本實用新型涉及動物、植物及微生物誘變篩選、長周期連續(xù)培養(yǎng)與實時觀察技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

動物、植物及微生物細(xì)胞具有獨特和高效的生物轉(zhuǎn)化能力，能產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)物中的一些生物活性物質(zhì)(如多肽、抗生素、氨基酸等)在醫(yī)藥和化工行業(yè)中有著不可取代的地位。通常從自然界得到的野生菌株代謝產(chǎn)物產(chǎn)量往往較低，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，因此如何對菌種進(jìn)行改良，以獲得高效高產(chǎn)的優(yōu)良工業(yè)菌株的難題凸顯。而誘變篩選的目的就是要人為地使某些代謝產(chǎn)物過量積累，把生物合成的代謝途徑朝著人們所希望的方向加以引導(dǎo)，獲得所需要的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和低耗的菌種，以降低生產(chǎn)成本。微生物誘變處理一般采取物理誘變方法如紫外線和化學(xué)誘變方法如堿基類似物等傳統(tǒng)方法。但是，這些方法具有耗時、費(fèi)力、工作量大等缺點。

本實用新型的一重要應(yīng)用是用于生物細(xì)胞的多條件多批次多菌株誘變篩選與長周期連續(xù)培養(yǎng)及實時觀察。該發(fā)明并具有實時掌握細(xì)胞生長與誘變情況，是一種有效的多條件、多批次與多菌株同時誘變篩選的方法與設(shè)備。采用本實用新型進(jìn)行生物細(xì)胞的人工誘變篩選能有效解決傳統(tǒng)誘變篩選耗時、耗力與成本較高等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本實用新型解決的技術(shù)問題在于，提供一種高通量誘變篩選、長周期連續(xù)培養(yǎng)與實時觀察裝置，用于對生物細(xì)胞進(jìn)行多菌株、多批次與多條件誘變篩選，并對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)與觀察。本實用新型在進(jìn)行菌種誘變篩選時可實現(xiàn)多菌株、多批次及多條件誘變篩選，同時具有長周期連續(xù)培養(yǎng)的能力。在進(jìn)行誘變篩選和培養(yǎng)時可實現(xiàn)實時原位觀察。

為了實現(xiàn)上述目的本實用新型提供了一種高通量誘變篩選、長周期連續(xù)培養(yǎng)與實時觀察裝置，包括：

一反應(yīng)器本體，為一箱體，所述箱體的四周及底部均設(shè)有黑色不透光材質(zhì)；

一誘變光源裝置，設(shè)置于所述反應(yīng)器本體內(nèi)的底部；

一用以培養(yǎng)生物細(xì)胞的菌種培養(yǎng)裝置，設(shè)置于所述反應(yīng)器本體內(nèi)且位于所述誘變光源裝置的中上部；

一補(bǔ)料裝置，通過一補(bǔ)給管與所述菌種培養(yǎng)裝置連接；

一用以實時記錄生物細(xì)胞誘變及生長情況的攝像裝置，固定于反應(yīng)器本體的頂部且位于菌種培養(yǎng)裝置上方；

一用以接收并處理攝像裝置輸出的圖像數(shù)據(jù)的圖像處理系統(tǒng)，與所述攝像裝置電性連接。

所述的高通量誘變篩選、長周期連續(xù)培養(yǎng)與實時觀測裝置，其特征在于，所述誘變光源裝置進(jìn)一步包括紫外燈和燈架,所述燈架固定于反應(yīng)器底部，紫外燈固定于燈架上。

所述的高通量誘變篩選、長周期連續(xù)培養(yǎng)與實時觀測裝置，其特征在于，所述菌種培養(yǎng)裝置進(jìn)一步包括培養(yǎng)多孔板、多個玻璃蓋板、支架和系列遮光板，所述支架設(shè)置于反應(yīng)器本體內(nèi)且固定于所述反應(yīng)器本體的內(nèi)壁上，所述培養(yǎng)多孔板放置于所述支架上，所述培養(yǎng)多孔板包括多個培養(yǎng)孔及與其相連的加液孔，所述玻璃蓋板對應(yīng)蓋設(shè)于培養(yǎng)多孔板的每個培養(yǎng)孔上，所述加液孔露出所述玻璃蓋板之外，根據(jù)需要選擇某一系列遮光板蓋設(shè)在蓋有玻璃蓋板的培養(yǎng)多孔板上。

所述的高通量誘變篩選、長周期連續(xù)培養(yǎng)與實時觀測裝置，其特征在于，所述補(bǔ)料裝置進(jìn)一步包括塑料膠管、蠕動泵和儲液罐，所述塑料膠管插入所述儲液罐內(nèi)，所述蠕動泵設(shè)置于塑料膠管上，所述補(bǔ)給管一端與所述塑料膠管連接，另一端連接到所述加液孔上。

所述的高通量誘變篩選、長周期連續(xù)培養(yǎng)與實時觀測裝置，其特征在于，所述培養(yǎng)多孔板為設(shè)有16個培養(yǎng)孔的培養(yǎng)板，每個培養(yǎng)孔底部到培養(yǎng)板上表面的距離50mm，每個培養(yǎng)孔直徑為35mm，與所述培養(yǎng)孔連通的加液孔的直徑為3mm，加液孔的底部到培養(yǎng)板上表面20mm。

所述的高通量誘變篩選、長周期連續(xù)培養(yǎng)與實時觀測裝置，其特征在于，所述加液孔中裝有小型細(xì)菌過濾器。

所述的高通量誘變篩選、長周期連續(xù)培養(yǎng)與實時觀測裝置，其特征在于，所述細(xì)菌過濾器為有機(jī)高分子過濾膜。

所述的高通量誘變篩選、長周期連續(xù)培養(yǎng)與實時觀測裝置，其特征在于，所述系列遮光板進(jìn)一步包括：系列孔板和遮光板；所述系列孔板是指孔板上有序排列著數(shù)目不等的小孔，遮光板為具有完全遮光效果的實體板。

所述的高通量誘變篩選、長周期連續(xù)培養(yǎng)與實時觀測裝置，其特征在于，所述系列孔板包括指數(shù)孔板和倍數(shù)孔板；指數(shù)孔板是指孔板上的小孔數(shù)呈指數(shù)增長；倍數(shù)孔板是指孔板上的小孔數(shù)呈倍數(shù)增長。

所述的高通量誘變篩選、長周期連續(xù)培養(yǎng)與實時觀測裝置，其特征在于，所述培養(yǎng)多孔板、玻璃蓋板均為透明有機(jī)玻璃板，所述玻璃蓋板厚度1mm。

本實用新型的有益效果為：

利用上述裝置，可實現(xiàn)多菌株、多批次與多條件誘變篩選，同時具有長周期連續(xù)培養(yǎng)的能力。

本實用新型還可以在進(jìn)行誘變篩選和培養(yǎng)時可實現(xiàn)實時原位觀察，及時對誘變條件進(jìn)行調(diào)整，通過觀察設(shè)備對細(xì)胞進(jìn)行多方位實時動態(tài)觀察，并通過圖像處理技術(shù)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

附圖說明

圖1高通量篩選、連續(xù)長周期培養(yǎng)與實時觀察裝置示意圖。

圖2誘變光源裝置示意圖。

圖3菌種培養(yǎng)裝置示意圖。

圖4培養(yǎng)多孔板裝置示意圖。

圖5玻璃蓋板示意圖。

圖6系列遮光板結(jié)構(gòu)示意圖。

圖7遮光板的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖8補(bǔ)料裝置示意圖。

圖9菌種培養(yǎng)裝置縱向界面圖。

圖10有機(jī)高分子過濾膜。

圖11熱帶假絲酵母的生長曲線。

圖12熱帶假絲酵母S9的產(chǎn)酶曲線。

附圖標(biāo)記為：

反應(yīng)器本體 1

誘變光源裝置 11

紫外燈 111

菌種培養(yǎng)裝置 12

培養(yǎng)多孔板 121

培養(yǎng)孔 1211

加液孔 1212

細(xì)菌過濾器 12121

玻璃蓋板 122

系列遮光板 123

系列孔板 1231

指數(shù)孔板 12311

倍數(shù)孔板 12312

支架 124

遮光板 125

補(bǔ)料裝置 13

儲液罐 131

塑料膠管 132

蠕動泵 133

補(bǔ)給管 134

攝像裝置 14

攝像機(jī) 141

固定架 142

不透光材質(zhì) 15

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本實用新型的高通量誘變篩選、長周期連續(xù)培養(yǎng)與實時原位觀察裝置的結(jié)構(gòu)特點及應(yīng)用，進(jìn)行詳細(xì)的描述。以下對具體實施例的描述僅為說明本實用新型的實現(xiàn)細(xì)節(jié)，并非用于限定本實用新型的具體保護(hù)范圍。本實用新型的保護(hù)范圍需以后附的權(quán)利要求書所限定的內(nèi)容為準(zhǔn)。

本實用新型為滿足不同生物細(xì)胞多誘變條件的高通量篩選，并通過長周期連續(xù)培養(yǎng)實現(xiàn)實時原位觀察的需求，設(shè)計了如圖1所示的一種高通量誘變篩選、長周期連續(xù)培養(yǎng)與實時觀測裝置，包括：反應(yīng)器本體1、誘變光源裝置11、菌種培養(yǎng)裝置12、補(bǔ)料裝置13、用以記錄生物細(xì)胞誘變及生長情況的攝像裝置14、用以接收并處理攝像裝置14輸出的圖像數(shù)據(jù)的圖像處理系統(tǒng)。

反應(yīng)器本體11，為一箱體，在反應(yīng)器本體1內(nèi)的底部設(shè)置誘變光源裝置11，誘變光源裝置11進(jìn)一步包括紫外燈111和燈架,燈架固定于反應(yīng)器底部，紫外燈111固定于燈架上。為防止紫外燈111發(fā)散的光束對人體的危害，在箱體的四周及底部均設(shè)有不透光材質(zhì)，黑色不透光有機(jī)玻璃15厚度為30mm。。

在箱體內(nèi)的中上部位置設(shè)有用以培養(yǎng)生物細(xì)胞的菌種培養(yǎng)裝置12，菌種培養(yǎng)裝置12進(jìn)一步包括培養(yǎng)多孔板121、多個玻璃蓋板122、支架124和系列遮光板123，支架124固定于反應(yīng)器本體1的內(nèi)壁上，培養(yǎng)多孔板121設(shè)置于支架124上，培養(yǎng)多孔板121包括多個培養(yǎng)孔1211及與其相連的加液孔1212，玻璃蓋板122對應(yīng)蓋設(shè)于培養(yǎng)多孔板121的每個培養(yǎng)孔1211上，加液孔1212露出玻璃蓋板122之外，根據(jù)需要選擇系列遮光板123蓋設(shè)在蓋設(shè)有玻璃蓋板122的培養(yǎng)多孔板121上。培養(yǎng)多孔板121例如為16孔培養(yǎng)板，每個培養(yǎng)孔1211底部到培養(yǎng)板上表面距離50mm，培養(yǎng)孔1211直徑為35mm，與培養(yǎng)孔1211連通的加液孔1212的直徑為為3mm，加液孔1212的底部到培養(yǎng)板上表面20mm。加液孔1212中裝有小型細(xì)菌過濾器12121，細(xì)菌過濾器12121是一種有機(jī)高分子過濾膜(如圖10)。

系列遮光板123進(jìn)一步包括：系列孔板1231和遮光板125；系列孔板1231是指孔板上有序排列著數(shù)目不等的小孔，致使每個培養(yǎng)孔1211處具有不同的遮光效果，遮光板125為具有完全遮光效果的實體板。系列孔板1231進(jìn)一步包括指數(shù)孔板12311和倍數(shù)孔板12312；指數(shù)孔板12311是指孔板上的小孔數(shù)呈指數(shù)增長(如3，32，33，34，……)；倍數(shù)孔板12312是指孔板上的小孔數(shù)呈倍數(shù)增長(如3，6，12，24，……)，詳細(xì)之，指數(shù)孔板12311或倍數(shù)孔板12312是有多個單獨的設(shè)有不同孔數(shù)的板逐次排列形成，本實用新型中的指數(shù)孔板12311或倍數(shù)孔板12312包括不設(shè)孔的板，也就是包括完全遮光效果的實體板。而遮光板125，是有許多完全遮光效果的實體板逐次排列形成。

為了能夠為多種生物細(xì)胞提供長周期連續(xù)培養(yǎng)，還設(shè)置一補(bǔ)料裝置13，該補(bǔ)料裝置13設(shè)置于反應(yīng)器箱體外，通過一補(bǔ)給管134與菌種培養(yǎng)裝置12連接，補(bǔ)料裝置13進(jìn)一步包括塑料膠管132、蠕動泵133和儲液罐131，塑料膠管132插入儲液罐131內(nèi)，蠕動泵133設(shè)置于塑料膠管132上，補(bǔ)給管134一端與塑料膠管132連接，另一端連接到加液孔1212上。圖9所示為本實用新型的連菌種培養(yǎng)裝置12的縱向截面圖。由于培養(yǎng)孔1211與加液孔1212相連，故而可以通過加液孔1212向培養(yǎng)孔1211進(jìn)行連續(xù)加液，從而保證生物細(xì)胞的連續(xù)長周期培養(yǎng)。加液孔1212的底部高度處于培養(yǎng)孔1211的中上部，保證了培養(yǎng)液不會倒流入加液孔1212中。如圖8所示，加液孔1212通過塑料膠管132與蠕動泵133和儲液罐131相連，保證新鮮液體培養(yǎng)基可以連續(xù)添加到培養(yǎng)孔1211中。

為了能夠?qū)崟r原位拍攝細(xì)胞誘變及生長情況，在菌種培養(yǎng)裝置12上部設(shè)置攝像裝置14，攝像裝置14，包括一攝像機(jī)、一固定架142，固定架142固定于反應(yīng)器本體的頂部蓋板上，攝像機(jī)141通過該固定架142設(shè)置在箱體的頂部的蓋板上，固定架142最好為十字架結(jié)構(gòu)，能使攝像機(jī)141沿X軸和Y軸水平移動。攝像裝置與一圖像處理系統(tǒng)電性連接，攝像裝置拍攝的圖像輸出給圖像處理系統(tǒng)，圖像處理系統(tǒng)接收并處理分析攝像裝置輸出的圖像數(shù)據(jù)。

該培養(yǎng)多孔板121進(jìn)一步包括：16孔培養(yǎng)板，每個培養(yǎng)孔底部到培養(yǎng)板上表面距離50mm，培養(yǎng)孔直徑為35mm，并連有一個直徑為3mm的小孔，小孔底部到培養(yǎng)板上表面20mm，小孔中裝有小型細(xì)菌過濾器12121，細(xì)菌過濾器12121是一種有機(jī)高分子過濾膜(如圖10)，每個培養(yǎng)孔可裝有1-5mL培養(yǎng)液，用于生物細(xì)胞的誘變篩選與培養(yǎng)。

本實用新型可以在同一培養(yǎng)多孔板121上培養(yǎng)多種生物細(xì)胞，可進(jìn)行多批次、多條件誘變篩選與長周期連續(xù)培養(yǎng)。各培養(yǎng)孔有獨立的培養(yǎng)空間，可使用相同或者不同的培養(yǎng)基。

為了達(dá)到較佳的誘變篩選的目的，培養(yǎng)板底面的厚度應(yīng)盡量小，優(yōu)選的實施例為1-4mm；為了能清晰的觀察細(xì)胞培養(yǎng)情況，培養(yǎng)多孔板121玻璃蓋板122厚度應(yīng)盡量小，優(yōu)選的實施例為0.5-2.5mm。培養(yǎng)孔深度優(yōu)選的實施例范圍20-80mm。加液孔1212深度優(yōu)選的實施例范圍10-30mm。為了滿足不同誘變條件，系列遮光板123的孔分布優(yōu)選的實施例為指數(shù)孔板12311(3，3²，3³，3⁴，……)和倍數(shù)孔板12312(3，6，12，24，……)。

下面的實施例將對本實用新型做進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本實用新型。

實施例1

本實施例為采用本實用新型進(jìn)行生物細(xì)胞連續(xù)長周期培養(yǎng)，考察細(xì)胞情況。該反應(yīng)器本體1為有機(jī)玻璃制造的箱體，主要結(jié)構(gòu)參數(shù)如下：反應(yīng)器本體1的橫截面長邊為1370mm，短邊為940mm，縱截面高度為600mm；培養(yǎng)裝置上放置12個培養(yǎng)多孔板121，每個培養(yǎng)孔底部到培養(yǎng)板上表面距離50mm，培養(yǎng)孔直徑為35mm，并連有一個直徑為3mm的加液孔，加液孔底部到培養(yǎng)板上表面20mm,在蠕動泵133的驅(qū)使下，通過加液孔將新鮮的培養(yǎng)液加入到培養(yǎng)孔中，保證細(xì)胞的正常生長需要。液體培養(yǎng)基(g/L)配方：葡萄糖30；酵母粉6；NH₄Cl6；MgSO₄·7H₂O 0.4；KH₂PO₄ 1；K₂HPO₄ 1；pH 6.5。以5％的接種量接入裝有3ml液體培養(yǎng)基培養(yǎng)孔中，30℃，培養(yǎng)40h。熱帶假絲酵母的生長曲線分為延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期四個時期。接種后，經(jīng)過一段延滯期后(約4h)，菌體迅速增殖進(jìn)入對數(shù)期，在22h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體OD₅₈₀值較為穩(wěn)定(如圖11)。

實施例2

本實施例為采用本實用新型進(jìn)行高通量誘變篩選試驗，在不同紫外線照射時間和不同透光量的條件下，同時考察五種菌株的誘變情況，最終得到高酶活力的酵母細(xì)胞。系列遮光板安裝在培養(yǎng)多孔板121底部，系列遮光板透光孔數(shù)呈指數(shù)分布(0，3，9，27，……)和倍數(shù)增長(如3，6，12，24，……)；使用25W、254nm的紫外燈管，照射距離為40cm，照射時間分別為0、10、20、30、40、50和60s，照射完畢后避光培養(yǎng)24h。液體培養(yǎng)基配方如實例1所示，同時又加入45mmol/L苯乙酮。30℃下，每分鐘還原苯乙酮生成1μg苯乙醇所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。收集反應(yīng)液通過氣相色譜分析產(chǎn)物苯乙醇的生成量，并計算酶活力(U)。

實驗結(jié)果顯示，系列遮光板孔數(shù)為9，照射時間為40s，誘變得到的酵母細(xì)胞S9酶活較高(如表1)，值為485U/L。

表1不同菌株誘變前后酶活情況

實施例3

本實施例為采用本實用新型對誘變菌株(熱帶假絲酵母S9)連續(xù)長周期培養(yǎng)，考察其產(chǎn)酶活性。在如實施例1液體培養(yǎng)基中加入45mmol/L苯乙酮，在30℃下發(fā)酵40h，氣相色譜分析方法測定苯乙醇的含量，從而計算酶活。由圖12可知，在細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，從2h開始細(xì)胞酶活力持續(xù)上升，到22h時酶活力(Enzyme activity)達(dá)到最高(512U/L)，維持約4h的較高酶活力，隨后酶活力開始下降，因此細(xì)胞的最佳培養(yǎng)時間為22h。