本發(fā)明涉及分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種同步檢測(cè)綠茶中羧甲基賴(lài)氨酸和羧乙基賴(lài)氨酸的方法。

背景技術(shù)：

我國(guó)茶園面積、茶葉產(chǎn)量位居世界第一，是茶業(yè)大國(guó)。茶葉種類(lèi)多，內(nèi)質(zhì)成分豐富，加工工序多樣，制茶過(guò)程中內(nèi)質(zhì)成分會(huì)發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)變化，易產(chǎn)生晚期糖基化末端產(chǎn)物(Advanced Glycation End Products，AGEs)等潛在危害物，茶葉加工過(guò)程安全已成為茶葉質(zhì)量安全領(lǐng)域關(guān)注的新焦點(diǎn)。AGEs是美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物之一，是一類(lèi)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物，具有不可逆性、交聯(lián)性、不易被降解、結(jié)構(gòu)異質(zhì)性、酶穩(wěn)定等特性。目前鑒定出的主要產(chǎn)物有羧甲基賴(lài)氨酸(N-(carboxymethyl)lysine，CML)、羧乙基賴(lài)氨酸(N-(carboxyethyl)lysine，CEL)等20多種，其中，CML和CEL是常見(jiàn)的兩種，被認(rèn)為與糖尿病、腎病、衰老等的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。目前已有報(bào)道采用LC-MS/MS分析方法測(cè)定食品基質(zhì)中的CML和CEL，該法預(yù)處理相對(duì)簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性好，但不同原料基質(zhì)會(huì)影響方法的適用性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決目前檢測(cè)CML和CEL方法中存在不同原料基質(zhì)會(huì)影響檢測(cè)方法的問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種同步檢測(cè)綠茶中羧甲基賴(lài)氨酸和羧乙基賴(lài)氨酸的方法，本發(fā)明的檢測(cè)方法準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性較好，適于綠茶中CML和CEL的實(shí)際檢測(cè)。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種同步檢測(cè)綠茶中羧甲基賴(lài)氨酸和羧乙基賴(lài)氨酸的方法，所述的檢測(cè)方法為：

(1)對(duì)茶葉粉末樣品脫脂處理，然后將樣品吹干后依次加入硼酸鈉緩沖液和硼氫化鈉溶液，在0-6℃還原2-10h，優(yōu)選為8h，再加入氯仿和甲醇混合液，離心后向得到的沉淀物中加入酸溶液，水解反應(yīng)，完成后將水解樣品進(jìn)行定容、過(guò)濾并收集濾液；

所述的脫脂處理步驟為：將茶葉粉末樣品中加入正己烷振蕩后離心，棄去溶劑，重復(fù)若干次，其中離心速率為5000-12000rpm，離心時(shí)間為4-10min。正己烷的作用為溶劑，使用量為使茶葉全部浸在溶劑中的量。

所述的硼酸鈉緩沖液濃度為0.1-0.3mol/L，硼氫化鈉濃度為0.8-1.2mol/L，pH調(diào)節(jié)為8.5-10.0，所述的茶葉粉末樣品、硼酸鈉緩沖液和硼氫化鈉溶液的重量體積比為1g∶8-12mL∶4-6mL。

作為優(yōu)選，氯仿和甲醇混合液中氯仿與甲醇的體積比為1-3∶1。

作為優(yōu)選，水解反應(yīng)中酸溶液選自濃度為4-8mol/L的HCl溶液，更優(yōu)選為6mol/L的HCl溶液；水解反應(yīng)條件為在100-120℃下反應(yīng)12-30h，更優(yōu)選為在110℃下反應(yīng)24h。

(2)取濾液，定量加入同位素標(biāo)記羧甲基賴(lài)氨酸和同位素標(biāo)記羧乙基賴(lài)氨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到預(yù)處理樣品；

所述的濾液中同位素標(biāo)記羧甲基賴(lài)氨酸的添加濃度為10-200ng/mL，同位素標(biāo)記羧乙基賴(lài)氨酸的添加濃度為10-200ng/mL。作為優(yōu)選，所述的濾液中同位素標(biāo)記羧甲基賴(lài)氨酸的添加濃度為40-100ng/mL，同位素標(biāo)記羧乙基賴(lài)氨酸的添加濃度為40-100ng/mL。

(3)凈化：采用固相萃取柱對(duì)預(yù)處理樣品進(jìn)行凈化處理，得到待測(cè)樣品；

所述的凈化方法為：對(duì)固相萃取柱進(jìn)行預(yù)處理后，將步驟(2)得到的預(yù)處理樣品進(jìn)行上樣，然后依次用濃度為0.08-0.15mol/L的鹽酸溶液和超純水淋洗進(jìn)行上樣吸附，再用體積濃度為4-6％的氨水-甲醇溶液淋洗進(jìn)行樣品洗脫，收集洗脫液，吹干，超純水復(fù)溶，得到待測(cè)液；所述的鹽酸溶液、超純水、氨水的體積比為1∶0.5～2∶0.5～2。

所述上樣、上樣吸附、洗脫時(shí)的流速可以為0.3-0.8mL/min，優(yōu)選0.5mL/min。采用0.5-1.5mL純水復(fù)溶，過(guò)0.22μm的濾膜，-20℃保存，待檢。

作為優(yōu)選，所述固相萃取柱的預(yù)處理方法可以為：依次采用2-4mL甲醇和2-4mL濃度為0.08-0.15mol/L的鹽酸溶液對(duì)固相萃取柱進(jìn)行淋洗，流速0.5-1.5mL/min。

(4)采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算羧甲基賴(lài)氨酸和羧乙基賴(lài)氨酸的含量。

高效液相色譜測(cè)定條件為：流動(dòng)相A包括體積百分比濃度為0.1％甲酸溶液與體積百分比濃度為99.9％濃度為8-12mmol/L的乙酸銨，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序，流速0.2mL/min，進(jìn)樣量10μL，柱溫38-42℃，所述的梯度洗脫 程序?yàn)椋?/p>

質(zhì)譜條件為：

離子化方式為ESI離子源；掃描方式為正電離；檢測(cè)方式為多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)，碰撞能量為20eV；

離子源條件：干燥氣溫度：325C；干燥氣流速：5L/min；霧化氣壓力：45psi；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：11L/min；毛細(xì)管電壓：3000V，其中：

本發(fā)明針對(duì)綠茶基質(zhì)特性，優(yōu)化樣品前處理方法，以d₄-CML和d₄-CEL為內(nèi)標(biāo)，采用多選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，通過(guò)方法學(xué)論證，構(gòu)建了同步測(cè)定綠茶中CML和CEL的定量分析方法，為茶葉中AGEs的監(jiān)測(cè)和控制提供基礎(chǔ)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：檢測(cè)方法準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性較好，適于綠茶中CML和CEL的實(shí)際檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例CML標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖2為實(shí)施例CEL標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖3為實(shí)施例混標(biāo)中CML、d₄-CML、CEL和d₄-CEL的MRM質(zhì)譜圖；

圖4為實(shí)施例綠茶樣品中CML、d₄-CML、CEL和d₄-CEL的MRM質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方法

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，實(shí)施例中所用原料均可市購(gòu)或用常規(guī)方法制備。

實(shí)施例中CML標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98％)和d₄-CML同位素內(nèi)標(biāo)(純度99％)，CEL標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98.6％)和d₄-CEL同位素內(nèi)標(biāo)(純度98.6％)；

所用儀器為：Agilent 6460 Triple Quad LC-MS(三重串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀)，Agilent Zorbax SBC₁₈柱(150mm×2.1mm，3.5μm)；SPE固相萃取柱Cleanert PCX(60mg，3mL，天津博納艾杰爾有限公司)；粉碎機(jī)、電子天平、高速冷凍離心機(jī)、烘箱等均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器或設(shè)備。

實(shí)施例1

(1)提取：稱(chēng)取50mg茶葉粉末樣品置于10mL離心管中，加入2mL正己烷，劇烈振蕩3min后，于10000rpm離心5min，棄去溶劑，重復(fù)以上步驟2次。經(jīng)正己烷脫脂后，將樣品利用氮?dú)獯蹈芍粱謴?fù)粉末狀。向樣品中加入1mL Na₂B₄O₇緩沖液(0.2mol/L)和0.5mL NaBH₄(1mol/L，以0.1mol/LNaOH配制)，調(diào)節(jié)pH＝9.2，于4℃還原過(guò)夜(約8h)。接著，加入1mL氯仿/甲醇(2∶1，v/v)，于10000rpm離心10min后，棄去上清液；向得到的沉淀物中加入5mL HCI(6mol/L)，置于110℃烘箱中，水解12h。水解完成后，將水解樣品取出并冷卻至室溫(25℃)，用超純水定容至10mL，然后用定性濾紙過(guò)濾并收集濾液。

(2)準(zhǔn)確量取0.4mL濾液，加入0.4μg/mL d₄-CML和0.4μg/mL d₄-CEL內(nèi)標(biāo)各100μL。

(3)凈化：SPE柱預(yù)處理：3mL甲醇，3mL 0.1M的HCl，流速為1mL/min；上樣吸附：用3mL 0.1M的HCl，3mL超純水淋洗，流速為0.5mL/min；樣品洗脫：3mL 5％的氨水-甲醇(v/v)溶液，流速為0.5mL/min，收集濾液；吹干：40℃的N₂吹干；復(fù)溶待檢：采用1mL超純水復(fù)溶，過(guò)0.22μm的濾膜，-20℃保存，待檢。

(4)色譜條件：流動(dòng)相A為0.1％甲酸溶液(含有濃度10mmol/L的乙酸銨)，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。流速0.2mL/min，進(jìn)樣量10μL，柱溫40℃。

質(zhì)譜條件：離子化方式：ESI離子源；掃描方式：正電離；掃描離子對(duì)：CML(m/z 205-84.2)，d₄-CML(m/z 209.26-88.1)，CEL(m/z 219.11-84.2)，d₄-CEL(m/z 223.28-88.1)。檢測(cè)方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，碰撞能量：20eV，碰撞誘導(dǎo)解離電壓：CML為70V，d₄-CML為83V，CEL為158V，d₄-CEL為78V。離子源條件：干燥氣溫度：325C；干燥氣流速：5L/min；霧化氣壓力：45psi；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：11L/min；毛細(xì)管電壓：3000V。

利用Mass hunter液質(zhì)工作站軟件(Agilent公司，美國(guó))采集相關(guān)數(shù)據(jù)。

表1梯度洗脫程序

將CML標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成濃度為1mg/mL，d₄-CML標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成濃度為0.05mg/mL，CEL標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成濃度為1mg/mL，d₄-CEL標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成濃度為0.1mg/mL，于-20℃冰箱保存作為儲(chǔ)備溶液。分別配制濃度為10、50、100、200和300ng/mL的CML和CEL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，d₄-CML和d₄-CEL為內(nèi)標(biāo)，濃度為40ng/mL。以標(biāo)樣濃度/內(nèi)標(biāo)濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)樣峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求曲線線性回歸方程，由此計(jì)算樣品中CML和CEL的含量。

實(shí)施例2

(1)提?。悍Q(chēng)取50mg茶葉粉末(同實(shí)施例1)樣品置于10mL離心管中，加入2mL正己烷，劇烈振蕩3min后，于5000rpm離心10min，棄去溶劑，重復(fù)以上步驟3次。經(jīng)正己烷脫脂后，將樣品利用氮?dú)獯蹈芍粱謴?fù)粉末狀。向樣品中加入1mL Na₂B₄O₇緩沖液(0.1mol/L)和0.5mL NaBH₄(0.8mol/L，以0.1mol/LNaOH配制)，調(diào)節(jié)pH＝8.5，于4℃還原10h。接著，加入1mL氯仿/甲醇(1∶1，v/v)，于5000rpm離心10min后，棄去上清液；向得到的沉淀物中加入5mL HCI(4mol/L)，置于100℃烘箱中，水解30h。水解完成后，將水解樣品取出并冷卻至室溫(25℃)，用超純水定容至10mL，然后用定性濾紙過(guò)濾并收集濾液。

(2)準(zhǔn)確量取0.4mL濾液，加入0.4μg/mL d₄-CML和0.4μg/mL d₄-CEL內(nèi)標(biāo)各200μL。

(3)凈化：SPE柱預(yù)處理：3mL甲醇，2mL 0.1M的HCl，流速為1mL/min；上樣吸附：用3mL 0.1M的HCl，3mL超純水淋洗，流速為0.5mL/min；樣品洗脫：3mL 5％的氨水-甲醇(v/v)溶液，流速為0.5mL/min，收集濾液；吹干：40℃的N₂吹干；復(fù)溶待檢：采用1mL超純水復(fù)溶，過(guò)0.22μm的濾膜，-20℃保存，待檢。

(4)色譜條件：流動(dòng)相A為0.1％甲酸溶液(含有濃度10mmol/L的乙酸銨)，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。流速0.2mL/min，進(jìn)樣量10μL，柱溫40℃。

質(zhì)譜條件：離子化方式：ESI離子源；掃描方式：正電離；掃描離子對(duì)：CML(m/z 205-84.2)，d₄-CML(m/z 209.26-88.1)，CEL(m/z 219.11-84.2)，d₄-CEL(m/z 223.28-88.1)。檢測(cè)方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，碰撞能量：20eV，碰撞誘導(dǎo)解離電壓：CML為70V，d₄-CML為83V，CEL為158V，d₄-CEL為78V。離子源條件：干燥氣溫度：325℃；干燥氣流速：5L/min；霧化氣壓力：45psi；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：11L/min；毛細(xì)管電壓：3000V。

利用Mass hunter液質(zhì)工作站軟件(Agilent公司，美國(guó))采集相關(guān)數(shù)據(jù)。

表2梯度洗脫程序

將CML標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成濃度為1mg/mL，d₄-CML標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成濃度為0.05mg/mL，CEL標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成濃度為1mg/mL，d₄-CEL標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成濃度為0.1mg/mL，于-20℃冰箱保存作為儲(chǔ)備溶液。分別配制濃度為10、50、100、200和300ng/mL的CML和CEL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，d₄-CML和d₄-CEL為內(nèi)標(biāo)，濃度為40ng/mL。以標(biāo)樣濃度/內(nèi)標(biāo)濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)樣峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求曲線線性回歸方程，由此計(jì)算樣品中CML和CEL的含量。

實(shí)施例3

(1)提?。悍Q(chēng)取50mg茶葉粉末(同實(shí)施例1)樣品置于10mL離心管中，加入2mL正己烷，劇烈振蕩3min后，于12000rpm離心4min，棄去溶劑，重復(fù)以上步驟2次。經(jīng)正己烷脫脂后，將樣品利用氮?dú)獯蹈芍粱謴?fù)粉末狀。向樣品中加入1mL Na₂B₄O₇緩沖液(0.3mol/L)和0.5mL NaBH₄(1.2mol/L，以0.1mol/LNaOH配制)，調(diào)節(jié)pH＝10，于6℃還原2h。接著，加入1mL氯仿/甲醇(3∶1，v/v)，于12000rpm離心4min后，棄去上清液；向得到的沉淀物中加入5mL HCI(8mol/L)，置于120℃烘箱中，水解12h。水解完成后，將水解樣品取出并冷卻至室溫(25℃)，用超純水定容至10mL，然后用定性濾紙過(guò)濾并收集濾液。

(2)準(zhǔn)確量取0.4mL濾液，加入0.4μg/mL d₄-CML和0.4μg/mL d₄-CEL內(nèi)標(biāo)各10μL。

(3)凈化：SPE柱預(yù)處理：3mL甲醇，5mL 0.1M的HCl，流速為1mL/min；上樣吸附：用3mL 0.1M的HCl，3mL超純水淋洗，流速為0.5mL/min；樣品洗脫：3mL 5％的氨水-甲醇(v/v)溶液，流速為0.5mL/min，收集濾液；吹干：40℃的N₂吹干；復(fù)溶待檢：采用1mL超純水復(fù)溶，過(guò)0.22μm的濾膜，-20℃保存，待檢。

(4)色譜條件：流動(dòng)相A為0.1％甲酸溶液(含有濃度10mmol/L的乙酸銨)，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。流速0.2mL/min，進(jìn)樣量10μL，柱溫40℃。

質(zhì)譜條件：離子化方式：ESI離子源；掃描方式：正電離；掃描離子對(duì)：CML(m/z 205-84.2)，d₄-CML(m/z 209.26-88.1)，CEL(m/z 219.11-84.2)，d₄-CEL(m/z 223.28-88.1)。檢測(cè)方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，碰撞能量：20eV，碰撞誘導(dǎo)解離電壓：CML為70V，d₄-CML為83V，CEL為158V，d₄-CEL為78V。離子源條件：干燥氣溫度：325℃；干燥氣流速：5L/min；霧化氣壓力：45psi；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：11L/min；毛細(xì)管電壓：3000V。

利用Mass hunter液質(zhì)工作站軟件(Agilent公司，美國(guó))采集相關(guān)數(shù)據(jù)。

表3梯度洗脫程序

將CML標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成濃度為1mg/mL，d₄-CML標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成濃度為0.05mg/mL，CEL標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成濃度為1mg/mL，d₄-CEL標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成濃度為0.1mg/mL，于-20℃冰箱保存作為儲(chǔ)備溶液。分別配制濃度為10、50、100、200和300ng/mL的CML和CEL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，d₄-CML和d₄-CEL為內(nèi)標(biāo)，濃度為40ng/mL。以標(biāo)樣濃度/內(nèi)標(biāo)濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)樣峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求曲線線性回歸方程，由此計(jì)算樣品中CML和CEL的含量。

實(shí)施例1～3結(jié)果見(jiàn)表4和圖1、圖2所示，CML標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝1.0911x+0.2838，R²＝0.9990，CEL標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.2056x+0.0149，R²＝0.9992，CML和CEL的線性范圍為10-300ng/mL，相關(guān)系數(shù)R²均在0.999以上，線性關(guān)系良好。

表4 HPLC-MS/MS方法檢測(cè)CML和CEL的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、LOD和LOQ

混標(biāo)及綠茶樣品的MRM質(zhì)譜圖如圖3、圖4所示，由圖可知，混標(biāo)和樣品中標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間均在1.84-1.88min之間，保留時(shí)間較一致。根據(jù)CML和CEL低含量樣品色譜圖，通過(guò)外推法推算得出CML和CEL的LOD值約為2ng/mL、LOQ值大約為10ng/mL。

測(cè)試?yán)?：加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

向綠茶樣品中加入CML、CEL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別設(shè)置低、中、高三個(gè)加標(biāo)量，CML設(shè)為50、100、200ng/mL，CEL設(shè)為20、50、100ng/mL，采用HPLC-MS/MS法測(cè)定加標(biāo)前后樣品中CML、CEL含量，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。由表可知，不同加標(biāo)水平下其加標(biāo)回收率不同。對(duì)于CML，加標(biāo)回收率在79.07-88.29％之間；對(duì)于CEL，加標(biāo)回收率在76.40-85.18％之間。

表5 HPLC-MS/MS方法檢測(cè)綠茶中CML和CEL的加標(biāo)回收率

測(cè)試?yán)?：精密度

綠茶樣品由于基質(zhì)復(fù)雜，CML和CEL含量較低，HPLC-MS/MS法檢測(cè)CML和CEL的精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。從表中可以看出，CML的日內(nèi)RSD和日間RSD在5.0-7.0％之間，CEL的日內(nèi)RSD和日間RSD在5.0-9.0％之間，均在10％以內(nèi)，符合精密度要求。

表6 HPLC-MS/MS方法檢測(cè)綠茶中CML和CEL的精密度

應(yīng)用例

使用本方法對(duì)浙江和云南兩個(gè)產(chǎn)茶區(qū)的四種綠茶樣品中CML和CEL含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表7。可見(jiàn)，四種樣品中CML和CEL均有檢出，幾乎所有樣品中CML含量均高于CEL含量，CML平均含量達(dá)到207.01ng/g，CEL平均含量達(dá)到49.40ng/g，為茶葉加工過(guò)程潛在危害物控制提供依據(jù)。

表7幾種綠茶樣品中CML和CEL的含量

本發(fā)明構(gòu)建了基于HPLC-MS/MS同步檢測(cè)綠茶中CML和CEL的方法，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明：CML和CEL在10-300ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R²在0.999以上，LOD和LQD值分別為2ng/mL、10ng/mL；三個(gè)加標(biāo)濃度下，加標(biāo)回收率在76-89％之間；日內(nèi)RSD和日間RSD均在10％以內(nèi)，表明該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性較好，適于綠茶中CML和CEL實(shí)際檢測(cè)。