本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體地公開了一種呼吸道腺病毒IgA抗體檢測(cè)試紙條及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

腺病毒(adenovirus)顆粒直徑60～90nm，沒(méi)有囊膜，20面體立體對(duì)稱，衣殼由252個(gè)克微粒組成，其中240個(gè)殼微粒是六鄰體(Hexon)，具有組特異性α抗原。腺病毒有6個(gè)種屬52種不同血清型，其中約有1/3能引起如急性呼吸道感染、流行性角膜炎、急性出血性結(jié)膜炎、咽結(jié)膜炎、急性咽炎、膀胱炎、嬰幼兒致死性肺炎等疾病。在我國(guó)，5歲以下兒童急性呼吸道疾病中約有5％是由腺病毒引起的，其中腺病毒引起的肺炎易導(dǎo)致嚴(yán)重的病癥，腺病毒肺炎不僅可以引起心力衰竭、呼吸衰竭，還可以引起肺外受累，如腦炎、肝損害、心肌炎或心肌損害等，甚至導(dǎo)致死亡。腺病毒流行范圍廣，傳播速度快，近年來(lái)在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)爆發(fā)和流行，給人們的公共衛(wèi)生安全帶來(lái)了極大的威脅。在我國(guó)，3型和7型腺病毒是引起嚴(yán)重呼吸道感染的主要的兩種腺病毒。目前尚無(wú)有效的疫苗進(jìn)行預(yù)防，只能通過(guò)臨床早期診斷，對(duì)癥治療降低呼吸道腺病毒的危害。

呼吸道腺病毒的早期診斷方法較多，主要有組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、血清學(xué)、分子生物學(xué)三個(gè)領(lǐng)域技術(shù)。傳統(tǒng)方法比較常用的包括細(xì)胞分離培養(yǎng)、血清IgM抗體ELISA檢測(cè)、血清IgM抗體免疫熒光檢測(cè)、PCR核酸檢測(cè)。細(xì)胞分離培養(yǎng)是呼吸道腺病毒感染確定的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但是由于時(shí)間長(zhǎng)(超過(guò)5天)、實(shí)驗(yàn)條件要求高、操作人員技術(shù)要求高等缺點(diǎn)限制了其在臨床診斷應(yīng)用，目前該技術(shù)主要用在科研領(lǐng)域。血清學(xué)IgM抗體ELISA檢測(cè)是臨床應(yīng)用較廣的方法，通過(guò)檢測(cè)血清中呼吸道腺病毒IgM抗體了解患者近期感染病毒的情況，對(duì)臨床診治有一定的幫助。但是很多呼吸道腺病毒患者是小于5歲的兒童，由于較多幼童的血管較細(xì)，而且對(duì)抽血有恐懼感，因此給臨床醫(yī)護(hù)人員操作帶來(lái)一定的難度，給患者和家長(zhǎng)帶來(lái)心理壓力和痛苦感受。血清IgM抗體免疫熒光檢測(cè)應(yīng)用也是通過(guò)檢測(cè)血清中呼吸道腺病毒IgM抗體了解患者近期感染病毒的情況，該技術(shù)需要專業(yè)的人員和專門的熒光顯微鏡，這限制了其在臨床的推廣能力。PCR核酸檢測(cè)是呼吸道腺病毒早期檢測(cè)方法中靈敏度最高的方法，通過(guò)檢測(cè)患者鼻咽喉部細(xì)胞中的呼吸道腺病毒判斷感染情況。該技術(shù)需要專業(yè)的技術(shù)人員和專門熒光PCR擴(kuò)增儀，基層醫(yī)療部門比較難開展該診斷方法。另外該技術(shù)需要采集患者咽喉部細(xì)胞，較容易引起患者不適造成反嘔或者嘔吐發(fā)生。

當(dāng)呼吸道腺病毒通過(guò)呼吸道系統(tǒng)侵入人體，人體免疫系統(tǒng)開始啟動(dòng)第一道防線，是通過(guò)粘膜免疫進(jìn)行防疫阻止呼吸道腺病毒在人體細(xì)胞定植。粘膜免疫主要是通過(guò)唾液產(chǎn)生病毒特異性的IgA抗體抵抗病毒侵染，因此病毒IgA抗體產(chǎn)生可以預(yù)示病毒感染情況發(fā)生。本發(fā)明是檢測(cè)患者唾液中呼吸道腺病毒IgA抗體，是一種無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)技術(shù)，容易被患兒接受。而且采用的是快速層析法，檢測(cè)時(shí)間小于30分鐘，可以方便基層醫(yī)療部門和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，提高醫(yī)護(hù)人員的工作效率，盡早對(duì)癥治療，縮短患者康復(fù)進(jìn)程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種呼吸道腺病毒IgA抗體檢測(cè)試紙條及其檢測(cè)方法。

本發(fā)明首先提供了一種呼吸道腺病毒IgA抗體檢測(cè)試紙條，包括樣品墊、標(biāo)記墊、硝酸纖維素膜、吸水紙、背板，所述的纖維素膜包括噴涂有呼吸道腺病毒六鄰體蛋白抗原多肽片段的檢測(cè)線和人IgA抗體的對(duì)照線。

進(jìn)一步地，所述呼吸道腺病毒六鄰體蛋白抗原多肽片段的氨基酸序列如序列表Seq ID NO.1所述。

進(jìn)一步地，所述樣品墊、標(biāo)記墊、硝酸纖維素膜、吸水紙均粘附在背板上。

進(jìn)一步地，所述的標(biāo)記墊含有抗人IgA抗體標(biāo)記上膠體金，所述抗人IgA抗體包括羊抗人IgA多克隆抗體、鼠抗人IgA單克隆抗體、兔抗人IgA單克隆抗體、兔抗人IgA多克隆抗體。

進(jìn)一步地，所述試紙條檢測(cè)人唾液標(biāo)本。

進(jìn)一步地，所述唾液標(biāo)本通過(guò)將無(wú)菌脫脂棉放置于待測(cè)對(duì)象舌下，吸附唾液后再用注射器擠壓出的方法獲得。

本發(fā)明還提供了所述試紙條的檢測(cè)呼吸道腺病毒IgA抗體的方法：采集待測(cè)對(duì)象唾液標(biāo)本，并利用該唾液標(biāo)本與所述試紙條接觸進(jìn)行檢測(cè)。

進(jìn)一步地，所述唾液標(biāo)本的采集方法為：將無(wú)菌脫脂棉放置于待測(cè)對(duì)象舌下，吸附唾液后再用注射器擠壓出唾液標(biāo)本。

進(jìn)一步地，所述無(wú)菌脫脂棉用棉線捆綁。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明通過(guò)無(wú)菌脫脂棉采集唾液標(biāo)本，再將唾液標(biāo)本用注射器擠出，通過(guò)呼吸道腺病毒IgA抗體快速層析紙條檢測(cè)唾液中的IgA抗體，實(shí)現(xiàn)快速診斷患者感染呼吸道腺病毒的目的。本方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果快速，適合各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)快速診斷呼吸道腺病毒感染。采集標(biāo)本無(wú)侵 入性，避免傳統(tǒng)的采血和采集鼻咽拭子給病人帶來(lái)不適，也提高醫(yī)護(hù)人員的工作效率，提高呼吸道腺病毒診斷在臨床上推廣率。

為了更好地理解和實(shí)施，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明檢測(cè)唾液中呼吸道腺病毒IgA抗體的試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為注射器擠壓唾液示意圖。

圖3為膠體金紙條測(cè)試示意圖。

圖4為本發(fā)明試紙條檢測(cè)呼吸道腺病毒IgA抗體的陽(yáng)性示意圖。

圖5為本發(fā)明試紙條檢測(cè)呼吸道腺病毒IgA抗體的陰性示意圖。

圖6為本發(fā)明試紙條檢測(cè)呼吸道腺病毒IgA抗體的無(wú)效示意圖。

具體實(shí)施方式

【實(shí)施例1】呼吸道腺病毒IgA抗體診斷試劑條制備

1、原料來(lái)源：羊抗人IgA抗體購(gòu)自Sigma公司，人IgA抗體購(gòu)自廣州市諾思生物科技有限公司。呼吸道腺病毒六鄰體蛋白抗原多肽片段的序列為：Met Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro Gln Lys Phe Phe Ala Val Lys Asn Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Asn Phe Arg Lys Asp Val Asn Met Val Leu(Seq ID NO.1)，總共46個(gè)氨基酸，委托上海吉爾生化公司負(fù)責(zé)合成，純度大于98％，凍干保存。

2、羊抗人IgA抗體膠體金標(biāo)記墊制備

在pH值6.8-7.0溶液內(nèi)，羊抗人IgA抗體與膠體金顆粒標(biāo)記形成羊抗人IgA抗體膠體金標(biāo)記物(標(biāo)記量為25ug/ml)，封閉液成分為PEG20000和BSA蛋白。將膠體金標(biāo)記物噴涂到玻璃纖維膜上，稀釋參數(shù)為30cm²/ml，并在濕度15％，溫度30℃條件下干燥12小時(shí)以上，制備的膠體金標(biāo)記墊密封備用。

3、硝酸纖維素膜包被

用包被液稀釋人IgA抗體、呼吸道腺病毒六鄰體蛋白抗原多肽片段，其中人IgA抗體的濃度為1.5mg/ml，呼吸道腺病毒六鄰體蛋白抗原多肽片段濃度為1mg/ml。如附圖1，將兩者均勻噴涂到NC膜上，其中人IgA抗體噴到NC膜上C位置，呼吸道腺病毒六鄰體蛋白抗原多肽片段噴到NC膜上T位置。將噴涂好的NC膜放置在濕度10-30％，溫度20-35℃條件下烘干處理12小時(shí)以上，烘干好的NC膜密封備用。

4、組裝、切條

結(jié)合附圖1示意圖，將吸水紙4、硝酸纖維素膜3、膠體金標(biāo)記墊2、玻璃纖維膜1按順序黏貼在pvc背板5上，然后調(diào)整切條機(jī)參數(shù)進(jìn)行切條，切成4mm寬度的試紙條。

【實(shí)施例2】無(wú)菌脫脂棉制備

采購(gòu)直徑為2cm的醫(yī)用脫脂棉球，捆綁上長(zhǎng)度為8-10cm的棉線。將處理好的棉球放置高壓鍋中，壓力條件121℃30分鐘，高壓后放置烤箱中干燥，溫度100℃，時(shí)間4小時(shí)，干燥后的棉球鋁箔袋真空密封。

【實(shí)施例3】唾液標(biāo)本采集

本發(fā)明是將無(wú)菌脫脂棉放置到幼兒的舌下，棉線暴露在口外，口含3-5分鐘。如附圖2，將棉球22，放置到注射器21中，然后裝上注射器推動(dòng)桿，輕緩?fù)苿?dòng)，獲得唾液標(biāo)本23，用2ml小管保存。

【實(shí)施例4】標(biāo)本測(cè)試

結(jié)合附圖3說(shuō)明，將呼吸道腺病毒IgA紙條放置到裝有唾液標(biāo)本的小管中，樣品墊端接觸唾液標(biāo)本，放置15-30分鐘，然后肉眼觀察結(jié)果。

如果唾液標(biāo)本中含有呼吸道腺病毒IgA抗體，會(huì)與標(biāo)記墊中的羊抗人IgA抗體膠體金標(biāo)記物(C線)結(jié)合，上行到NC膜上的呼吸道腺病毒六鄰體蛋白抗原多肽片段檢測(cè)線(T線)特異結(jié)合，形成紅色條帶(附圖4)。如果標(biāo)本中沒(méi)有含有相應(yīng)的呼吸道腺病毒IgA抗體，羊抗人IgA抗體膠體金標(biāo)記物會(huì)越過(guò)檢測(cè)線(T線)，繼續(xù)上行到對(duì)照線與人IgA抗體(C線)結(jié)合，在對(duì)照線上形成紅色條帶(附圖5)。如果對(duì)照線(C線)沒(méi)有形成紅色條帶，說(shuō)明試紙條失效，結(jié)果不可靠(附圖6)。

【實(shí)施例5】本發(fā)明呼吸道腺病毒IgA膠體金診斷方法與熒光PCR方法結(jié)果對(duì)比

選取臨床標(biāo)本60例，分別采集患者的唾液標(biāo)本和咽拭子標(biāo)本，分別用呼吸道腺病毒IgA抗體檢測(cè)試紙條診斷方法與熒光PCR方法進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如表1：

表1本發(fā)明的呼吸道腺病毒IgA抗體檢測(cè)試紙條診斷方法與熒光PCR方法比較結(jié)果

本發(fā)明呼吸道腺病毒IgA膠體金診斷方法與熒光PCR方法比較，靈敏度達(dá)到95.00％，特異性95.00％，可以符合臨床檢測(cè)的條件。

本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施方式，如果對(duì)本發(fā)明的各種改動(dòng)或變形不脫離本發(fā)明的精神 和范圍，倘若這些改動(dòng)和變形屬于本發(fā)明的權(quán)利要求和等同技術(shù)范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變形。