本申請根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求2014年4月29日提交的標題為“Bioelectronic Binding Assay Using Peak Profiling”的美國臨時專利申請U.S.S.N 61/985,969，以及于2014年4月29日提交的標題為“Bioelectronic Binding Assay on Pre-formed SAMS Using Peak Profiling”的U.S.S.N 61/985,976的優(yōu)先權(quán)，其各自的內(nèi)容通過引用整體并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

大體上描述了用于檢測樣品中之靶標分析物的生物電子結(jié)合測定的方法。

背景技術(shù)：

電子轉(zhuǎn)移反應是從光合作用到需氧呼吸的多種各種生物相互作用的關(guān)鍵步驟。在化學和生物系統(tǒng)中電子轉(zhuǎn)移反應的研究已經(jīng)產(chǎn)生了大量的知識和強大的理論基礎(chǔ)，其描述了在少量參數(shù)方面的電子轉(zhuǎn)移速率。

利用該知識，可以將電活性部分(electroactive moiety，EAM)設計為感測分子(sensing molecule)。電子轉(zhuǎn)移的強度在其與靶標相互作用時改變。

發(fā)明概述

本發(fā)明的一個實施方案的目的是提供一種稱為生物電子結(jié)合測定的方法，其用于使用兩種或更多種EAM直接或經(jīng)由替代靶標來檢測靶標。

在一個方面，本發(fā)明描述了這樣一種方法，通過該方法使用在電極上自組裝以形成單層的電活性部分(EAM)來檢測樣品中的目的靶標。當涉及多種EAM物質(zhì)時，每種EAM物質(zhì)可以具有特定的結(jié)構(gòu)和/或特定的電化學(electrochemical，E-chem)循環(huán)伏安法峰曲線(cyclic voltammetry peak profile，CVPP)E⁰。可以通過分配一個數(shù)字來將不同的EAM和與其有關(guān)的E⁰相關(guān)聯(lián)來區(qū)分不同的EAM。例如，EAM1和EAM2分別具有不同的E-chem CVPP E₁⁰和E₂⁰。在一些實施方案中，僅使用兩種類型的EAM在電極上形成自組裝單層(SAM)。在一些這樣的實施方案中，一種EAM(具有E₁⁰的EAM1)具有特異性結(jié)合目的靶標或替代靶標的捕獲配體。另一種EAM(具有E₂⁰的EAM2)可以不具有捕獲配體。當將含有所述目的靶標的樣品引入所述EAM時，所述EAM1的結(jié)合配體結(jié)合其特異性靶標或替代靶標，而所述EAM2不結(jié)合。

在一些實施方案中，將樣品直接加入到包含EAM混合物的溶液中以形成測定混合物，所述EAM混合物包含以已知比例混合的兩種EAM，EAM1和EAM2，其中EAM1還包含能夠結(jié)合目的靶標的結(jié)合配體。如果不存在靶標，當引入電極時，EAM1和EAM2可形成具有特定已知E₁⁰和E₂⁰的強度比值的自組裝單層(SAM)。如果所述目的靶標存在于所述樣品中，則所述EAM1的結(jié)合配體可與所述靶標結(jié)合。當與所述靶標結(jié)合時，在空間上阻礙所述EAM1形成自組裝單層(SAM)。然后將所述測定混合物與電極接觸。當與所述電極接觸時，所述測定混合物中剩余的游離EAM1和EAM2可以自組裝成單層，而結(jié)合的EAM1被阻礙而不能如此組裝。單層中的EAM1和EAM2的比例根據(jù)由于所述靶標的結(jié)合而空間上受阻礙不能形成SAM的EAM1的量而變化。E1⁰和E₂⁰的強度相應地改變，并且與所述樣品中存在的靶標的量成比例。

在一些實施方案中，如下文進一步描述的將樣品添加到用于夾心免疫測定的溶液中，通過該過程與另外連接結(jié)合伴侶的目的靶標形成夾心。所述結(jié)合伴侶成為替代靶標。在一些實施方案中，可以進行另外的清洗步驟。移除未結(jié)合的替代靶標后，可以將夾心(含有所述連接的替代靶標)直接添加到包含EAM混合物的溶液中以形成測定混合物，所述溶液包含以已知比例混合的EAM1和EAM2，其中EAM1還包含能夠與所述替代靶標結(jié)合的結(jié)合配體。所述EAM1的結(jié)合配體可以結(jié)合與所述夾心結(jié)合的所述替代靶標；從而在空間上阻礙結(jié)合的EAM1形成自組裝單層(SAM)。當所述測定混合物與電極接觸時，剩余的游離EAM1和EAM2可以自組裝以形成單層。單層中的EAM1和EAM2的比例根據(jù)由于與所述夾心相關(guān)的所述靶標的結(jié)合而在空間上受阻礙不能形成SAM的EAM1的量而變化。E₁⁰和E₂⁰的強度相應地改變，并且與所述樣品中存在的靶標的量成比例。

在一些實施方案中，如下文進一步描述的將樣品添加到用于夾心免疫測定的溶液中，通過該過程與具有另外連接結(jié)合伴侶的目的靶標形成夾心。在一些情況下，在移除夾心之后，留在溶液中的剩余的游離結(jié)合伴侶變成與所述樣品中存在的目的靶標濃度成反比的替代靶標?？梢詫⒑刑娲袠说娜芤褐苯犹砑拥桨珽AM混合物的溶液中以形成測定混合物，所述EAM混合物包含以已知比例混合的兩種EAM，EAM1和EAM2，其中EAM1包含能夠結(jié)合所述替代靶標的結(jié)合配體。所述EAM1的結(jié)合配體與所述替代靶標結(jié)合；從而阻礙EAM1形成自組裝單分子層(SAM)。然后將所述測定混合物與電極接觸，剩余的游離EAM1和EAM2自組裝成單層。單層中EAM1和EAM2的比例根據(jù)由于溶液中所述替代靶標的結(jié)合而在空間上受阻礙不能形成SAM的EAM1的量而變化。E₁⁰和E₂⁰的強度相應地改變，并且與溶液中存在的替代靶標的量成比例，其繼而與所述樣品中存在的靶標的量成反比。

在一些實施方案中，使用以已知比例混合的EAM1和EAM2的預形成SAM來檢測樣品中的目的靶標。當靶標與EAM1結(jié)合時，所述靶標改變EAM1周圍的重組能量，導致產(chǎn)生E₁’⁰。從E₁⁰到E₁’⁰和E₁’⁰相對于E₂⁰的改變與靶標的量成比例。

在另一個方面，提供了用于檢測樣品中至少一種靶標的方法，所述方法包括：使樣品與EAM混合物接觸以形成測定混合物，所述EAM混合物包含以已知比例混合的兩種或更多種電活性部分(EAM)，所述EAM具有不同的氧化還原電位(redox potential)E⁰(例如E₁⁰、E₂⁰、E₃⁰...)，并且所述EAM包含i.過渡金屬絡合物和ii.錨定基團，其中至少一種所述EAM還包含可被靶標識別并結(jié)合的捕獲配體；在其中EAM形成自組裝單層(SAM)的條件下使所述測定混合物與電極接觸；以及檢測信號以確定電化學(E-chem)循環(huán)伏安法峰曲線(CVPP)作為所述樣品中所述靶標存在狀況的指示。

在另一個方面，提供了用于檢測樣品中至少一種靶標的方法，所述方法包括使樣品與EAM混合物接觸以形成測定混合物，所述EAM混合物包含以已知比例混合的兩種或更多種電活性部分物質(zhì)(EAMs)，所述EAM具有不同的氧化還原電位E⁰(例如E₁⁰、E₂⁰、E₃⁰...)，并且所述EAM包含i.過渡金屬絡合物和ii.錨定基團，其中至少一種所述EAM還包含可結(jié)合所述靶標的捕獲配體；在其中EAM形成自組裝單層(SAM)的條件下使所述測定混合物與電極接觸；以及檢測信號以確定電化學(E-chem)循環(huán)伏安法峰曲線(CVPP)作為所述樣品中所述靶標存在狀況的指示。

在另一個方面，提供了檢測樣品中至少一種靶標分析物的方法，所述方法包括：使所述樣品與以下接觸以形成夾心：包含i.特異性針對所述靶標的結(jié)合位點和ii.固體支持物的第一捕獲配體、包含i.特異性針對所述靶標的結(jié)合位點(其在與所述第一捕獲配體的不同位置結(jié)合)和ii.能夠與結(jié)合伴侶結(jié)合的標簽的第二捕獲配體，以及能夠與所述第二捕獲配體的探針和作為替代靶標的EAM結(jié)合的結(jié)合伴侶；分離所述夾心并將其與未結(jié)合的所述結(jié)合伴侶(替代靶點)分離；使所述夾心或所述未結(jié)合的結(jié)合伴侶與EAM混合物接觸以形成測定混合物，所述EAM混合物包含以已知比例混合的兩種或更多種電活性部分物質(zhì)(EAMs)，所述EAM具有不同的氧化還原電位E⁰(例如E₁⁰、E₂⁰、E₃⁰...)，并且所述EAM包含i.過渡金屬絡合物和ii.錨定基團，其中至少一種所述EAM還包含可結(jié)合所述替代靶標的捕獲配體；在其中EAM形成自組裝單層(SAM)的條件下使所述測定混合物與電極接觸；以及檢測信號以確定電化學(E-chem)循環(huán)伏安法峰曲線(CVPP)作為所述樣品中所述靶標存在狀況的指示。

在另一個方面，提供了檢測樣品中至少一種靶標分析物的方法，所述方法包括：提供包含電極的固體支持物，所述電極包含預形成的自組裝單層(SAM)，所述預形成的自組裝單層包含以已知比例混合的兩種或更多種電活性部分物質(zhì)(EAMs)，所述EAM具有不同的氧化還原電位E⁰(例如E₁⁰、E₂⁰、E₃⁰...)，并且所述EAM包含i.過渡金屬絡合物和ii.錨定基團，其中至少一種所述EAM還包含可結(jié)合所述靶標的捕獲配體；使所述電極與所述樣品接觸；以及檢測信號以確定電化學(E-chem)循環(huán)伏安法峰曲線(CVPP)作為所述樣品中所述靶標存在狀況的指示。

在另一個方面，提供了檢測樣品中至少一種靶標分析物的方法，所述方法包括：提供包含電極的固體支持物，所述電極包含預形成的自組裝單層(SAM)，所述預形成的自組裝單層包含以已知比例混合的兩種或更多種電活性部分物質(zhì)(EAMs)，所述EAM具有不同的氧化還原電位E⁰(例如E₁⁰、E₂⁰、E₃⁰...)，并且所述EAM包含i.過渡金屬絡合物和ii.錨定基團，其中至少一種所述EAM還包含可結(jié)合所述靶標或替代靶標的捕獲配體；使所述樣品與以下接觸以形成夾心：包含i.特異性針對所述靶標的結(jié)合位點和ii.固體支持物的第一捕獲配體、包含i.特異性針對所述靶標的結(jié)合位點(其在與所述第一捕獲配體的不同位置結(jié)合)和ii.能夠與結(jié)合伴侶結(jié)合的標簽的第二捕獲配體，以及能夠與所述第二捕獲配體的探針和作為替代靶標的EAM結(jié)合的結(jié)合伴侶；分離所述夾心并將其與未結(jié)合的所述結(jié)合伴侶(替代靶點)分開；使所述夾心或所述未結(jié)合的結(jié)合伴侶與所述電極接觸；以及檢測信號以確定電化學(E-chem)循環(huán)伏安法峰曲線(CVPP)，以作為所述樣品中所述靶標存在狀況的指示。

在所提供的任一種方法的一個實施方案中，所述EAM混合物在溶液中包含兩種EAM，EAM1和EAM2，其中EAM1還包含可被所述靶標結(jié)合的捕獲配體。

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，所述靶標通過所述捕獲配體直接結(jié)合EAM1，從空間上阻礙所述EAM1形成SAM。

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，SAM中EAM1和EAM2的比例改變，導致CVPP(E₁⁰和E₂⁰)的改變。

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，CVPP的變化與所述靶標的量成比例。

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，所述靶標結(jié)合在(i)與固體支持物結(jié)合的第一捕獲分子和(ii)包含與結(jié)合伴侶結(jié)合的探針的第二捕獲分子之間，所述結(jié)合伴侶能夠結(jié)合EAM1，作為替代靶標。

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，所述靶標結(jié)合在(i)與固體支持物結(jié)合的第一捕獲分子和(ii)具有與結(jié)合伴侶結(jié)合的探針的第二捕獲分子之間，并被移除。在一個這樣的實施方案中，所述結(jié)合伴侶的游離形式能夠結(jié)合作為替代靶標的EAM1。

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，將樣品引入到包含EAM1和EAM2的預形成SAM中。

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，靶標與EAM1結(jié)合，引起能量的重組；從而導致E₁⁰變?yōu)镋₁’⁰，其繼而改變CVPP(E₁⁰、E₁’⁰和E₂⁰)。

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，所述捕獲配體和捕獲分子獨立地選自：單克隆抗體、單克隆抗體片段、多克隆抗體、多克隆抗體片段、蛋白質(zhì)、肽、適配體(aptamer)、核酸、或小分子。

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，所述過渡金屬絡合物包括(include)選自鐵、釕和鋨的過渡金屬。

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，所述過渡金屬絡合物包括(comprise)二茂鐵和經(jīng)取代的二茂鐵。

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，其中所述錨定基團包括硫、胺、硅、吡啶基、或與電極相互作用的其他基團。

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，使用了2種不同的EAM物質(zhì)，具有E₁⁰的EAM1和具有E₂⁰的EAM2，其中EAM1還包含可被目的靶標或替代靶標識別并結(jié)合的所述捕獲配體。

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，所述靶標或所述替代靶標通過所述捕獲配體與EAM1結(jié)合。

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，所述靶標或替代靶標如果結(jié)合，則在空間上阻礙所述EAM1形成SAM；改變SAM中EAM1和EAM2的比例，導致CVPP(E₁⁰和E₂⁰)的變化。

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，所述靶標或替代靶標結(jié)合EAM1，引起能量的重組；從而導致E₁⁰變?yōu)镋₁’⁰，其繼而改變CVPP(E₁⁰、E₁'⁰和E₂⁰)

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，至少一個清洗步驟作為夾心分離和分開過程的一部分進行。

在所提供的任一種方法的另一個實施方案中，所述CVPP的變化與混合物中存在的未結(jié)合的替代靶標的量成比例，所述替代靶標的量與所述樣品中的所述靶標的量成反比。

在另一方面，提供了包含電極的組合物，所述電極包含自組裝單層(SAM)，所述自組裝單層包含以已知比例混合的兩種或更多種電活性部分物質(zhì)(EAMs)，所述EAM具有不同的氧化還原電位E⁰(例如E₁⁰、E₂⁰、E₃⁰...)，并且所述EAM包含過渡金屬絡合物和錨定基團，其中至少一種所述EAM還包含能夠被靶標或替代靶標識別并結(jié)合的捕獲配體。

在另一方面，提供了用于檢測樣品中的至少一種靶標的方法，其是本文(例如在實施例中)提供的方法中的任一種。

在另一方面，提供了用于在電極上產(chǎn)生單層的方法，其是上文(例如在實施例中)提供的方法中的任一種。

在另一方面，提供了包含單層的組合物，所述單層是本文(例如在實施例中)提供的組合物中的任一種。

附圖說明

圖1.描述根據(jù)一組實施方案使用峰曲線在溶液中進行生物電子結(jié)合測定之方法的示意圖。圖1A描繪了根據(jù)某些實施方案，當不存在靶標時的自組裝單層(SAM)形成。圖1B描繪了根據(jù)某些實施方案，當靶標存在時的SAM形成。樣品中的靶標與溶液中的EAM1(結(jié)合EAM)直接相互作用。與標靶結(jié)合的EAM1在空間上阻礙形成SAM，導致當靶標存在于所述樣品中時形成的SAM中EAM1和EAM2(標準EAM)的比例的改變。通過峰曲線確定改變，并且其與樣品中存在的靶標的量成比例。

圖2.描述根據(jù)某些實施方案，使用峰曲線在溶液中使用替代靶標進行反向生物電子結(jié)合測定的方法的示意圖。首先將靶標與連接(attach)固體支持物(例如金屬珠)的捕獲分子(例如捕獲抗體)、與標簽(例如生物素標簽)綴合的檢測分子(例如檢測抗體)和標簽的結(jié)合伴侶(例如鏈霉親和素)混合，并使得通過特異性結(jié)合形成含有珠子、捕獲抗體、靶標、檢測抗體和結(jié)合伴侶的夾心復合物。在移除夾心復合物(例如當磁珠用作固體支持物時通過磁體移除)后，移除含有用作替代靶標的未結(jié)合的結(jié)合伴侶(鏈霉親和素)的溶液，并與EAM1(含有針對替代靶標的結(jié)合配體的結(jié)合EAM)和EAM2(標準EAM)混合。存在并可用于結(jié)合EAM1的替代靶標的量與樣品中靶標的量成反比。替代靶標與EAM1的結(jié)合引起E₁⁰的改變，導致結(jié)合的EAM1表現(xiàn)出E₁’⁰。從E₁⁰到E₁’⁰和E₁’⁰相對于E₂⁰的改變與替代靶標的量成比例，并與樣品中存在的靶標的量成反比。該改變通過峰曲線分析確定。

圖3.描述根據(jù)一組實施方案的用于在預形成的SAM上進行生物電子結(jié)合測定的方法的示意圖。靶標與EAM1(包含針對所述靶標之結(jié)合配體的結(jié)合EAM)的結(jié)合導致能量重組，并且其接近電極附近時影響來自EAM1和EAM2的電子轉(zhuǎn)移。靶標與EAM1的結(jié)合引起E₁⁰的變化，導致結(jié)合的EAM1表現(xiàn)出E₁’⁰。從E₁⁰到E₁’⁰和E₁’⁰相對于E₂⁰的改變與樣品中靶標的量成比例。該改變可以通過峰曲線來測量。

圖4.根據(jù)某些實施方案，顯示了在SAM中改變兩種EAM之比例的效果的數(shù)據(jù)。當不同濃度的一種EAM(PB65-99)與固定濃度的另一種EAM(BP65-77)混合用于SAM形成時，兩種EAM的CVPP均改變(圖4A)。通過峰曲線確定的信號隨著EAM的量提高而提高(圖4B)。

圖5.根據(jù)某些實施方案，顯示利用使用峰曲線的生物電子結(jié)合測定的靶標之劑量反應的數(shù)據(jù)。圖5A顯示了跨靶標(例如鏈霉親和素)濃度變化的EAM1和EAM2的信號。提高與EAM1結(jié)合的靶標的量導致與靶標的量成正比的變化的信號。圖5B顯示EAM1與EAM2的峰比值(peak ratio)相對于目標濃度所繪制的趨勢，說明了該關(guān)系中的趨勢。

圖6.根據(jù)某些實施方案，顯示使用峰曲線的生物電子結(jié)合測定之特異性的數(shù)據(jù)。首先將不同濃度的靶標(例如，鏈霉親和素)與固定濃度的非靶標(例如，BSA)混合，然后引入至EAM1(具有生物素作為捕獲配體的結(jié)合型EAM)和EAM2(不含捕獲配體的標準EAM)。在SAM形成后，由于鏈霉親和素與生物素的特異性結(jié)合，僅用鏈霉親和素而不是BSA觀察到劑量反應。

發(fā)明詳述

在一個方面，提供了用于基于電化學(E-chem)循環(huán)伏安法峰曲線(CVPP)的改變來檢測樣品中的靶標的方法。

該方法可涉及包含過渡金屬絡合物和錨定基團的至少兩種或更多種電活性部分(EAM)。所述過渡金屬絡合物可以能夠可逆地或半可逆地轉(zhuǎn)移一個或更多個電子。所述錨定基團可以允許所述EAM與固體支持物共價連接，在表面上形成自組裝單層(SAM)。每個EAM具有不同的E-chem CVPP E⁰。此外，至少一種EAM可以進一步包含可以被靶標或替代靶標識別和結(jié)合的捕獲配體。當將樣品引入溶液中或預形成的SAM上的EAM時，所述捕獲配體與所述靶標或替代靶標之間的相互作用可導致包含所有相關(guān)EAM之SAM的性質(zhì)改變。所述改變反映在E-chem CVPP中，并且可以通過電化學檢測系統(tǒng)檢測。所述E-chem CVPP變化與所述靶標或替代靶標的量成比例，可以以多種方式描述，并且可以數(shù)字表示。

利用具有兩種或更多種EAM的優(yōu)點(每個EAM具有不同的E-chem CVPP E⁰)，可以以許多不同的方式利用目標的檢測。一般而言，用于電子結(jié)合測定的形式可以分為兩個主要類別：在溶液中或在預形成的SAM上。

在一些實施方案中，將樣品引入包含兩種EAM(具有所選擇的特異性結(jié)合目的靶標之捕獲配體的EAM1和沒有捕獲配體的EAM2)的EAM混合物目的靶標，在溶液中以某一已知比例混合以形成測定混合物。然后可以將包含所述樣品和所述EAM混合物的所述測定混合物與電極接觸，并允許形成SAM。在一些實施方案中，在使所述測定混合物與所述電極接觸之前可以給予另外的結(jié)合時間。如果所述目的靶標不存在于所述樣品中，則SAM可以由EAM1和EAM2兩者形成，成比例地表征所述已知比例的所述EAM混合物。如果所述目的靶標存在于所述樣品中，則所述目的靶標可結(jié)合所述EAM1的捕獲配體，從空間上阻礙所結(jié)合的EAM1形成SAM。結(jié)果，如果存在所述目的靶標，則改變最終SAM中的EAM1(更少)和EAM2(更多)的比例。因此，涉及E₁⁰和E₂⁰兩者的E-chem CVPP的總體改變被檢測到，并其與所述靶標的量成比例。

在一些實施方案中，將樣品直接添加到包含EAM混合物的溶液中以形成測定混合物，所述EAM混合物包含以已知比例混合的兩種EAM(EAM1和EAM2)，其中EAM1還包含能夠結(jié)合目的靶標的結(jié)合配體。如果不存在靶標，當EAM1和EAM2被引入時，可形成具有特定已知E₁⁰和E₂⁰比值的電極自組裝單層(SAM)。如果所述目的靶標存在于所述樣品中，則所述EAM1的結(jié)合配體可以結(jié)合所述靶標。當與所述靶標結(jié)合時，所述EAM1在空間上受阻礙不能形成自組裝單層(SAM)。然后可使所述測定混合物與電極接觸。當與所述電極接觸時，所述測定混合物中剩余的游離EAM1和EAM2可以自組裝成單層，而結(jié)合的EAM1被阻礙不能這樣做。單層中的EAM1和EAM2的比例根據(jù)由于所述靶標的結(jié)合從而在空間上受阻礙不能形成SAM的EAM1的量而變化。E₁⁰和E₂⁰的強度相應地改變，并且與所述樣品中存在的靶標的量成比例。

在一些實施方案中，將樣品如下文進一步描述的加入到用于夾心免疫測定的溶液中，通過該操作，與另外連接結(jié)合伴侶的目的靶標形成夾心。所述結(jié)合伴侶成為替代靶標。在一些實施方案中，可以進行另外的清洗步驟。移除未結(jié)合的替代靶標后，可以將夾心(含有所述連接的替代靶標)直接添加到包含EAM混合物的溶液中以形成測定混合物，所述EAM混合物包含以已知比例混合的EAM1和EAM2，其中EAM1還包含能夠結(jié)合所述替代靶標的結(jié)合配體。EAM1的所述結(jié)合配體可以結(jié)合與所述夾心締合的所述替代靶標，從而在空間上阻礙形被結(jié)合的EAM1成自組裝單層(SAM)。當所述測定混合物與電極接觸時，剩余的游離EAM1和EAM2可以自組裝以形成單層。單層中的EAM1和EAM2的比例根據(jù)由于與所述夾心結(jié)構(gòu)締合的所述替代靶標的結(jié)合從而空間上受阻礙不能形成SAM的EAM1的量而變化。E₁⁰和E₂⁰的強度相應地改變，并且與所述樣品中存在的靶標的量成比例。

在一些實施方案中，將樣品如下文進一步描述的添加到用于夾心免疫測定的溶液中，通過該操作，與另外連接到結(jié)合伴侶的目的靶標形成夾心。在移除夾心之后，留在溶液中的剩余游離結(jié)合伴侶變成與所述樣品中存在的目的靶標濃度成反比的替代靶標。可以將含有替代靶標的溶液直接添加到包含EAM混合物的溶液中以形成測定混合物，所述EAM混合物包含以已知比例混合的兩種EAM，EAM1和EAM2，其中EAM1包含能夠結(jié)合所述替代靶標的結(jié)合配體。當EAM1的所述結(jié)合配體與所述替代靶標結(jié)合時，可以阻礙EAM1形成自組裝單層(SAM)。然后使所述測定混合物與電極接觸，剩余的游離EAM1和EAM2自組裝成單層。單層中EAM1和EAM2的比例根據(jù)由于所述替代靶標在溶液中的結(jié)合從而空間上受阻礙不能形成SAM的EAM1的量而變化。E₁⁰和E₂⁰的強度相應地改變，并且與溶液中存在的替代靶標的量成比例，其繼而與所述樣品中存在的靶標的量成反比。

在一些實施方案中，使用包括包含多種EAM的預形成SAM的電極直接檢測樣品中的目的靶標。在一些實施方案中，所述SAM由以已知比例混合的EAM1(具有針對所述靶標的捕獲配體)和EAM2(避寒捕獲配體)構(gòu)成。所述靶標與所述EAM1的捕獲配體的結(jié)合可以觸發(fā)EAM1的重組能量的改變，導致不同的E-chem CVPP E₁’⁰。所述改變還可以觸發(fā)包括E₁’⁰、E₁⁰和E₂⁰的E-chem CVPP的目的靶標改變，并且與樣品中所述靶標的量成比例。

在一些實施方案中，使用包括包含多種EAM的預形成SAM的電極通過替代靶標間接檢測樣品中的目的靶標。在一些實施方案中，所述SAM由以已知比例混合的EAM1(具有針對替代靶標的捕獲配體)和EAM2(不含捕獲配體)構(gòu)成。在如下文進一步描述的標準夾心免疫測定后，可形成含有與結(jié)合伴侶結(jié)合的所述靶標的夾心復合物。在一些實施方案中，分離所述夾心復合物并與任何未結(jié)合的夾心測定組分(包括未結(jié)合的結(jié)合伴侶)分離。在一些實施方案中，可以進行清洗步驟以確保所有未結(jié)合的結(jié)合伴侶已經(jīng)被移除。在移除未結(jié)合的結(jié)合伴侶后，含有所述結(jié)合的結(jié)合伴侶的所述夾心復合物變成與所述靶標成比例的替代靶標。通過在所述替代靶標和EAM1上的捕獲配體之間的識別，所述夾心復合物可以結(jié)合EAM1，改變EAM1的重組能量。從而，E₁⁰變?yōu)镋₁’⁰。包括E₁’⁰、E₁⁰和E₂⁰的E-chem CVPP的總體改變與結(jié)合所述夾心復合物的所述替代靶標的量成正比，其繼而樣品中靶標的量成反比。

在一些實施方案中，使用包括包含多種EAM的預形成SAM的電極通過替代靶標間接檢測樣品中的目的靶標。在一些實施方案中，所述SAM有EAM1(具有針對替代靶標的捕獲配體)和EAM2(不含捕獲配體)構(gòu)成。在標準夾心免疫測定后，可以形成含有與結(jié)合伴侶結(jié)合的所述靶標的夾心。移除夾心后，使含有剩余的未結(jié)合的結(jié)合伴侶的溶液與所述電極接觸，所述剩余的未結(jié)合的結(jié)合伴侶變成與所述靶標成反比的替代靶標。替代靶標可以結(jié)合EAM1，改變EAM₁的重組能量。繼而，E₁⁰變?yōu)镋₁’⁰。包括E₁’⁰、E₁⁰和E₂⁰的E-chem CVPP的總體改變與所述替代靶標的量成比例，但與樣品中的所述靶標成反比。

在一些實施方案中，使用以已知比例混合的EAM1和EAM2的預形成SAM來檢測樣品中的目的靶標。當靶標結(jié)合EAM1時，所述靶標可以改變EAM1周圍的重組能量，導致形成E₁’⁰。從E₁⁰到E₁’⁰和E₁’⁰相對于E₂⁰的改變與靶標的量成比例。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，所述方法具有多個優(yōu)點，包括但不限于1)以第二EAM作為參照的更好的測定質(zhì)量控制；2)在溶液中或在預形成的SAM上的通用測定形式；3)直接定量靶標或通過替代靶標間接定量靶標，這允許使用一種EAM物質(zhì)來檢測許多不同的靶標；4)對于在使用或不使用現(xiàn)有先前的夾心免疫測定的情況下檢測靶標的靈活性。

夾心免疫測定

本文中“夾心免疫測定”和其他語法等價物具有其在本領(lǐng)域中的普通含義，并且可以指在兩個獨立的結(jié)合配體之間結(jié)合目的靶標的過程。在一些實施方案中，順序地添加夾心免疫測定的組分。在一些實施方案中，可以在添加夾心免疫測定的組分之間進行清洗步驟。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，發(fā)現(xiàn)抗體、抗體片段特別用作結(jié)合配體，盡管可以使用許多其它合適的結(jié)合配體，如下文進一步描述。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，本文提供了在固體支持物上的夾心免疫測定的簡要描述。

固體支持物，例如磁珠，可以用第一捕獲分子或第一捕獲配體修飾。該捕獲分子，例如抗體，選擇性地結(jié)合目的靶標。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，存在許多合適的捕獲分子，并且可以基于與目的靶標的相容性來選擇。

當將含有目的靶標的樣品引入具有第一捕獲分子的固體支持物時，可以發(fā)現(xiàn)靶表并使其與第一捕獲分子或第一捕獲配體結(jié)合。

然后將第二捕獲分子、第二捕獲配體、檢測分子或檢測配體(例如與標簽綴合的抗體)添加到靶標-固體支持物-捕獲配體溶液中。合適的標簽包括但不限于小分子，例如生物素或酶。檢測分子或檢測配體可以結(jié)合靶標，導致靶標在第一捕獲配體和第二檢測配體之中間的“夾心”形成。取決于標簽的性質(zhì)，含有靶標的夾心可以用電化學、熒光或光學檢測方法定量。在一些實施方案中，可以使用與結(jié)合至結(jié)合伴侶的標簽綴合的第二捕獲分子，特別是當所述結(jié)合伴侶還可以與含有特異性針對所述結(jié)合伴侶之捕獲配體的EAM結(jié)合時，從而使所述結(jié)合伴侶適合用作替代靶標。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，本發(fā)明的組合物可以以多種方式制備，其實例概述于下文和美國專利8,734,631、US20110033869、US20140027309、提交于2008年10月17日的美國專利申請No.12/253,828、提交于2008年10月17日的美國專利申請No.12/253,875、提交于2010年5月21日的美國專利臨時申請No.61/347,121、提交于2010年7月20日的美國專利臨時申請No.61/366,013、提交于2012年11月2日的美國專利申請No.13/667713。在一些實施方案中，根據(jù)美國專利No.6,013,459、6,248,229、7,018,523、7,267,939、美國專利申請No.09/096593和60/980,733，以及提交于2008年8月7日的美國臨時申請No.61/087,102中公開的方法制備組合物，其各自通過引用整體并入本文。通過引用并入本文的所有專利申請和專利通過引用整體并入。在相沖突的情況下，以本說明書(包括定義)為準。

電活性部分(EAM)的結(jié)構(gòu)

通常，EAM的結(jié)構(gòu)可以描述如下：EAM包含氧化還原活性分子，其一般包含過渡金屬和至少一種為過渡金屬提供配位原子的配體。所述EAM可以(一般通過接頭)共價連接到電極的表面。在氧化還原活性分子的附近空間，捕獲配體也可以一般以如本文所述的兩種方式之一并且使用或不使用接頭地連接。靶標與捕獲配體的結(jié)合導致氧化還原活性分子的電化學電位的改變，然后其可以以本文所述的多種方式檢測和測量。

AG-間隔物-EAM-(接頭)_n-CL(I)

其中AG是錨定基團，EAM是包含氧化還原復合物的電活性部分，CL是捕獲配體，間隔物是本文所述的SAM形成物質(zhì)，并且接頭提供EAM和CL之間的空間，其中n＝0或1。

在一個實施方案中，EAM的過渡金屬的配位原子由捕獲配體提供，形成“氧化還原活性部分復合物”(ReAMC，redox active moiety complex)。在該實施方案中，配位原子可以是捕獲配體的一部分(例如，如果捕獲配體是肽，則氨基可以提供配位原子)，或用于連接捕獲配體的接頭的一部分(例如吡啶接頭等)。

在另一個實施方案中，ReAMC是單一物質(zhì)，但捕獲配體不提供配位原子；相反，它在空間上接近但不同于ReAMC的EAM。

第二EAM(例如標準EAM)類似于上述EAM，但沒有捕獲配體。

AG-間隔物-EAM (II)

其中AG是錨定基團，EAM是包含氧化還原復合體的電活性部分，間隔物是本文所述的SAM形成物質(zhì)。

電活性部分(EAM)

本文中“電活性部分(EAM)”或“過渡金屬絡合物”或“氧化還原活性分子”或“電子轉(zhuǎn)移部分(electron transfer moiety，ETM)”是指含金屬的化合物，其能夠可逆地或半可逆地轉(zhuǎn)移一個或更多個電子。應當理解，電子供體和受體能力是相對的；即在某些實驗條件下可以失去電子的分子將能夠在不同的實驗條件下接受電子。

應當理解，可能的過渡金屬絡合物的數(shù)量非常大，并且電子轉(zhuǎn)移化合物領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠利用本發(fā)明中的許多化合物。本文中“過渡金屬”是指其原子具有部分或完整電子外殼的金屬。用于本發(fā)明中合適的過渡金屬包括，但不限于，鎘(Cd)、銅(Cu)、鈷(Co)、鈀(Pd)、鋅(Zn)、鐵(Fe)、釕(Ru)、銠(Rh)、鋨(Os)、錸(Re)、鉑(Pt)、鈧(Sc)、鈦(Ti)、釩(V)、鉻(Cr)、錳(Mn)、鎳(Ni)、鉬(Mo)、锝(Tc)、鎢(W)和銥(Ir)。也就是說，在一些實施方案中，發(fā)現(xiàn)第一系列過渡金屬，鉑金屬(Ru、Rh、Pd、Os、Ir和Pt)以及Fe、Re、W、Mo和Tc在本發(fā)明中特別有用。在一些實施方案中，使用在氧化態(tài)改變時不改變配位位點數(shù)目的金屬，包括釕、鋨、鐵、鉑和鈀，以及鋨、釕。在某些實施方案中，使用鐵和/或鋨。在一些實施方案中，一種或多種EAM(例如，EAM 1和EAM 2)不包含鐵。在一些實施方案中，使用二茂鐵和二取代的二茂鐵。一般而言，過渡金屬在本文中描述為TM或M。

過渡金屬和配位配體形成金屬絡合物。本文中“配體”或“配位配體”意指原子、離子、分子或官能團，其一般通過配位共價鍵將其電子的一個或更多個提供給一個或更多個中心原子或離子，或通過共價鍵與一個或更多個中心原子或離子共享其電子。

金屬的其它配位點用于將過渡金屬絡合物連接到捕獲配體(直接地或使用接頭間接地)，或電極(經(jīng)常使用間隔物，如下文更充分描述)，或兩者處。因此，例如，當過渡金屬絡合物直接連結(jié)到結(jié)合配體時，金屬離子的一個、兩個或更多個配位位點可以被由結(jié)合配體(或者如果間接連結(jié)，則通過接頭)提供的配位原子占據(jù)。作為替代地或另外地，金屬離子的一個或更多個配位位點可以被用于將過渡金屬絡合物連接到電極的間隔物占據(jù)。例如，當過渡金屬絡合物與結(jié)合配體分開地連接到電極時，如下文更充分描述的，則除了1(n-1)之外的金屬(n)的所有配位位點可以含有極性配體。

合適的小極性配體(一般在本文中描述為“L”)分為兩大類。在一個實施方案中，由于其作為一般不良的離去基團或作為良好的σ供體之特性，以及金屬的特性，小極性配體將有效地不可逆地結(jié)合到金屬離子處。這些配體可以稱為“取代惰性的”。或者，小極性配體可以可逆地結(jié)合到金屬離子處，從而使得在結(jié)合靶標分析物時，由于靶標分析物良好的離去基團性質(zhì)或不良的σ給體性質(zhì)，分析物可以為金屬提供一個或更多個配位原子，有效地替代小的極性配體。這些配體可以稱為“取代不穩(wěn)定的”。在一些情況下，使用形成偶極子的配體，因為這可以有助于高溶劑重組能。

過渡金屬絡合物的一些結(jié)構(gòu)如下所示：

L是為金屬離子的結(jié)合提供配位原子的共配體(co-ligand)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，共配體的數(shù)量和性質(zhì)將取決于金屬離子的配位數(shù)。單齒、二齒或多齒共配位體可以在任何位置使用。因此，例如，當金屬的配位數(shù)為6時，來自導電寡聚物的末端的L、來自核酸的L和r總計多至6。因此，當金屬的配位數(shù)為6時，當所有共配位體都是單齒時，r可以為0(當所有配位原子由其它兩個配體提供時)至4。因此，一般而言，r可以為0至8，這取決于金屬離子的配位數(shù)和其它配體的選擇。

在一個實施方案中，金屬離子的配位數(shù)為6，并且連接到導電寡聚物的配體和連接到核酸的配體都是至少雙齒的；也就是說，r可以為零，1(即剩余的輔助配體是二齒的)或2(使用兩個單齒的共配體)。

如本領(lǐng)域所理解的，共配體可以相同或不同。合適的配體分為兩類：使用氮、氧、硫、碳或磷原子(取決于金屬離子)作為配位原子的配體(在文獻中通常稱為σ供體)，和有機金屬配體例如茂金屬配體(在文獻中通常稱為π供體，并且在本文中描述為L_m)。合適的供氮配體(nitrogen donating ligand)是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于氰基(C≡N)，NH₂；NHR；NRR'；吡啶；吡嗪；異煙酰胺；咪唑；聯(lián)吡啶和聯(lián)吡啶的取代衍生物；三聯(lián)吡啶和取代衍生物；菲咯啉，特別是1，10-菲咯啉(縮寫為phen)和菲咯啉的取代衍生物，例如4，7-二甲基菲咯啉和雙吡啶醇[3，2-a：2'，3’-c]吩嗪(縮寫為dppz)；二吡啶并吩嗪；1，4，5，8，9，12-六氮雜苯并菲(縮寫為hat)；9，10-菲醌二亞胺(縮寫為phi)；1，4，5，8-四氮雜菲(縮寫為tap)；1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷(縮寫為cyclam)和異氰化物。也可以使用經(jīng)取代衍生物，包括稠合衍生物。在一些實施方案中，可以使用卟啉家族的取代衍生物和卟啉。參見例如Comprehensive Coordination Chemistry，Wilkinson等編輯，Pergammon出版社，1987，章節(jié)13.2(73-98頁)、21.1(813-898頁)和21.3(915-957頁)，其全部內(nèi)容通過引用并入。

如本領(lǐng)域所理解的，其中供體(1)結(jié)合金屬且供體(2)可用于與周圍介質(zhì)(溶劑、蛋白質(zhì)，等)相互作用的任何供體(1)-橋-供體(2)可以用于本發(fā)明中，特別是如果供體(1)和供體(2)通過π系統(tǒng)偶聯(lián)，如在氰基中(C是供體(1)，N是供體(2)，π系統(tǒng)是CN三鍵)。一個實例是聯(lián)嘧啶，其看起來很像聯(lián)吡啶，但在“背側(cè)”具有與介質(zhì)相互作用的N供體。另外的共配體包括但不限于氰酸酯、異氰酸酯(-N＝C＝O)、硫氰酸酯、異腈、N₂、O₂、羰基、鹵化物、烷氧化物、硫醇酯、酰胺、磷化物和含硫化合物如亞磺酰基、磺酰基、磺氨基和氨磺酰基。

在一些實施方案中，多個氰基用作與不同金屬絡合的共配體。例如，七個氰基結(jié)合Re(III)；八個氰基結(jié)合Mo(IV)和W(IV)。因此，在本發(fā)明中可以使用具有6個或更少氰基的Re(III)和一個或更多個L，或者一個或更多個L的結(jié)構(gòu)和具有7個或更少氰基的Mo(IV)或W(IV)與。在一些實施方案中，具有W(IV)系統(tǒng)的EAM具有優(yōu)于一些實施方案中的另一些系統(tǒng)的優(yōu)點，因為其更惰性，更易于制備，并且具有更有利的還原電位。一般而言，較大的CN/L比例將給出較大的偏移。

使用碳、氧、硫和磷的合適的σ供體配體是本領(lǐng)域已知的。例如，合適的σ碳供體見于Cotton和Wilkenson，Advanced Organic Chemistry，第5版，John Wiley&Sons，1988，通過引用并入本文；例如參見第38頁。類似地，合適的氧配體包括冠醚、水和本領(lǐng)域已知的其它物質(zhì)。膦和取代的膦也是合適的；見Cotton和Wilkenson的第38頁。

氧、硫、磷和氮供體配體可以以允許雜原子用作配位原子的方式連接。

在一些實施方案中，使用有機金屬配體。除了用作氧化還原部分的純有機化合物以及具有δ-鍵合的有機配體(其具有作為雜環(huán)或環(huán)外取代基的供體原子)的多種過渡金屬配位絡合物外，還有多種多樣的具有π鍵合的有機配體的過渡金屬有機金屬化合物(見Advanced Inorganic Chemistry，第5版，Cotton&Wilkinson，John Wiley&Sons，1988，第26章；Organometallics，A Concise Introduction，Elschenbroich等，第2版，1992，VCH；和Comprehensive Organometallic Chemistry II，A Review of the Literature 1982-1994，Abel等編，第7卷，第7、8、10&11章，Pergamon出版社，其通過引用并入)。這樣的有機金屬配體包括環(huán)狀芳族化合物，例如環(huán)戊二烯離子[C₅H₅(-1)]和多種環(huán)取代和環(huán)稠合衍生物，例如茚基(-1)離子，其產(chǎn)生一類雙(環(huán)戊二烯基)金屬化合物(即金屬茂)；見例如Robins等，J.Am.Chem.Soc.104：1882-1893(1982)；和Gassman等，J.Am.Chem.Soc.108：4228-4229(1986)，通過引用整體并入本文。其中，二茂鐵[(C₅H₅)₂Fe]及其衍生物是已經(jīng)用于各種化學(Connelly等，Chem.Rev.96：877-910(1996)，通過引用整體并入本文)和電化學(Geiger等，Advances in Organometallic Chemistry 23：1-93；和Geiger等，Advances in Organometallic Chemistry 24：87，通過引用整體并入本文)電子轉(zhuǎn)移或“氧化還原”反應的原型實例。多種第一、第二和第三行過渡金屬的茂金屬衍生物是潛在的候選物，因為氧化還原部分可以共價連接核酸的核糖環(huán)或核苷堿基。為了得到雙(芳烴)金屬化合物及其環(huán)取代和環(huán)稠合衍生物，其它潛在合適的有機金屬配體包括環(huán)狀芳烴如苯，其中雙(苯)鉻是原型實例。其它無環(huán)π-鍵合配體如烯丙基(-1)離子或丁二烯產(chǎn)生潛在合適的有機金屬化合物，并且所有這些配體與其它π-鍵合和δ-鍵合的配體共同構(gòu)成其中存在金屬與碳鍵的有機金屬化合物的一般類別。具有橋連有機配體和另外的非橋連配體以及具有和不具有金屬-金屬鍵的此類化合物的多種二聚體和寡聚物的電化學研究是在核酸分析中的潛在的候選氧化還原部分。

當一個或更多個共配體是有機金屬配體時，該配體通?？梢酝ㄟ^有機金屬配體的碳原子之一連接，但是也可以通過其它原子連接雜環(huán)配體。有機金屬配體包括茂金屬配體，包括取代衍生物和茂金屬催化劑(metalloceneophane)(見Cotton和Wilkenson的第1174頁，同上)。例如，茂金屬配體的衍生物如甲基環(huán)戊二烯基或具有多個甲基的配體(例如五甲基環(huán)戊二烯基)可用于提高茂金屬的穩(wěn)定性。在一個實施方案中，茂金屬的兩個茂金屬配體中僅有一個被衍生化。

如本文所述，可以使用配體的任何組合。在一些實施方案中，所述組合可包括：a)所有配體是供氮配體；b)所有配體是有機金屬配體；和c)在導電寡聚物的末端的配體是金屬茂配體，并且由核酸提供的配體是供氮配體，如果需要，其他配體是供氮配體或茂金屬配體，或者是混合物。

通常，包含非大環(huán)螯合劑的EAM可以與金屬離子結(jié)合以形成非大環(huán)螯合化合物，因為金屬的存在允許多個前配體(proligand)結(jié)合在一起以產(chǎn)生多重氧化態(tài)。

在一些實施方案中，使用供氮前配體。合適的供氮前配體是本領(lǐng)域公知的，且包括但不限于，NH₂；NHR；NRR'；吡啶；吡嗪；異煙酰胺；咪唑；聯(lián)吡啶和聯(lián)吡啶的取代衍生物；三聯(lián)吡啶和取代衍生物；菲咯啉，特別是1，10-菲咯啉(縮寫為phen)和菲咯啉的取代衍生物，例如4，7-二甲基菲咯啉和雙吡啶醇[3，2-a：2'，3’-c]吩嗪(縮寫為dppz)；二吡啶并吩嗪；1，4，5，8，9，12-六氮雜苯并菲(縮寫為hat)；9，10-菲醌二亞胺(縮寫為phi)；1，4，5，8-四氮雜菲(縮寫為tap)；1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷(縮寫為cyclam)和異氰化物。也可以使用取代衍生物，包括稠合衍生物。應當注意，認為不配位地飽和金屬離子并且需要添加另一前配體的大環(huán)配體是用于該目的非大環(huán)配體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，可以共價連接多個“非大環(huán)”配體以形成配位飽和的但是缺少環(huán)狀骨架的化合物。

在一些實施方案中，單齒(例如至少一個氰基配體)、雙齒、三齒和多齒配體(直至飽和)的混合物可用于EAM的構(gòu)建。

一般而言，配體的組成或特性決定了過渡金屬絡合物是否是溶劑可及的。“溶劑可及的過渡金屬絡合物”或語法等價物具有其在本領(lǐng)域中的普通含義，并且可以例如是指具有至少一個(例如兩個、三個、四個或更多個)小極性配體的過渡金屬絡合物。極性配體的實際數(shù)量將取決于金屬離子的配位數(shù)(n)。在一些實施方案中，極性配體的數(shù)目為(n-1)和(n-2)。例如，對于六配位金屬如Fe、Ru和Os，溶劑可及的過渡金屬絡合物可以具有一至五個小的極性配體(例如，兩個至五個極性配體、三至五個極性配體)，取決于對其他位點的要求。四配位金屬如Pt和Pd可具有一個、兩個或三個小的極性配體。

應當理解，“溶劑可及”和“溶劑抑制”是相對術(shù)語。也就是說，在高施加能量下，甚至溶劑可及的過渡金屬絡合物也可以被誘導轉(zhuǎn)移電子。

二茂鐵基EAM

在一些實施方案中，EAM包含取代的二茂鐵。二茂鐵是空氣穩(wěn)定的。它可以容易地被捕獲配體和錨定基團取代。在靶蛋白與二茂鐵上的捕獲配體結(jié)合時(其不僅改變二茂鐵周圍的環(huán)境，而且阻止環(huán)戊二烯基環(huán)旋轉(zhuǎn))，能量可以改變約4kJ/mol。WO/1998/57159；Heinze和Schlenker，Eur.J.Inorg.Chem.2974-2988(2004)；Heinze和Schlenker，Eur.J.Inorg.Chem.66-71(2005)；以及Holleman-Wiberg，Inorganic Chemistry，Academic Press第34版，1620頁，其各自通過引用整體并入本文。

在一些實施方案中，錨定和捕獲配體連接到相同的配體以用于更容易的合成。在一些實施方案中，錨定和捕獲配體連接到不同的配體。

存在可用于構(gòu)建本文公開的新結(jié)構(gòu)的許多配體。它們包括但不限于羧酸酯、胺、硫醇酯、膦、咪唑、吡啶、聯(lián)吡啶、tacn(1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷)、沙侖(N，N’-雙(亞水楊基)乙二胺)、acacen(N，N’-亞乙基雙(乙酰丙酮亞胺(-))、EDTA(乙二胺四乙酸)、DTPA(二亞乙基三胺五乙酸)、Cp(環(huán)戊二烯基)、鉗配體(pincer ligand)和蝎型配體(scorpionate)。在一些實施方案中，配體是五胺。

鉗配體是特定類型的螯合配體。鉗配體將其自身圍繞金屬中心纏繞以在金屬的相對側(cè)以及其間的一個產(chǎn)生鍵。鉗配體在化學性質(zhì)上對金屬核電子的影響類似于胺、膦和混合供體配體。這產(chǎn)生了獨特的化學狀態(tài)，其中金屬的活性可以被定制。例如，由于對絡合物的空間位置有如此高的要求以便容納鉗配體，所以金屬可參與的反應是受限的和選擇性的。

蝎型配體(scorpionate ligand)是指可以以.fac方式結(jié)合金屬的三齒配體。最普遍的一類蝎型配體是三(吡唑基)硼氫化物或Tp配體。Cp配體與Tp同位異構(gòu)。

在一些實施方案中，期望以下限制：金屬絡合物應當具有允許與溶劑緊密接觸的小的極性配體。

間隔物基團

在一些實施方案中，EAM或ReAMC通過連接接頭(attachment linker)或間隔物(“間隔物1”)與錨定基團(其與電極連接)共價連接，所述連接接頭或間隔物還通常包括允許連接接頭與電極締合的功能部分。見例如美國專利7,384,749，其通過引用整體并入本文，并且具體用于連接接頭的討論。應當注意，在金電極的情況下，硫原子可以用作官能團(為了本發(fā)明的目的，這種連接被認為是共價的)。本文中“間隔物”或“連接接頭”是指保持氧化還原活性復合物離開電極表面外部分。在一些實施方案中，間隔物是本文概述的導電寡聚物，盡管合適的間隔物部分也包括如下所概述的鈍化劑和絕緣體。在一些情況下，間隔物分子是SAM形成物質(zhì)。間隔物部分可以是基本上不導電的。在某些實施方案中，氧化還原活性分子和電極(H_AB)之間的電子偶聯(lián)不限制電子轉(zhuǎn)移的速率。

此外，在使用ReAMC的情況下，可以在捕獲配體的配位原子和捕獲配體本身之間使用連接接頭。類似地，連接接頭可以是分支的。此外，當捕獲配體不與ReAMC締合時，可以使用連接接頭將捕獲配體與電極連接。

連接接頭的一端可以與EAM/ReAMC/捕獲配體連接，并且另一端(盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，它不需要是任一端的精確末端)可以與電極連接。

根據(jù)所使用的電極和導電寡聚物，可以以多種方式實現(xiàn)含有氧化還原活性分子的導電寡聚物的共價連接(以及其它間隔物分子的連接)。見例如結(jié)構(gòu)12-19和美國專利公開No.20020009810中的所附文本，其通過引用整體并入本文。

通常，間隔物的長度如美國專利No.6,013,459、6,013,170和6,248,229以及7,384,749中對導電聚合物和鈍化劑所概述的，所有這些專利的全部內(nèi)容通過引用并入本文。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，如果間隔物變得太長，氧化還原活性分子和電極之間的電子耦合可迅速降低。

捕獲配體

多種分子可以在本發(fā)明中用作捕獲配體。本文的“捕獲配體”或“結(jié)合配體”、“捕獲分子”或“捕獲結(jié)合配體”或“捕獲結(jié)合物質(zhì)”或“捕獲探針”或“檢測配體”或“檢測分子”或語法等同物意指用于探測靶標之存在的化合物，意味著其識別靶標并將與靶標結(jié)合。如下面更全面地概述的，靶標與捕獲探針的連接可以是直接的(即靶標結(jié)合捕獲配體)或間接的(例如使用一個或多個捕獲延伸配體)。本文中“共價連接”意指兩個部分通過至少一個鍵連接，包括σ鍵、π鍵和配位鍵。

在一些實施方案中，結(jié)合是特異性的，并且捕獲配體是結(jié)合對的一部分。本文“特異性結(jié)合”是指配體以足以區(qū)分靶標和測試樣品的其它組分或污染物的特異性結(jié)合靶標。然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，可以使用不是高度特異性的結(jié)合來檢測目標；例如，系統(tǒng)可以使用不同的捕獲配體，例如不同配體的陣列，并且任何特定靶標的檢測通過其結(jié)合到一組結(jié)合配體的“標志”完成，其類似于“電子鼻”的工作方式。這可能在檢測化學分析物中具有特別的用途。該結(jié)合應足以在該測定條件下保持結(jié)合，包括移除非特異性結(jié)合的清洗步驟。這種結(jié)合可足以在測定條件下保持結(jié)合，包括移除非特異性結(jié)合的清洗步驟。通常，靶標與結(jié)合配體的解離常數(shù)將在至少10^-4至10^-6M^-1的范圍內(nèi)(例如，10^-5至10^-9M^-1的范圍，10^-7至10^-9M^-1的范圍)。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，捕獲配體的組成將取決于靶標的組成。多種靶標的捕獲配體是已知的或可以使用已知技術(shù)容易地發(fā)現(xiàn)。例如，當靶標是單鏈核酸時，捕獲配體可以是互補核酸。類似地，靶標可以是核酸結(jié)合蛋白，且捕獲結(jié)合配體是單鏈或雙鏈核酸；或者，當靶標是單鏈或雙鏈核酸時，結(jié)合配體可以是核酸結(jié)合蛋白。當靶標是蛋白質(zhì)時，結(jié)合配體包括蛋白質(zhì)或小分子。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，可以使用會締合的任何兩個分子，作為靶標或作為結(jié)合配體。合適的靶標/結(jié)合配體對包括但不限于抗體/抗原、受體/配體、蛋白質(zhì)/核酸、酶/底物和/或抑制劑、碳水化合物(包括糖蛋白和糖脂)/凝集素、蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)/小分子；碳水化合物及其結(jié)合配偶體也是合適的靶標-結(jié)合配體對。這些可以是野生型或衍生序列。在一個實施方案中，結(jié)合配體是已知會多聚化的細胞表面受體的部分(例如細胞外部分)，例如生長激素受體、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(特別是GLUT 4受體)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、表皮生長因子受體、低密度脂蛋白受體、高密度脂蛋白受體、表皮生長因子受體、瘦蛋白受體、白介素受體(包括IL1、IL 2、IL 3、IL 4、IL 5、IL 6、IL 7、IL 8、IL 9、IL 11、IL 12、IL 13、IL 15和IL 17受體)、人生長激素受體、VEGF受體、PDGF受體、EPO受體、TPO受體、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體、催乳素受體和T細胞受體。

如本文所述，捕獲配體可以通過共價鍵與配位配體和/或錨定基團(anchor)連接。捕獲結(jié)合配體的連接方法通?？梢匀绫绢I(lǐng)域已知的那樣進行，并且將取決于連接接頭和捕獲結(jié)合配體的組成。一般，捕獲配體通過使用每個分子上的官能團與連接接頭連接，其之后可以用于連接。在一些實施方案中，用于連接的官能團是氨基、羧基、氧代基和硫醇基。然后可以直接或通過使用有時在本文中描述為“Z”的接頭連接這些官能團。接頭是本領(lǐng)域已知的；例如公知的同-或異-雙官能接頭(見1994Pierce Chemical Company目錄，對于交聯(lián)接頭的技術(shù)部分，第155-200頁，通過引用并入本文)。Z接頭包括但不限于烷基(包括取代的烷基和含有雜原子部分的烷基)。在一些實施方案中，Z接頭可以是短烷基、酯、酰胺、胺、環(huán)氧基和乙二醇及其衍生物。Z也可以是砜基，其形成磺酰胺。

以這種方式，可以添加包含蛋白質(zhì)、凝集素、核酸、小有機分子、碳水化合物等的捕獲結(jié)合配體。

在一些實施方案中，將抗體或其片段用作捕獲配體。“抗體”具有其在本領(lǐng)域中的普通含義，并且可以指例如稱為免疫球蛋白的糖基化蛋白質(zhì)家族的成員，其可以與抗原特異性組合。術(shù)語“抗體”包括本領(lǐng)域已知的全長以及抗體片段，包括Fab、Fab2、單鏈抗體(例如Fv)、嵌合抗體、人源化和人抗體等(通過完整抗體的修飾產(chǎn)生的或者使用重組DNA技術(shù)從頭合成的那些產(chǎn)物)，及其衍生物。

在一些實施方案中，不使用完整抗體。在這種情況下，這是因為抗體可能過大，導致與換能器的干擾。因此，在一些實施方案中，將抗體片段和模擬表位(mimitope)用作捕獲配體。

本文中“模擬表位”意指具有生物學重要位點(例如表位)或酶活性位點或受體結(jié)合位點之空間結(jié)構(gòu)的肽。

本文中的“表位”意指抗體識別抗原的實際位點。該術(shù)語也可與“抗原決定簇”或“抗原決定簇位點”互換使用。

在一些實施方案中，捕獲配體包含抗體替代物，包括但不限于avimer。本文中“avimer”意指通過體外外顯子改組和噬菌體展示從人類細胞外受體結(jié)構(gòu)域的大家族進化而來的蛋白質(zhì)。它一般是具有結(jié)合和抑制性質(zhì)的多結(jié)構(gòu)域蛋白。見Silverman等，Nature Biotechnology 23：1556-1561(2005)，通過引用并入本文。

在一些實施方案中，捕獲配體包含寡聚肽。這些肽可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)獲得，其包括但不限于噬菌體展示(Sidhu等，Methods Enzymol.，328，333-363(2000))和一珠一肽。例如，可以使用Biopanning獲得該肽。Giodano等，Nat Med.7：1249-53(2001)；通過引用并入本文。

當目標分析物是核酸或核酸結(jié)合蛋白時，捕獲配體可以是核酸；或者，如美國專利5,270,163、5,475,096、5,567,588、5,595,877、5,637,459、5,683,867、5,705,337和相關(guān)專利一般性描述的，所有這些都通過引用并入本文，可以開發(fā)核酸“適配體”用于結(jié)合幾乎任何靶標分析物。類似地，存在與基于組合化學方法的結(jié)合伴侶的發(fā)展相關(guān)的大量文獻。在該實施方案中，當捕獲配體是核酸時，示例性組合物和技術(shù)在PCT US97/20014中概述，其通過引用并入本文。

在一些實施方案中，捕獲配體包含適配體。本文中“適配體”是指單鏈、部分單鏈、部分雙鏈或雙鏈核苷酸序列，其有利地是可復制的核苷酸序列，能夠通過除Watson-Crick堿基配對或三鏈體形成之外的機制特異性識別所選擇的非寡核苷酸分子或分子組。本文公開的適配體包括但不限于包含以下的限定的序列區(qū)段和序列：核苷酸、核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、核苷酸類似物、修飾的核苷酸和包含主鏈修飾的核苷酸、分支點和非核苷酸殘基、基團或橋。本發(fā)明的適配體包括部分和完全單鏈和雙鏈核苷酸分子和序列、合成的RNA，DNA和嵌合核苷酸，雜交體，雙鏈體，異源雙鏈體和任何核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸或其嵌合對應物(counterpart)和/或相應互補序列，擴增、轉(zhuǎn)錄或復制全部或部分適配體分子或序列所需的啟動子或引物退火序列。適配體可以特異性結(jié)合可溶性、不溶性或固定化的選定分子(例如配體、受體和效應分子)?；蛘?，術(shù)語“適配體”包括能夠通過與特異性結(jié)合明顯不同的機制，形狀特異性識別化學平坦表面的核苷酸?？梢赃x擇本發(fā)明的適配體以特異性地識別包括化學平坦表面(例如硅芯片或碳納米結(jié)構(gòu))的結(jié)構(gòu)形狀或表面特征，而不是所選擇的靶分子(例如配體或受體)的化學特性。適配體可以是對自身的分子(molecule unto itself)或包含核苷酸分子或分子組的序列區(qū)段，例如包含合成雜聚物、多價雜聚物雜交結(jié)構(gòu)或適配體多分子裝置的適配體序列或限定的序列區(qū)段。

自組裝單層(SAM)

本發(fā)明中使用的EAM可以具有能夠在電極上形成自組裝單層的間隔物和錨定基團。本文中“單層”或“自組裝單層”或“SAM”或語法等價物是指在表面上自發(fā)化學吸附的分子的相對有序組裝，其中分子的取向彼此大致平行且大致垂直于表面。至少一部分(例如，每個)分子可以包括粘附到表面的官能團和與單層中的相鄰分子相互作用以形成相對有序陣列的部分?！盎旌系摹眴螌影痪鶆虻拈g隔物，即，其中至少兩種不同的分子構(gòu)成單層。如本文所概述，單層的使用可以減少生物分子與表面的非特異性結(jié)合的量，并且在核酸的情況下，由于寡核苷酸與電極的距離，可以增加寡核苷酸雜交的效率。因此，單層可以促進維持電極表面遠離靶酶。此外，單層可以用于保持電荷載體遠離電極的表面。因此，該層可以有助于防止電極和ReAM之間或者電極和溶劑中的帶電物質(zhì)之間的電接觸。這樣的接觸可導致直接的“短路”或通過可能存在于樣品中的帶電物質(zhì)的間接短路。因此，單層可以緊密地填充(pack)在電極表面上的均勻?qū)?uniform layer)中，使得存在最少的“孔”。因此，單層還可以用作阻擋溶劑接近電極的物理屏障。

在一些實施方案中，單層可以由除了非電活性稀釋劑分子之外的EAM分子的多種物質(zhì)或類型組成。

本文中“EAM的物質(zhì)”或“EAM的類型”或語法等價物是指具有特定結(jié)構(gòu)和E⁰的不同EAM?？梢源嬖谠摲肿拥脑S多復制，并且被認為是相同EAM物質(zhì)(例如EAM1)。

在一些實施方案中，能夠形成SAM的間隔物包括導電寡聚物。本文中“導電寡聚物”是指基本上導電的寡聚物(例如，基本上線性的導電寡聚物)，其一些實施方案在文獻中稱為“分子線”。本文中“基本上導電”是指能夠以100Hz轉(zhuǎn)移電子的寡聚物。一般而言，導電寡聚物在導電寡聚物的單體單元之間具有基本上重疊的π軌道，即共軛π軌道，盡管導電寡聚物也可以包含一個或多個σ鍵。另外，導電寡聚物可以通過其將電子注入或接收來自締合EAM的電子的能力而在功能上定義。此外，導電寡聚物比本文定義的絕緣體更導電。另外，本發(fā)明的導電寡聚物與電活性聚合物不同在于電活性聚合物本身可以貢獻或接受電子。

導電寡聚物的更詳細描述見于WO/1999/57317，其通過引用整體并入本文。特別地，發(fā)現(xiàn)如WO/1999/57317第14至21頁的結(jié)構(gòu)1至9中所示的導電寡聚物可用于本發(fā)明。在一些實施方案中，導電寡聚物具有以下結(jié)構(gòu)：

另外，單層中的至少一些導電寡聚物的末端可以是電子暴露的。本文中“電子暴露的”是指在將EAM放置成緊鄰末端時，并且在用適當?shù)男盘柶鹗己螅梢詸z測依賴于EAM存在的信號。導電寡聚物可以具有或不具有末端基團。因此，在一個實施方案中，沒有另外的末端基團，并且導電寡聚物以末端基團終止；例如，乙炔鍵?；蛘?，在一些實施方案中，加入末端基團，有時在本文中描述為“Q”。由于幾個原因，可以使用末端基團；例如，有助于導電寡聚物的電子可用性以檢測EAM，或者出于其他原因改變SAM的表面，例如防止非特異性結(jié)合。例如，在末端基團可以有帶負電荷的基團以形成帶負電荷的表面，使得當靶標是核酸(例如DNA或RNA)時，核酸被排斥或阻止其附在表面上，從而促進雜交。端基可以包括-NH、-OH、-COOH和烷基如-CH₃，和(聚)烷基氧化物如(聚)乙二醇。在一些實施方案中，端基可以是-OCH₂CH₂OH、-(OCH₂CH₂O)₂H、-(OCH₂CH₂O)₃H、或-(OCH₂CH₂O)₄H。

在一個實施方案中，可以使用具有不同類型之末端基團的導電寡聚物的混合物。因此，例如，一些末端基團可以有助于檢測，并且一些可以防止非特異性結(jié)合。

在一些實施方案中，電極還包含鈍化劑，例如以在電極表面上的單層形式。對于一些靶標，當結(jié)合配體與電極有一定距離時，靶標結(jié)合(例如雜交)的效率可以提高。此外，單層的存在可以減少與表面的非特異性結(jié)合(這可以通過使用本文概述的端基進一步促進)。鈍化劑層可以有助于維持結(jié)合配體和/或靶標遠離電極表面。此外，鈍化劑可以用于保持電荷載體遠離電極的表面。因此，該層可以有助于防止電極和電子轉(zhuǎn)移部分之間或者電極和溶劑內(nèi)的帶電物質(zhì)之間的電接觸。這樣的接觸可能導致直接的“短路”或通過可存在于樣品中的帶電物質(zhì)的間接短路。因此，單層鈍化劑可以緊密地填充在電極表面上的均勻?qū)又?，使得存在最少的“空穴”?；蛘撸g化劑可以不是單層的形式，而是可以存在以幫助填充導電寡聚物或其他特性。

因此，鈍化劑用作阻止溶劑接近電極的物理屏障。因此，鈍化劑自身實際上可以是(1)導電或(2)不導電的，例如絕緣的分子。因此，在一個實施方案中，鈍化劑是如本文所述的導電寡聚物，其具有或不具有封閉或減少電荷向電極轉(zhuǎn)移的末端基團。其它可以導電的鈍化劑包括--(CF₂)_n--、--(CHF)_n--和--(CFR)_n--的寡聚物。在一個實施方案中，鈍化劑是絕緣體部分。

在一些實施方案中，單層包含絕緣體。“絕緣體”是基本上不導電的寡聚物(例如，線性非導電寡聚物)。本文中“基本上不導電”是指通過絕緣體的電子轉(zhuǎn)移速率比通過導電寡聚物的電子轉(zhuǎn)移速率慢。換句話說，絕緣體的電阻高于導電寡聚物的電阻。然而應當注意，即使是通常認為是絕緣體的寡聚物，例如--(CH2)16分子，仍然可以傳輸電子，雖然以低速率傳輸。

在一些實施例中，絕緣體具有約10-7Ω^-1cm^-1或更低(例如，小于約10-8Ω^-1cm^-1)的電導率(S)。Gardner等，Sensors and Actuators A 51(1995)57-66，其通過引用并入本文。

一般而言，絕緣體是具有σ鍵的烷基或雜烷基寡聚物或部分，盡管任何特定的絕緣體分子可以含有芳族基團或一個或多個共軛鍵。本文中的“雜烷基”是指在鏈中包含的具有至少一個雜原子，即氮、氧、硫、磷、硅或硼的烷基。或者，絕緣體可以非常類似于添加了用于抑制或減緩(例如，基本上抑制或減緩)電子轉(zhuǎn)移的一個或多個雜原子或鍵的導電寡聚物。在一些實施方案中，烷基或雜烷基鏈長度為約4至約18個原子(例如，長度為約6至約16個原子)。

鈍化劑，包括絕緣體，可以被如本文定義的R基團取代，以改變電極上的部分或?qū)щ姽丫畚锏奶畛洹⒔^緣體的親水性或疏水性，以及柔性，例如絕緣體的旋轉(zhuǎn)、扭轉(zhuǎn)或縱向柔性。例如，可以使用支鏈烷基。此外，鈍化劑(包括絕緣體)的末端可以含有影響單層的暴露表面的另外的基團，有時在本文中稱為末端基團(terminal group，“TG”)。例如，可以進行帶電、中性或疏水基團的添加以抑制與樣品的非特異性結(jié)合，或影響靶標結(jié)合的動力學等。例如，在末端可以有帶電基團以形成帶電表面，從而促進或阻礙某些靶標的結(jié)合或者排斥或阻止其附在表面上。

鈍化劑的長度可以根據(jù)需要變化。一般，鈍化劑的長度類似于如上所述的導電寡聚物的長度。此外，導電寡聚物可以具有與鈍化劑基本上相同的長度或比它們更長，導致結(jié)合配體更容易接近溶劑。

單層可以包括單一類型的鈍化劑(包括絕緣體)或不同類型的鈍化劑。

合適的絕緣體是本領(lǐng)域已知的，并且包括但不限于--(CH₂)_n--、--(CRH)_n--和--(CR₂)_n--、乙二醇或使用其它雜原子(例如氮或硫)代替氧的衍生物(當電極是金時可以不使用硫衍生物)。絕緣體可以是具有用于連接到金的硫醇或二硫化物末端的--(CH²)_n--形式。此外，絕緣體的替代端可以以親水基團如寡聚乙二醇、-OH或-COOH終止。

在一些實施方案中，電極是金屬表面，并且不需要具有互連或進行電化學的能力。

錨定基團

本發(fā)明提供了包含錨定基團的化合物。本文中“錨定物”或“錨定基團”是指將本發(fā)明的化合物連接到電極上的化學基團。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，錨定基團的組成將根據(jù)其所連接的表面的組成而變化。在金電極的情況下，發(fā)現(xiàn)吡啶基錨定基團和基于硫醇的錨定基團二者特別有用。

取決于所使用的電極和導電寡聚物，導電寡聚物的共價連接可以以多種方式實現(xiàn)。一般而言，使用一些類型的接頭，如下面描述的結(jié)構(gòu)1中的“A”所示，其中X是導電寡聚物，畫陰影線的表面是電極：

結(jié)構(gòu)1

在該實施方案中，A是接頭或原子。“A”的選擇將部分地取決于電極的特性。因此，例如，當使用金電極時，A可以是硫部分?；蛘?，當使用金屬氧化物電極時，A可以與氧化物的氧上的硅(硅烷)部分連接(參見例如Chen等，Langmuir 10：3332-3337(1994)；Lenhard等，J.Electroanal.Chem.78：195-201(1977)，兩者均明確地通過引用并入本文)。當使用基于碳的電極時，A可以是氨基部分(例如伯胺；參見例如Deinhammer等，Langmuir 10：1306-1313(1994))。因此，A部分包括但不限于硅烷部分、硫部分(包括烷基硫部分)和氨基部分。

硫錨定基團

為了本發(fā)明的清楚，以實例描述硫錨定基團。盡管在結(jié)構(gòu)1中描述導電寡聚物為單個部分，但是導電寡聚物可以以多于一個“A”部分與電極連接；“A”部分可以相同或不同。因此，例如，當電極是金電極，并且“A”是硫原子或部分時，可以使用多個硫原子將導電寡聚物與電極連接，例如以下在結(jié)構(gòu)2、3和4中一般性地描述的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，可以做出其他這樣的結(jié)構(gòu)。在結(jié)構(gòu)2、3和4中，A部分僅僅是硫原子，但也可以使用取代的硫部分。

因此，例如，當電極是金電極，并且“A”是硫原子或部分時，例如以下結(jié)構(gòu)6中一般性地描述的，可以用多個硫原子將導電寡聚物與電極連接，例如以下在結(jié)構(gòu)2、3和4中一般性描述的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，可以做出其它這樣的結(jié)構(gòu)。在結(jié)構(gòu)2、3和4中，A部分僅僅是硫原子，但也可以使用取代的硫部分。

結(jié)構(gòu)2

結(jié)構(gòu)3

結(jié)構(gòu)4

還應注意，與結(jié)構(gòu)4類似，可以具有以單個碳原子終止的導電寡聚物，所述碳原子具有連接電極的三個硫部分。

錨定物可以從雙齒中間體(I)(其中R＝I的式III的化合物)合成，其描述于Li等，Org.Lett.4：3631-3634(2002)，通過引用并入本文。也參見Wei等，J.Org.Chem.69：1461-1469(2004)，通過引用并入本文。

硫原子的數(shù)目可以如本文所述變化，對于具體實施方案，每個間隔物利用一個、兩個和三個硫原子。

電極

本文中“電極”是指當連接到電子裝置時能夠感測電流或電荷并將其轉(zhuǎn)化為信號的組合物。電極是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于某些金屬及其氧化物，包括金；鉑；鈀；硅；鋁；包括氧化鉑、氧化鈦、氧化錫、氧化銦錫、氧化鈀、氧化硅、氧化鋁、氧化鉬(Mo₂O₆)、氧化鎢(WO₃)和氧化釕的金屬氧化物電極；以及碳(包括玻璃碳電極、石墨和碳糊)。在一些實施例中，電極可以包括金、硅、碳和金屬氧化物電極。在一些情況下，電極包括金。

本文所述的電極被描述為平坦表面，其僅是電極的可能形態(tài)之一并且僅用于示意性目的。電極的形態(tài)可以隨所使用的檢測方法而變化。例如，平坦的平面電極可以用于光學檢測方法，或者用于當制備核酸陣列時，因此需要對于合成和檢測二者可確定的位置?；蛘撸瑢τ趩翁结樂治?，電極可以是管的形式，其中系統(tǒng)的組件例如SAM、EAM和捕獲配體結(jié)合到內(nèi)表面。這可以允許包含核酸的最大表面積暴露于小體積的樣品。

本發(fā)明的電極一般并入生物芯片容器中，并且可以采取多種多樣的配置，并且可以包括工作電極和參考電極、互連(包括“通穿板(through board)”互連)和微流體組件。參見例如美國專利7,312,087，通過引用將其全部內(nèi)容并入本文。

生物芯片容器可以包括包含生物分子陣列的基底，并且可以以多種方式構(gòu)造。例如，芯片可以包括具有用于引入和移除試劑的入口端和出口端的反應室。此外，容器可以包括具有微流體組件的帽或蓋，使得可以引入樣品、添加試劑、完成反應，然后將樣品添加到包含用于檢測的陣列的反應室。

在一個實施方案中，檢測電極在基底上形成。另外，本文的討論一般涉及金電極的使用，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，也可以使用其他電極。如本文和引用的參考文獻中所概述的，基底可以包含多種材料。

一般，材料可以包括印刷電路板材料。電路板材料通常是包含涂覆有導電層并使用平板印刷(lithography)技術(shù)(特別是光刻(photolithography)技術(shù))處理以形成電極和互連(在本領(lǐng)域中有時稱為互連或引線)之圖案的絕緣基底的那些材料。絕緣基底通常是但不總是聚合物。如本領(lǐng)域中已知的，可以使用一個或多個層，以形成“二維”(例如，所有電極和互連在一個平面中)或“三維”(其中電極在一個表面上，并且互連器(interconnector)可以穿過板至另一側(cè)或者其中電極在多個表面上)板。三維系統(tǒng)經(jīng)常依賴于鉆孔或蝕刻的使用，隨后使用諸如銅的金屬進行電鍍，使得制成“通穿板”互連。電路板材料通常設置有已經(jīng)與基底連接的箔，例如銅箔，且根據(jù)需要(例如用于互連)，通過例如電鍍添加額外的銅。然后，銅表面可能需要例如通過蝕刻進行粗糙化，以允許粘附層的連接。

檢測

電子轉(zhuǎn)移一般以電子學方法啟動，例如使用電壓。施加電位的精確控制和變化可以通過恒電位儀與三電極系統(tǒng)(一個參比、一個樣品和一個對電極)或兩電極系統(tǒng)(一個樣品和一個對電極)進行。這允許將所施加的電位與系統(tǒng)的峰值電子轉(zhuǎn)移電位(peak electron transfer potential)匹配，其部分地取決于氧化還原活性分子的選擇并且部分取決于所使用的導電寡聚物。

固體支持物

可以使用包含電極的固體支持物來檢測靶標分析物。在一些實施方案中，也可以使用獨立于電極的第二固體支持物。本文中“固體支持物”或“基底”或其它語法等價物是指可以被修飾以含有適于連接或締合捕獲配體的離散單獨位點的任何物質(zhì)。合適的基底包括金屬表面，例如金、以下定義的電極、玻璃和經(jīng)修飾或功能化玻璃、玻璃纖維、聚四氟乙烯、陶瓷、云母、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯、苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚酰亞胺、聚碳酸酯、聚氨酯、Teflon^TM及其衍生物等)、GETEK(聚環(huán)氧丙烷和玻璃纖維的共混物)等、多糖、尼龍或硝化纖維素、樹脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、包括硅和經(jīng)修飾硅、碳、金屬、無機玻璃和各種其它聚合物。在一些實施方案中，使用印刷電路板(printed circuit board，PCB)材料。在一個實施方案中，固體支持物選自微顆粒、磁性微顆粒、珠和微通道。

檢測

氧化還原活性分子和電極之間的電子轉(zhuǎn)移可以以多種使用電子檢測的方式來檢測，其包括但不限于電流分析法、伏安法、電容和阻抗。這些方法可以包括基于AC或DC電流的時間或頻率依賴方法、脈沖方法、鎖定技術(shù)(lock in technique)和濾波(高通、低通、帶通)。在一些實施方案中，所需要的全部是電子轉(zhuǎn)移檢測；在其他情況下，可以確定電子轉(zhuǎn)移的速率。

在一些實施方案中，使用電子檢測，包括電流分析法、伏安法、電容和阻抗。合適的技術(shù)包括但不限于電重量法；庫侖法(包括受控電位庫侖法和恒定電流庫侖法)；伏安法(循環(huán)伏安法、脈沖伏安法(正常脈沖伏安法、方波伏安法、差分脈沖伏安法、Osteryoung方波伏安法和恒電量脈沖技術(shù)(coulostatic pulse technique))；剝離分析(陽極剝離分析(aniodic stripping analysis)、陰極剝離分析、方波剝離伏安法)；電導率測量(電解電導、直接分析)；時間依賴性電化學分析(計時電流法、計時電位法、循環(huán)計時電位法和電流分析法、AC計量術(shù)(AC polography)、計時電流測定法(chronogalvametry)和計時庫侖法)；AC阻抗測量；電容測量；AC伏安法和光電化學。

在一些實施方案中，監(jiān)測電子轉(zhuǎn)移是通過測量電流的檢測。這種檢測方法涉及在含有本發(fā)明組合物的電極和測試樣品中的輔助(對)電極之間施加電位(與單獨的參比電極相比)。在存在或不存在靶標的情況下，在樣品中會誘導不同效率的電子轉(zhuǎn)移。

用于測量電子轉(zhuǎn)移的裝置在測量電流方面涉及靈敏電流檢測，并且包括控制電壓電位的裝置，通常是但不限于恒電位儀。該電壓可以參照氧化還原活性分子的電位進行優(yōu)化。

在一些實施方案中，利用了替代的電子檢測模式。例如，測量電位(或測量伏安(voltammetric))的測量涉及非法拉第(沒有凈電流)過程，并且傳統(tǒng)上用于pH和其他離子檢測器。類似的傳感器可以用于監(jiān)測氧化還原活性分子和電極之間的電子轉(zhuǎn)移。此外，絕緣體(例如電阻)和導體的其他性質(zhì)(例如導電性，阻抗和電容)可以用于監(jiān)測氧化還原活性分子和電極之間的電子轉(zhuǎn)移。最后，產(chǎn)生電流(例如電子轉(zhuǎn)移)的任何系統(tǒng)也產(chǎn)生小磁場，在一些實施例中可以監(jiān)測該小磁場。

在一些實施方案中，使用直流(DC)技術(shù)起始和檢測電子轉(zhuǎn)移。如上所述，在結(jié)合之前和之后氧化還原活性分子的E⁰曲線的改變可以允許靶標的檢測。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，許多合適的方法可以用于檢測電子轉(zhuǎn)移。

在一些實施方案中，使用交流(AC)方法起始電子轉(zhuǎn)移。例如通過至少樣品電極(含有本發(fā)明的復合物)和對電極，將第一輸入電信號施加到系統(tǒng)，以引發(fā)電極和第二電子轉(zhuǎn)移部分之間的電子轉(zhuǎn)移。也可以使用三個電極系統(tǒng)，其中將電壓施加到參考電極和工作電極。在該實施方案中，第一輸入信號至少包含AC分量(component)。AC分量可以是可變的幅度和頻率。一般來說，為了在本方法的一些實施方案中使用，AC振幅的范圍為約1mV至約1.1V(例如，約10mV至約800mV，約10mV至約500mV)。AC頻率可以在約0.01Hz至約10MHz(例如，約1Hz至約1MHz，約1Hz至約100kHz)的范圍內(nèi)。

在一些實施方案中，第一輸入信號包含DC分量和AC分量。也就是說，樣品電極和對電極之間的DC偏移電壓掃描過第二電子轉(zhuǎn)移部分的電化學電位。該掃描用于識別看到系統(tǒng)的最大響應時的DC電壓。這一般處于或約為氧化還原活性分子的電化學電位。一旦確定了該電壓，就可以使用掃描或一個或更多個均勻的DC偏移電壓。DC偏移電壓可以為約1V至約+1.1V(例如，從約500mV至約+800mV，從約300mV至約500mV)。在DC偏移電壓之上，施加可變幅度和頻率的AC信號分量。如果氧化還原活性分子具有足夠低的溶劑重組能量以響應AC擾動，則由于電極和氧化還原活性分子之間的電子轉(zhuǎn)移，將產(chǎn)生AC電流。

在一些實施方案中，AC振幅是變化的。不受理論束縛，似乎提高振幅提高了驅(qū)動力。因此，導致更高超電位的更高振幅可以給出更快的電子轉(zhuǎn)移速率。因此，一般而言，相同的系統(tǒng)通過使用在該頻率下的更高的過電位(overpotential)在任何單個頻率下會給出改進的響應(即，更高的輸出信號)。因此，可以在高頻處增加振幅以增加通過系統(tǒng)的電子傳輸速率，從而產(chǎn)生更強的靈敏度。

在一些實施方案中，系統(tǒng)的測量采用至少兩個單獨的振幅或過電位。在一些情況下，使用多個振幅的檢測。如上所述，作為振幅改變的結(jié)果的響應改變可以形成系統(tǒng)的識別、校準和量化的基礎(chǔ)。

在一些實施方案中，AC頻率是變化的。在不同的頻率下，不同的分子可以以不同的方式響應。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，提高頻率一般提高輸出電流。然而，當頻率大于電子可在電極和氧化還原活性分子之間傳播的速率時，較高的頻率可導致輸出信號的損失或減少。在某些點，頻率可以大于通過甚至溶劑抑制的氧化還原活性分子的電子轉(zhuǎn)移速率，之后輸出信號也可下降。

另外，AC技術(shù)的使用可以允許顯著減少由于除共價連接的EAM之外的部分而存在于任何單個頻率處的背景信號，即“整步(locking out)”或“過濾”不需要的信號。也就是說，電荷載體或氧化還原活性分子在溶液中的頻率響應可以由其擴散系數(shù)限制。因此，在高頻下，電荷載體可能無法足夠快地擴散以將其電荷轉(zhuǎn)移到電極，和/或電荷轉(zhuǎn)移動力學可能不夠快。這在不使用鈍化層單層或具有部分或不足的單層，即其中電極可接近溶劑的實施方案中是重要的。然而，使用本發(fā)明的AC技術(shù)，可以選擇防止溶液中的一種或多種電荷載體之頻率響應的一個或多個頻率，無論是否存在單層。這是重要的，因為許多生物流體例如血液包含可以干擾測量電流的檢測方法的顯著量的氧化還原活性分子。

在一些實施例中，系統(tǒng)的測量采用至少兩個單獨的頻率。在一些情況下，在多個頻率進行測量。多個頻率包括掃描。在一個實施方案中，頻率響應確定在至少兩個頻率(例如，至少約五個，至少約十個頻率)測定。

信號處理

在發(fā)送輸入信號以啟動電子轉(zhuǎn)移之后，接收或檢測輸出信號。輸出信號的存在和振幅可以取決于輸入信號的過電位/振幅；輸入AC信號的頻率；電活性部分的結(jié)構(gòu)；中間介質(zhì)的組成，即電子轉(zhuǎn)移部分之間的阻抗；DC偏移；系統(tǒng)的環(huán)境；和溶劑。在給定的輸入信號下，輸出信號的存在和強度一般可取決于金屬離子的氧化態(tài)的改變。因此，在傳輸包括AC分量和DC偏移的輸入信號時，電子可以在電極和氧化還原活性分子之間轉(zhuǎn)移，當溶劑重組能量足夠低，頻率在范圍內(nèi)，并且振幅足夠時，導致輸出信號。

在一些實施方案中，輸出信號包括AC電流。如上所述，輸出電流的幅度可以取決于多個參數(shù)。通過改變這些參數(shù)，可以以多種方式優(yōu)化系統(tǒng)。

一般，在本發(fā)明中產(chǎn)生的AC電流的范圍從約1飛安(femptoamp)到約1毫安(例如，從約50飛安到約100微安，從約1皮安(picoamp)到約1微安)。

裝置

本發(fā)明還提供了使用AC檢測方法檢測分析物的裝置。該裝置可以包括具有至少第一測量電極或樣品電極以及第二測量電極或?qū)﹄姌O的測試室。三個電極系統(tǒng)也是有用的。第一和第二測量電極可以與測試樣品接收區(qū)域接觸，使得在液體測試樣品的存在下，兩個電極可以電接觸。

在另一個實施方案中，第一測量電極包含通過間隔物(例如，通過導電寡聚物)共價連接的氧化還原活性復合物，例如本文所述的那些?；蛘?，第一測量電極可包含共價連接的氧化還原活性分子和結(jié)合配體。

該裝置還可以包括電連接到測試室的電壓源；即，連接到測量電極。在一些實施方案中，如果需要，電壓源能夠傳遞AC和DC電壓。

在一個實施方案中，該裝置還包含能夠比較輸入信號和輸出信號的處理器。處理器可以耦合到電極并且被配置為接收輸出信號，并且從而檢測靶標的存在狀況。

樣品

靶標通常存在于樣品中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，樣品溶液可以包括任何數(shù)量的物質(zhì)，包括但不限于幾乎任何生物體例如哺乳動物(例如人)的體液(包括但不限于血液、尿液、血清、淋巴、唾液、肛門和陰道分泌物、汗液和精液)；環(huán)境樣品(包括但不限于空氣、農(nóng)業(yè)、水和土壤樣品)；植物材料；生物武器試劑樣品；研究樣品，純化樣品，原始樣品等；如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，幾乎可以對樣品進行任何實驗操作。一些實施方案利用來自儲存(例如冷凍和/或存檔)或新鮮組織的目標樣本。石蠟包埋的樣品在許多實施方案中特別有用，由于存在與樣品相關(guān)的另外的數(shù)據(jù)，例如診斷和預后，因而這些樣品可非常有用。如本文所述的固定和石蠟包埋的組織樣品指可儲存或存檔的組織樣品。許多患者來源的病理樣品經(jīng)過常規(guī)固定和石蠟包埋，以允許組織學分析和隨后的檔案存儲。

實施例

實施例1.為了證明概念驗證，將具有生物素作為捕獲配體(BP65-99，結(jié)合EAM)的不同濃度(0至100μM)的EAM1與50μM EAM2(BP65-77，不含捕獲配體的標準EAM)混合，以在PBS中形成一系列EAM混合物。2分鐘后，將40μl的每種所述EAM混合物系列添加到芯片(具有多個有效孔(virtual well)和每個孔底部的金電極)，并使EAM形成SAM 5分鐘。用測試緩沖液(200mM LiClO₄)清洗芯片兩次。添加150μl測試緩沖液后，將芯片插入CHI650C系統(tǒng)(自制的電化學檢測系統(tǒng))。測量并繪制電壓范圍內(nèi)的電流(顯示在圖4的左側(cè)圖表中)。在該圖表中，EAM1的CVPP顯示在左側(cè)，隨著濃度的降低而降低；EAM2的CVPP顯示在右側(cè)，并且由于SAM中EAM1的數(shù)量減少而提高。該改變是可量化的，如圖4中的直方圖所示。

實施例2.為了證明生物電子結(jié)合測定的效用，進行了含有靶標(鏈霉親和素)和非靶標(BSA)的模擬樣品的實驗，并在本文中描述。首先，制備鏈霉親和素和BSA的稀釋液，二者濃度為0.3、0.1、0.05、0.01和0ug/ul。第二，將EAM1(PB65-99，具有作為捕獲配體之生物素的結(jié)合EAM)和EAM2(PB65-77，不含捕獲配體的標準EAM)等比例混合(每種50uM)以形成溶液相EAM混合物。第三，將40μl含有相同量的鏈霉親和素和BSA的所述模擬樣品添加到17.15μl溶液相EAM混合物中，形成測定混合物，并使其孵育2分鐘。第四，將40μl每種測定混合物添加到芯片(包含多個有效孔的芯片，在每個孔的底部具有金電極)，并使EAM形成SAM 5分鐘。第五，用測試緩沖液(200mM LiClO₄)清洗芯片兩次。加入150μl測試緩沖液后，將芯片插入CHI650C系統(tǒng)(自制的電化學檢測系統(tǒng))。測量EAM1和EAM2的CVPP并計算峰百分比。如圖6所示，鏈霉親和素的信號隨其濃度降低而降低，而BSA的信號保持恒定(無論其濃度如何)，表明CVPP中觀察到的改變是由鏈霉親和素與所包含的作為EAM1之結(jié)合配體的生物素的特異性結(jié)合引起的。換言之，鏈霉親和素與EAM1上的生物素結(jié)合配體的結(jié)合從空間上阻礙EAM1形成SAM，導致SAM中的EAM1更少而EAM2更多。該改變是可量化的。