯合試劑，通過分光光度法檢測樣品的Fe²⁺螯合能力；

b.采用鄰苯二酚紫作為Cu²⁺螯合試劑，通過分光光度法檢測樣品的Cu²⁺螯合能力；

4)抑制糖基化終產(chǎn)物AGEs測試：

非酶糖基化反應體系：將10mg/mL的牛血清白蛋白BSA和0.5mol/L的葡萄糖溶解于0.02mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖液PBS中，得非酶糖基化反應體系；

通過熒光光譜法，分析樣品在美拉德反應的不同階段對AGEs和pentosidine的影響。

本發(fā)明的小球藻功能成分CPE的高通量篩選系統(tǒng)，通過對現(xiàn)有的篩選平臺的改進以及結(jié)合，提出了一種抗氧化、免疫調(diào)節(jié)以及糖尿病等生理功能的高通量篩選方法，活性譜范圍廣，功能活性高，便于CPE的分離提取以及小球藻功能產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種小球藻功能成分CPE的高通量篩選方法，包括：

1)抗氧化測試：取濃度為0、100、200、500、1000μg/mL樣品，加入Griess試劑，37℃反應1min后終止反應，以630nm為參考波長，測定反應物在550nm處的OD值， 根據(jù)如下公式計算樣品的自由基清除能力，以樣品對˙OH的百分清除率表示；

2)細胞免疫調(diào)節(jié)測試：

a.四噻唑藍MTT法檢測組分對小鼠巨噬細胞Ana-1存活率的影響；

具體操作如下：取對數(shù)生長期的細胞，胰蛋白酶消化后，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制成細胞懸液，以2×10⁴個/孔的密度均勻加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，置37℃、飽和濕度、含5％CO₂的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。待細胞貼壁并生長至適合密度(約24h)后，每孔加入不同濃度的CPE等藥物。繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后，每孔加入20μL0.5mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4h。孵育完成后，每孔加入100μL三聯(lián)液(10％SDS，5％異丁醇，12mmol/L HCl)，37℃孵育過夜，以溶解細胞與MTT反應所形成的紫色formazan結(jié)晶。接著震蕩混勻5min，以630nm波長為參考，檢測各孔在492nm波長處的OD值，并根據(jù)公式計算細胞存活率。

b.中性紅NR染色法檢測組分對Ana-1吞噬功能的影響；

具體操作如下：Ana-1細胞經(jīng)CPE等樣品處理一定時間后，每孔加新鮮配制的0.1％NR懸濁液20μL，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)3h。之后小心吸棄含有NR的培養(yǎng)液，用生理PBS輕柔洗去未被吞噬的NR。每孔加150μL細胞裂解液(無水乙醇:乙酸＝1:1(v/v))，靜置2h，使細胞溶解，震蕩混勻后測定540nm處OD值。細胞對NR的吞噬率計算方式同上述公式c.熒光探針法檢測樣品對Ana-1細胞內(nèi)NO分泌的改變；

具體操作如下：用DAF-FM DA稀釋液將熒光探針DAF-FM DA稀釋至終濃度5μmol/L。取足量對數(shù)生長期的細胞，消化并吹散，離心收集后用pH 7.4的生理PBS洗滌一次。以稀釋好的DAF-FM DA工作液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至1×10⁶個/mL，37℃孵育20min。期間每隔3-5min將混合物顛倒混勻，使探針和細胞充分接觸。PBS洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DAF-FM DA。將裝載好的細胞均勻鋪入96孔黑色細胞培養(yǎng)板中，并加入不同濃度的CPE樣品。37℃溫浴一定時間后，檢測各孔在495/515nm激發(fā)/發(fā)射波長下的熒光值，并計算各樣品作用下Ana-1細胞NO水平的改變。

3)氧化還原金屬離子螯合測試：

a.Fe²⁺螯合測試

在pH 4.9的HAc-NaAc緩沖液中加入5mmol/L的相應金屬離子溶液，使其終濃度為1.25mmol/L；

以濃度為2.5，5.0，和7.5mmol/L的EDTA溶液作為陽性對照，其余為不同濃度的CPE樣品；

各反應管內(nèi)用蒸餾水補足，使每個體系體積達到240μL，室溫反應30min；

反應結(jié)束后，加入50mmol/L的菲洛嗪溶液顯色30min，檢測其在535nm或612nm處的OD值，根據(jù)下述公式計算樣品對Fe²⁺的螯合率；

b.Cu²⁺螯合測試

在pH 6.0的HAc-NaAc緩沖液中加入5mmol/L的相應金屬離子溶液，使其終濃度為1.25mmol/L；

以濃度為2.5，5.0，和7.5mmol/L的EDTA溶液作為陽性對照，其余為不同濃度的CPE樣品；

各反應管內(nèi)用蒸餾水補足，使每個體系體積達到240μL，室溫反應30min；

反應結(jié)束后，加入20mmol/L的鄰苯二酚紫溶液顯色30min，檢測其在535nm或612nm處的OD值，根據(jù)下述公式計算樣品對Cu²⁺的螯合率；

4)抑制糖基化終產(chǎn)物AGEs測試：

將10mg/mL的牛血清白蛋白BSA和0.5mol/L的葡萄糖溶解于0.02mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖液PBS中，非酶糖基化反應體系；

將樣品加入到上述反應體系中孵育，使其終濃度分別為10，100，和1000μg/mL，同時以單獨孵育在PBS中的10mg/mL BSA為空白對照；

所有樣品經(jīng)直徑0.22μm的微孔濾膜抽濾滅菌，在37℃避光孵育1、3、7、14、28、42d后，將孵育產(chǎn)物稀釋至1mg/mL，分別檢測孵育產(chǎn)物在370/440nm和335/385nm處的熒光值；

以1mg/mL BSA的熒光值為一個熒光單位，根據(jù)下述公式計算CPE作用下孵育產(chǎn)物的熒光強度FI；

本發(fā)明的小球藻功能成分CPE的高通量篩選方法，通過對現(xiàn)有的篩選平臺的改進以及結(jié)合，提出了一種抗氧化、免疫調(diào)節(jié)以及糖尿病等生理功能的高通量篩選方法，活性譜范圍廣，功能活性高，便于CPE的分離提取以及小球藻功能產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種小球藻功能成分CPE的制備方法，包括：

1)將蛋白核小球藻藻粉加入蒸餾水中，于壓強0.05-0.25MPa，溫度110-130℃下，加熱30-60min，進行萃?。?/p>

2)取出樣品，室溫下冷卻后，10000rpm離心30min，上清液經(jīng)減壓抽濾后，4℃保存?zhèn)溆茫?

3)將步驟2)離心后的藻泥，加入與1)等體積蒸餾水重懸，于壓強0.1MPa，溫度110-130℃下，加熱30-60min，再次萃??；

4)取出樣品，室溫下冷卻后，10000rpm離心30min，取上清液，減壓抽濾，合并兩次濾液，冷凍干燥，制得小球藻CPE提取物粉末。

優(yōu)選的，所述步驟1)中的壓強為0.05-0.25MPa。

優(yōu)選的，所述步驟1)中的溫度為110-130℃。

優(yōu)選的，所述步驟1)中的加熱時間為30-60min。

所述步驟1)中的蛋白核小球藻藻粉均勻懸浮于蒸餾水中，蛋白核小球藻藻粉與蒸餾水的配比為1g:10ml。

優(yōu)選的，所述步驟3)中的壓強為0.05-0.25MPa。

優(yōu)選的，所述步驟3)中的溫度為110-130℃。

優(yōu)選的，所述步驟3)中的加熱時間為30-60min。

所述的萃取是用高壓熱水法進行萃取。

本發(fā)明的基于高壓破壁法制備小球藻CPE的方法，該方法僅需水和常見設(shè)備高壓釜，破壁和提取同步進行，破壁充分，操作步驟少，所需時間顯著縮短，具有成本低、無污染又快速簡便等多方面的優(yōu)點。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果如下：

本發(fā)明通過引入高壓破壁技術(shù)，實現(xiàn)了小球藻CPE的高效制備。經(jīng)本發(fā)明方法提取的小球藻CPE，得率高達251.67mg/g藻粉，且提取物中的核酸和蛋白質(zhì)含量豐富，CPE活性高，非常適宜于工業(yè)化生產(chǎn)，為小球藻高附加值生物活性物質(zhì)的研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)，以 降低微藻能源的開發(fā)成本，提高微藻能源的綜合利用度。

附圖說明

圖1為兩種CPE對˙OH的清除率；

圖2為兩種CPE對Ana-1存活率的影響；

圖3為CPE1對Ana-1存活率以及Ana-1對NR的細胞吞噬率的影響；

圖4為CPE1對Fe²⁺的螯合作用；

圖5為CPE1對Cu²⁺的螯合作用；

圖6為CPE1對總AGEs和penosidine形成的影響；

圖7不同提取方法所制備的CPE得率；

圖8為四種CPE粗品對˙OH的清除率；

圖9為四種CPE對巨噬細胞Ana-1存活率的影響；

圖10為四種CPE粗提物對Fe²⁺和Cu²⁺的螯合率。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實施例1

小球藻功能成分CPE的高通量活性篩選系統(tǒng)

1)抗氧化測試：采用Griess試劑進行測試，通過分光光度法檢測樣品的總抗氧化能力和對自由基的清除作用；

2)細胞免疫調(diào)節(jié)測試：

a.四噻唑藍MTT法檢測組分對小鼠巨噬細胞Ana-1存活率的影響；

b.中性紅NR染色法檢測組分對Ana-1吞噬功能的影響；

c.熒光探針法檢測樣品對Ana-1細胞內(nèi)NO分泌的改變；

3)氧化還原金屬離子螯合測試：

a.采用菲洛嗪作為Fe²⁺螯合試劑，通過分光光度法檢測樣品的Fe²⁺螯合能力；

b.采用鄰苯二酚紫作為Cu²⁺螯合試劑，通過分光光度法檢測樣品的Cu²⁺螯合能力；

4)抑制糖基化終產(chǎn)物AGEs測試：

非酶糖基化反應體系：將10mg/mL的牛血清白蛋白BSA和0.5mol/L的葡萄糖溶解于0.02mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖液PBS中，得非酶糖基化反應體系；

通過熒光光譜法，分析樣品在美拉德反應的不同階段對AGEs和pentosidine的影響。

實施例2

本實施例中CPE1和CPE2選取的是通過超聲酶解法制得，具體方法為：10g蛋白核小球藻粉均勻懸浮于100mL蒸餾水中。超聲破壁30min后，于95℃水浴中提取30min。待提取液冷卻后，加入纖維素酶(80mg/g藻粉)、果膠酶(10mg/g藻粉)。50℃水浴2h，對多糖進行降解。沸水浴30min使酶滅活，10000rpm離心30min。收集上清液，按4倍體積濃縮，并冷凍干燥，得到CPE超聲酶解產(chǎn)物，其中CPE1酶解了4h，CPE2則酶解了16h。

小球藻功能成分CPE的高通量活性篩選方法

1)抗氧化能力測試，即清除羥自由基(˙OH)能力測試

測試方法：取0、100、200、500、1000μg/mL濃度樣品，加入Griess試劑，37℃準確反應1min后終止反應，以630nm為參考波長，測定反應物在550nm處的OD值。

樣品的自由基清除能力，根據(jù)公式進行計算，以樣品對˙OH的百分清除率表示，公式如下：

結(jié)果分析：如圖1所示(兩種CPE對˙OH的清除率，n＝6；與對照組相比，*p<0.05，**p<0.01)，兩種CPE對體系中的˙OH均有一定的清除能力，且這種清除能力與濃度正相關(guān)，隨著參試濃度的提高，清除率增加。尤其是在濃度達到1000μg/mL時，CPE1對˙OH的清除率達到29.46％(p<0.01)，而CPE2對˙OH具有更高的清除能力，其清除率達到34.05％(p<0.01)。

2)細胞免疫調(diào)節(jié)功能測試

a.Ana-1的細胞存活率測試

具體操作如下：取對數(shù)生長期的細胞，胰蛋白酶消化后，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制成細胞懸液，以2×10⁴個/孔的密度均勻加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，置37℃、飽和濕度、含5％CO₂的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。待細胞貼壁并生長至適合密度(約24h)后，每孔加入不同濃度的CPE等藥物。繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后，每孔加入20μL0.5mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4h。孵育完成后，每孔加入100μL三聯(lián)液(10％SDS，5％異丁醇，12mmol/L HCl)，37℃孵育過夜，以溶解細胞與MTT反應所形成的紫色formazan結(jié)晶。接著震蕩混勻5min，以630nm波長為參考，檢測各孔在492nm波長處的OD值，并根據(jù)公式計算細胞存活率。

結(jié)果分析：如圖2所示(兩種CPE對Ana-1存活率的影響n＝5；與對照組相比，*p<0.05，**p<0.01)，在0-500μg/mL的濃度范圍內(nèi)，兩種CPE對Ana-1無明顯細胞毒性作用，反而促進細胞增殖，但細胞的增殖率基本低于10％。

如圖3所示(CPE1對Ana-1存活率的影響，n＝6；與對照組相比，*p<0.05，**p<0.01)將CPE1的最高參試濃度提高到1000μg/mL后發(fā)現(xiàn)，CPE1雖在低濃度時對Ana-1細胞的生長無顯著影響，但當其參試濃度高于600μg/mL時，可使巨噬細胞的存活率顯著提高到對照組的120％左右。上述研究結(jié)果表明，CPE無明顯細胞毒作用，反而有利于巨噬細胞的增殖。

b.Ana-1細胞吞噬功能測試

具體操作如下：Ana-1細胞經(jīng)CPE等樣品處理一定時間后，每孔加新鮮配制的0.1％NR懸濁液20μL，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)3h。之后小心吸棄含有NR的培養(yǎng)液，用生理PBS輕柔洗去未被吞噬的NR。每孔加150μL細胞裂解液(無水乙醇:乙酸＝1:1(v/v))，靜置2h，使細胞溶解，震蕩混勻后測定540nm處OD值。細胞對NR的吞噬率計算方式同上述公式。

結(jié)果分析：如圖3所示(Ana-1對NR的細胞吞噬率的影響，n＝6；與對照組相比，*p<0.05，**p<0.01)在CPE1作用下，細胞對NR的吞噬活性顯著增強。在CPE1濃度為200μg/mL時，Ana-1對NR的細胞吞噬率增加到對照組的156.00％(p<0.05)；當CPE1濃度提高到600μg/mL時，細胞吞噬率可達到對照組的211.72％(圖3，p<0.01)。與相同條件下的細胞存活率的遞增相比，Ana-1的細胞吞噬率增加幅度明顯高于前者。

3)氧化還原金屬離子螯合測試

a.CPE的Fe²⁺螯合能力測試

在200μL pH 4.9的HAc-NaAc緩沖液中加入10μL 5mmol/L的FeSO₄(終濃度為1.25mmol/L)。以20μL濃度為2.5，5.0，和7.5mmol/L的EDTA溶液作為陽性對照，其余為不同濃度的CPE樣品20μL。各反應管內(nèi)用蒸餾水補足，使每個體系體積達到240μL。室溫反應30min。反應結(jié)束后，加入20μL 50mmol/L的FZ(菲洛嗪)溶液，顯色30min，檢測其在535nm或612nm處的OD值，根據(jù)下述公式計算樣品對Fe²⁺的螯合率：

結(jié)果分析：如圖4所示(CPE1對Fe²⁺的螯合作用)，金屬離子螯合陽性對照物EDTA，能夠呈濃度依賴性地螯合體系內(nèi)的Fe²⁺；當其濃度達到7.5mmol/L時，EDTA對Fe²⁺的螯合率達到99.72％。但CPE1對Fe²⁺基本沒有螯合作用。

b.CPE的Cu²⁺螯合能力測試

在200μL pH 6.0的HAc-NaAc緩沖液中加入10μL 5mmol/L的CuSO₄(終濃度為1.25mmol/L)。以20μL濃度為2.5，5.0，和7.5mmol/L的EDTA溶液作為陽性對照，其余為不同濃度的CPE樣品20μL。各反應管內(nèi)用蒸餾水補足，使每個體系體積達到240μL。室溫反應30min。反應結(jié)束后，加入5μL 20mmol/L的PV(鄰苯二酚紫)溶液，顯色30min，檢測其在535nm或612nm處的OD值，根據(jù)下述公式計算樣品對Cu²⁺的螯合率：

結(jié)果分析：如圖5所示(CPE1對Cu²⁺的螯合作用)，陽性對照物EDTA在5mmol/L時，對Cu²⁺的螯合能力達到83.80％，且CPE1對Cu²⁺也有螯合作用，且隨著CPE1濃度的增加，螯合作用增強。

4)抑制糖基化終產(chǎn)物(AGEs)能力測試

將10mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)和0.5mol/L的葡萄糖溶解于0.02mol/L的磷酸緩沖液(PBS，pH 7.4)中，成為蛋白質(zhì)非酶糖基化的體外反應體系。將CPE加入到非酶糖基化孵育體系中，使其終濃度為10，100，和1000μg/mL，同時以單獨孵育在PBS中的10mg/mL BSA為空白對照。所有樣品經(jīng)直徑0.22μm的微孔濾膜抽濾滅菌，在37℃避光孵育1、3、7、14、28、42d后，將孵育產(chǎn)物稀釋至1mg/mL，分別檢測孵育產(chǎn)物在370/440nm和335/385nm 處的熒光值。以1mg/mL BSA的熒光值為一個熒光單位，根據(jù)下述公式計算CPE作用下孵育產(chǎn)物的熒光強度(FI)。

結(jié)果分析：335/385nm和370/440nm分別是AGEs組分之一的pentosidine和總AGEs的特征性的熒光激發(fā)和發(fā)射波長。通過定期檢測335/385nm和370/440nm處FI的改變，研究CPE在美拉德反應的不同階段對AGEs和pentosidine水平的影響。美拉德反應共持續(xù)進行了4周，CPE對AGEs形成的動態(tài)影響如圖6所示(CPE1對總AGEs和penosidine形成的影響，n＝4；A為CPE1對總AGEs形成的影響，B為CPE1對AGEs前體物penosidine形成的影響；與AGEs組相比，#p<0.05，##p<0.01)，兩種CPE在美拉德反應的前期，尤其是第1天和第3天，對總AGEs和penosidine的形成均具有促進作用，且參試物的濃度越高，其促進作用越大(p<0.05)；但隨著孵育時間的不斷延長，尤其是從第3周開始，CPE對AGEs形成的促進作用逐漸消失，并抑制總AGEs的形成，而penosidine水平的增加也得到緩解。

上述結(jié)果提示，CPE在防治糖尿病慢性并發(fā)癥方面具有一定的潛力。

以下實施例說明了小球藻功能成分CPE的4種不同制備方法，并對提取產(chǎn)物采用上述篩選系統(tǒng)進行測試，具體說明如下：

實施例3

基于高壓破壁法制備小球藻功能成分CPE的方法

取10g蛋白核小球藻藻粉，均勻懸浮于100mL蒸餾水。置于高壓鍋中，在0.15MPa，120℃下加熱40min。取出樣品，于室溫下冷卻。10000rpm離心30min，上清液經(jīng)減壓抽濾后，于4℃保存?zhèn)溆?。離心后的藻泥，加入100mL蒸餾水重懸，置于高壓鍋中，在0.15MPa，120℃下加熱40min，再次萃取。取出樣品，于室溫下冷卻。10000rpm離心30min，取上清液，減壓抽濾。合并兩次濾液，冷凍干燥，得CPE提取物粉末，標記為CPE-a。

實施例4

基于高壓破壁法制備小球藻CPE的方法

取10g蛋白核小球藻藻粉，均勻懸浮于100mL蒸餾水。置于高壓鍋中，在0.05MPa，110℃下加熱60min。取出樣品，于室溫下冷卻。10000rpm離心30min，上清液經(jīng)減壓 抽濾后，于4℃保存?zhèn)溆?。離心后的藻泥，加入100mL蒸餾水重懸，置于高壓鍋中，在0.05MPa，110℃下加熱60min，再次萃取。取出樣品，于室溫下冷卻。10000rpm離心30min，取上清液，減壓抽濾。合并兩次濾液，冷凍干燥，得CPE提取物粉末。

實施例5

基于高壓破壁法制備小球藻CPE的方法

取10g蛋白核小球藻藻粉，均勻懸浮于100mL蒸餾水。置于高壓鍋中，在0.25MPa，130℃下加熱30min。取出樣品，于室溫下冷卻。10000rpm離心30min，上清液經(jīng)減壓抽濾后，于4℃保存?zhèn)溆谩ｋx心后的藻泥，加入100mL蒸餾水重懸，置于高壓鍋中，在0.25MPa，130℃下加熱30min，再次萃取。取出樣品，于室溫下冷卻。10000rpm離心30min，取上清液，減壓抽濾。合并兩次濾液，冷凍干燥，得CPE提取物粉末。

對比實施例1

超聲破壁法提取

10g蛋白核小球藻粉均勻懸浮于100mL蒸餾水中。超聲破壁30min后，于95℃水浴中提取30min。待提取液冷卻后，將懸液于10000rpm離心30min，上清液按4倍體積濃縮后4℃保存?zhèn)溆?。藻泥重懸于等量蒸餾水，并再次超聲提取和離心。合并兩次上清液，按4倍體積濃縮，并冷凍干燥，得到CPE粗提物，標記為CPE-b。

對比實施例2

超聲酶解法提取

10g蛋白核小球藻粉均勻懸浮于100mL蒸餾水中。超聲破壁30min后，于95℃水浴中提取30min。待提取液冷卻后，加入纖維素酶(80mg/g藻粉)、果膠酶(10mg/g藻粉)。50℃水浴2h，對多糖進行降解。沸水浴30min使酶滅活，10000rpm離心30min。收集上清液，按4倍體積濃縮，并冷凍干燥，得到CPE超聲酶解產(chǎn)物，標記為CPE-c。

對比實施例3

酶解法提取

10g蛋白核小球藻藻粉均勻懸浮于100mL蒸餾水中。藻粉懸液置于70℃水浴中浸泡10h。浸泡后的小球藻粉懸浮液中，按80mg/g藻粉及10mg/g藻粉的比例，加入果膠酶及 纖維素酶，于50℃水浴酶解12h，形成破壁藻泥。果膠酶及纖維素酶酶解結(jié)束后，以100mg/L和30mg/L的濃度加入蛋白酶K和核糖核酸酶A(RNase A)，50℃水浴酶解2h。RNase等酶解結(jié)束后，小球藻酶解產(chǎn)物于100℃水浴滅酶活30min。10000rpm離心30min，取上清液。上清液按4倍體積濃縮后冷凍干燥，得CPE提取物粉末，標記為CPE-d。

提取物評價測試：

將上述各實施例的提取產(chǎn)物：高壓破壁法(產(chǎn)物為CPE-a)、超聲破壁法(產(chǎn)物為CPE-b)、超聲破壁-酶解法(產(chǎn)物為CPE-c)，以及酶解法(產(chǎn)物為CPE-d)，分別進行得率、熱水提取物指標值(OD₂₆₀)、蛋白質(zhì)和糖含量，以及生物活性等評價測試。

1、得率及成分分析

從圖1可以看出(CPE-e為經(jīng)典溫熱法得到的CPE提取物)，本發(fā)明中，CPE-b的得率明顯低于其他三種產(chǎn)物，表明超聲破壁和常規(guī)熱水提取的效率非常低。當超聲破壁得到酶解破壁輔助后，產(chǎn)物得率顯著提高，從CPE-b的148.36mg/g藻粉迅速上升至CPE-c的279.25mg/g藻粉。CPE-a，CPE-c，和CPE-d三種產(chǎn)物的得率均較高，分別為251.67，279.25，和258.85mg/g藻粉(圖7)。

CPE-a的得率高，為251.67mg/g藻粉的產(chǎn)物。上述結(jié)果表明，在高壓破壁提取法中，適當延長提取時間、增加提取次數(shù)有助于提取效率的提升。

由于酶本身價格昂貴，反應后難以徹底去除，且酶解反應操作步驟復雜，耗時過長，以酶解方法制備CPE并不可取。

而高壓破壁法僅需水和常見設(shè)備高壓釜，破壁和提取同步進行，操作步驟少，所需時間也較酶解法顯著縮短，具有低成本、無污染又快速簡便等多方面的優(yōu)點。因此，從產(chǎn)物得率考慮，高壓破壁法是制備CPE高效方法。

2、蛋白質(zhì)和含糖量分析

通過對四種產(chǎn)物進行紫外吸收分析，結(jié)果顯示四種產(chǎn)物均具有豐富的蛋白質(zhì)和核酸，其中CPE-a是四種提取物中核酸和蛋白質(zhì)含量最豐富的物質(zhì)。

后期通過苯酚-硫酸法檢測總糖含量、DNS法檢測還原糖含量以及考馬斯亮藍法檢測蛋白質(zhì)含量，結(jié)果如表1所示。

表1 CPE產(chǎn)物的蛋白質(zhì)和糖含量分析(n＝3)

注：OD1200、OD5000為市售“CGF”商品

與OD1200相比，**p<0.01；與OD5000相比，##p<0.01；

與CPE-a相比，+p<0.05，++p<0.01。n未檢出

與紫外吸收比較結(jié)果相似，四種產(chǎn)物中CPE-a的蛋白質(zhì)含量最高。采用考馬斯亮藍法，CPE-a的蛋白質(zhì)含量均顯著高于OD1200(p<0.01)，而CPE-c和CPE-d的蛋白質(zhì)含量顯著低于OD5000。

糖含量檢測結(jié)果顯示，四種CPE的總糖含量低于兩種“CGF”對照(p<0.01)，但其中CPE-c和CPE-d的糖含量較CPE-a豐富(p<0.05)。此外，除了CPE-c，其余產(chǎn)物中檢測不到還原糖的存在。

3、活性分析

1)四種CPE的˙OH清除能力

測試方法：取濃度為0、100、200、500、1000μg/mL的上述4種樣品，加入Griess試劑，37℃準確反應1min后終止反應，以630nm為參考波長，測定反應物在550nm處的OD值。樣品的自由基清除能力，根據(jù)公式進行計算，以樣品對˙OH的百分清除率表示。

從圖2分析四種CPE對˙OH的清除率比較(n＝6；與空白對照相比，*p<0.05，**p<0.01；與CPE-a相比，+p<0.05，++p<0.01)，上述四種CPE均具有清除˙OH的能力，且隨著參試濃度的提高，清除率逐漸上升。在同一參試濃度對四種CPE的清除率進行比較，發(fā)現(xiàn)CPE-a對˙OH的清除效果最佳，在40-400μg/mL范圍內(nèi)，其余三種CPE的˙OH清除率均顯著低于CPE-a(p<0.05)；當濃度提高到1000μg/mL時，CPE-a對˙OH的清 除率可達到74.31％。

2)四種CPE對巨噬細胞存活率的影響

從圖3分析四種CPE對巨噬細胞Ana-1存活率的影響(n＝6；與對照組相比，*p<0.05，**p<0.01；與CPE-a相比，+p<0.05，++p<0.01)，四種CPE能夠顯著促進巨噬細胞Ana-1增殖。在25-200μg/mL的濃度范圍內(nèi)，四種CPE均能以濃度依賴的方式促進Ana-1細胞增殖，其中以CPE-a的作用最佳，在100μg/mL時，CPE-a對Ana-1的促增殖率顯著高于其他三種CPE(p<0.05)；200μg/mL時，CPE-a使Ana-1的存活率提高到162.98％，其他三種CPE的促增殖作用極顯著低于CPE-a(p<0.01)。

3)四種CPE的金屬離子螯合能力

測試方法：在200μL pH 4.9(Fe²⁺螯合測試)或pH 6.0(Cu²⁺螯合測試)的HAc-NaAc緩沖液中各加入10μL 5mmol/L的相應金屬離子溶液(終濃度為1.25mmol/L)。以20μL濃度為2.5，5.0，和7.5mmol/L的EDTA溶液作為陽性對照，其余為不同濃度的CPE樣品20μL。各反應管內(nèi)用蒸餾水補足，使每個體系體積達到240μL。室溫反應30min。反應結(jié)束后，分別加入20μL 50mmol/L的FZ(菲洛嗪)溶液(Fe²⁺螯合測試)或5μL 20mM的PV(鄰苯二酚紫)溶液(Cu²⁺螯合測試)顯色30min，檢測其在535nm或612nm處的OD值，根據(jù)上述公式計算樣品對Cu²⁺和Fe²⁺的螯合率。

從圖4分析四種CPE粗提物對Fe²⁺和Cu²⁺的螯合率(n＝3；與對照組相比，*p<0.05，**p<0.01；與CPE-a相比，+p<0.05)，在濃度低于1mg/mL時，四種CPE對Fe²⁺基本上沒有螯合作用，但當濃度達到10mg/mL時，四種CPE均表現(xiàn)出一定的Fe²⁺螯合能力(p<0.01)。

四種CPE對Cu²⁺均有一定的螯合作用，且隨著CPE參試濃度的提高，螯合率也相應增加。在1mg/mL時，各組對Cu²⁺的螯合率均低于10％(p<0.05)，且各組之間無顯著差異；當濃度達到10mg/mL時，四種CPE對Cu²⁺的螯合能力相應提高。

4)四種CPE對AGEs形成的影響

測試方法：將10mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)和0.5mol/L的葡萄糖溶解于0.02mol/L的磷酸緩沖液(PBS，pH 7.4)中，成為蛋白質(zhì)非酶糖基化的體外反應體系。將CPE加入到非酶糖基化孵育體系中，使其終濃度為10，100，和1000μg/mL，同時以單獨孵育在PBS 中的10mg/mL BSA為空白對照。所有樣品經(jīng)直徑0.22μm的微孔濾膜抽濾滅菌，在37℃避光孵育1、3、7、14、28、42d后，將孵育產(chǎn)物稀釋至1mg/mL，分別檢測孵育產(chǎn)物在370/440nm和335/385nm處的熒光值。以1mg/mL BSA的熒光值為一個熒光單位，根據(jù)上述公式計算CPE作用下孵育產(chǎn)物的熒光強度(FI)。

采用上述小球藻功能成分CPE的篩選系統(tǒng)及篩選方法，對4種不同制備方法得到的小球藻功能成分CPE進行篩選評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過高壓破壁法制備的小球藻功能成分CPE綜合評價最好，且該制備方法簡單，成本低，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。