本發(fā)明涉及活化部分促凝血酶原激酶時間測定用試劑、活化部分促凝血酶原激酶時間測定用試劑盒及活化部分促凝血酶原激酶時間的測定方法。
背景技術(shù)：
：有含有作為凝固的活化劑的鞣花酸和作為抑制鞣花酸的沉淀的物質(zhì)的酚的活化部分促凝血酶原激酶時間(以下也稱為“APTT”)測定用試劑。但是，由于對作為給環(huán)境造成負擔的物質(zhì)的酚的使用的規(guī)定變嚴，從而期望基本上不含有酚，抑制鞣花酸的沉淀的APTT測定用試劑。作為這樣的APTT測定用試劑，特開2013-205087號公報中記載的試劑被提議。特開2013-205087號公報中記載的試劑含鞣花酸和作為抑制鞣花酸的沉淀的物質(zhì)有芳香環(huán)的氨基酸。本發(fā)明提供在基本上不含酚的APTT測定用試劑中由新穎的方法抑制鞣花酸的沉淀的APTT測定用試劑、含其的APTT測定用試劑盒、使用這些APTT的測定方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的范圍僅由隨附的權(quán)利要求定義，不受此發(fā)明概述部分的任何影響。本發(fā)明提供以下技術(shù)方案。(1)活化部分促凝血酶原激酶時間測定用試劑，其含鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物。(2)(1)所述的試劑，其中所述聚乙烯醇化合物的皂化度是72～89mol％。(3)(1)或(2)所述的試劑，其中所述聚乙烯醇化合物的聚合度是300～500。(4)(1)～(3)之任一項所述的試劑，其中所述聚乙烯醇化合物的含量是0.025～0.2質(zhì)量％。(5)(1)～(4)之任一項所述的試劑，其中上述鞣花酸化合物每100質(zhì)量份的所述聚乙烯醇化合物的量是10～50質(zhì)量份。(6)(1)～(5)之任一項所述的試劑，其還含金屬離子形成化合物。(7)(6)所述的試劑，其中上述金屬離子形成化合物是鋅離子形成化合物與鋁離子形成化合物的混合物或錳離子形成化合物與鋁離子形成化合物的混合物。(8)(1)～(7)之任一項所述的試劑，其還含芳香族氨基酸化合物。(9)(1)～(8)之任一項所述的試劑，其基本上不含有酚。(10)活化部分促凝血酶原激酶時間測定用試劑盒，其含：含鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物的第1試劑，及含鈣鹽的第2試劑。(11)(10)所述的試劑盒，其中所述聚乙烯醇化合物的皂化度是72～89mol％。(12)(10)或(11)所述的試劑盒，其基本上不含有酚。(13)活化部分促凝血酶原激酶時間的測定方法，其包括：將血液待測樣品、鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物混合而得到樣品的第1混合工序；將上述第1混合工序中得到的樣品和鈣鹽混合而得到測定樣品的第2混合工序；及測定上述第2混合工序中得到的測定樣品的活化部分促凝血酶原激酶時間的工序。(14)(13)所述的方法，其中所述聚乙烯醇化合物的皂化度是72～89mol％。(15)(13)或(14)所述的方法，其中所述聚乙烯醇化合物的聚合度是300～500。(16)(13)～(15)之任一項所述的方法，其中上述鞣花酸化合物每100質(zhì)量份的所述聚乙烯醇化合物的量是10～50質(zhì)量份。(17)(13)～(16)之任一項所述的方法，其還含金屬離子形成化合物。(18)(17)所述的方法，其中上述金屬離子形成化合物是鋅離子形成化合物與鋁離子形成化合物的混合物或錳離子形成化合物與鋁離子形成化合物的混合物。(19)(13)～(18)之任一項所述的方法，其還含芳香族氨基酸化合物。(20)(13)～(19)之任一項所述的方法，其基本上不含有酚。(21)含鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物的第1試劑、及含鈣鹽的第2試劑用于制造活化部分促凝血酶原激酶時間測定用試劑盒的用途?！景l(fā)明效果】由本發(fā)明可提供在基本上不含有酚的APTT測定用試劑中由新穎的方法抑制鞣花酸的沉淀的APTT測定用試劑、含其的APTT測定用試劑盒、使用這些APTT的測定方法?！靖綀D說明】【圖1】是APTT測定用試劑盒的構(gòu)成圖?！緢D2】是在參考例1、2、比較例6及7中，顯示研究APTT比的結(jié)果的坐標圖?！緦嵤┓绞健?.APTT測定用試劑本實施方式涉及的APTT測定用試劑(以下，也簡稱為“試劑”)含鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物。在本實施方式涉及的試劑中，鞣花酸化合物、磷脂及聚乙烯醇化合物通常是溶解于水系溶劑。在本說明書中，“鞣花酸化合物”是指鞣花酸、鞣花酸的鹽及鞣花酸的金屬鰲合化合物的總稱。鞣花酸被知是與內(nèi)源性凝固途徑相關(guān)的接觸因子的活化劑。作為接觸因子，例如，可舉出前激肽釋放酶、高分子激肽原、第XII因子、第XI因子等，但不特別限定。鞣花酸可為天然來源的鞣花酸，也可為合成的鞣花酸。作為鞣花酸的鹽，例如，可舉出鞣花酸的堿金屬鹽等，但不特別限定。作為堿金屬鹽，例如，可舉出鈉鹽、鉀鹽等，但不特別限定。鞣花酸通過經(jīng)配位鍵與金屬離子形成金屬鰲合化合物，顯示對于與內(nèi)源性凝固途徑相關(guān)的接觸因子強力的活化作用。從而，在本實施方式涉及的試劑中，鞣花酸化合物優(yōu)選為鞣花酸的金屬鰲合化合物。金屬離子優(yōu)選為鋅離子與鋁離子的混合物及錳離子與鋁離子的混合物。本實施方式涉及的試劑中的鞣花酸化合物的量可根據(jù)APTT的測定條件等適宜確定。本實施方式涉及的試劑中的鞣花酸化合物的量通常優(yōu)選為0.01～0.5mM、更優(yōu)選為0.05～0.2mM。在本實施方式涉及的試劑中，作為與內(nèi)源性凝固途徑相關(guān)的接觸因子的活化劑，也可還含鞣花酸化合物以外的活化劑。作為涉及的活化劑，例如，可舉出氧化硅、高嶺土、硅藻土(例如，硅藻土公司制、商品名：硅藻土(注冊商標)等)等，但不特別限定。此時，本實施方式涉及的試劑中的鞣花酸化合物與鞣花酸化合物以外的活化劑的合計量，自充分地確保作為接觸因子的活化劑的效果的觀點來看，優(yōu)選為0.05mM以上、更優(yōu)選為0.1mM以上，自確保良好的試劑靈敏度的觀點來看，優(yōu)選為0.2mM、更優(yōu)選為0.11mM以下。在本說明書中，“聚乙烯醇化合物”是指聚乙烯醇及其衍生物的總稱。另外，在本說明書中，“聚乙烯醇的衍生物”是指在聚乙烯醇的側(cè)鏈有修飾基的化合物。修飾基是不妨礙由聚乙烯醇的鞣花酸的分散能力的官能團即可。作為修飾基，例如，可舉出甲基、乙基、丙基等的碳原子數(shù)1～3的烷基等，但不特別限定。聚乙烯醇化合物的皂化度，自充分地確保對水系溶劑的溶解性的觀點來看，優(yōu)選為72mol％以上、更優(yōu)選為78mol％以上，經(jīng)更長期間抑制沉淀的發(fā)生，自使長期保存穩(wěn)定性提高的觀點來看，優(yōu)選為89mol％以下，更優(yōu)選為80mol％以下。其中，聚乙烯醇化合物的皂化度是通過基于JISK6726-1994中規(guī)定的聚乙烯醇試驗方法算出而求出的值。聚乙烯醇化合物的聚合度，自充分地確保分散效果的觀點來看，優(yōu)選為200以上、更優(yōu)選為300以上，自抑制粘性增加的觀點來看，優(yōu)選為500以下，更優(yōu)選為400以下。鞣花酸有難以溶解于以往的APTT測定用試劑中使用的水系溶劑、容易發(fā)生沉淀的性質(zhì)。當發(fā)生鞣花酸的沉淀時，凝固反應(yīng)系統(tǒng)中的鞣花酸不足，凝固反應(yīng)的進行變遲。因此，有凝固時間過度延長的情況。從而，以往的APTT測定用試劑通過作為鞣花酸的沉淀防止劑配合酚，抑制鞣花酸的沉淀。但是，自對環(huán)境的負擔的降低的觀點來看，期望避免使用酚。與此相比，在本實施方式涉及的試劑中，可由聚乙烯醇化合物防止鞣花酸的沉淀。因此，本實施方式涉及的試劑也可基本上不含有酚。即，本實施方式涉及的試劑是含鞣花酸化合物和作為鞣花酸化合物的沉淀防止劑的聚乙烯醇化合物，但基本上不含有酚的試劑。其中，“基本上不含有酚”是指未向本實施方式涉及的試劑人為配合酚，用慣用的檢測手段不能檢測。本實施方式涉及的試劑中的聚乙烯醇化合物的含量，自抑制沉淀的發(fā)生的觀點來看，優(yōu)選為0.025質(zhì)量％以上、更優(yōu)選為0.05質(zhì)量％以上，自抑制粘性的增加的觀點來看，優(yōu)選為0.2質(zhì)量％以下，更優(yōu)選為0.1質(zhì)量％以下。鞣花酸每100質(zhì)量份的聚乙烯醇化合物的量，自確保充分的分散效力的觀點來看，優(yōu)選為10質(zhì)量份以上、更優(yōu)選為15質(zhì)量份以上，自確保充分的分散效力的觀點來看，優(yōu)選為50質(zhì)量份以下，更優(yōu)選為40質(zhì)量份以下。磷脂促進血液的凝固反應(yīng)。磷脂是在分子結(jié)構(gòu)中有磷酸酯部位的脂質(zhì)。磷脂可為天然來源磷脂，可為合成磷脂。作為天然來源磷脂，例如，可舉出兔、牛、豬、雞、人等的動物、大豆等的植物來源的磷脂等，但不特別限定。作為動物來源的磷脂，例如，可舉出兔腦、牛腦、卵黃、人胎盤等來源的磷脂等，但不特別限定。作為磷脂，具體而言，例如，可舉出磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油等，但不特別限定。在這些磷脂之中，由于血液的凝固反應(yīng)有效率地進行，優(yōu)選為磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿及磷脂酰絲氨酸。這些磷脂可單獨使用，也可將2種以上混合而使用。作為磷脂所具有的脂肪酸側(cè)鏈，例如，可舉出棕櫚酰基、油?；⒂仓；龋惶貏e限定。這些脂肪酸側(cè)鏈可在不妨礙血液的凝固反應(yīng)的范圍內(nèi)適宜選擇。本實施方式涉及的試劑中的磷脂的量可根據(jù)磷脂的種類、APTT的測定條件等適宜確定。本實施方式涉及的試劑中的磷脂的量，通常，優(yōu)選為30～2000μg/mL、更優(yōu)選為100～600μg/mL。磷脂是磷脂酰乙醇胺時，本實施方式涉及的試劑中的磷脂的量，通常，優(yōu)選為10～700μg/mL、更優(yōu)選為30～300μg/mL。磷脂是磷脂酰膽堿時，本實施方式涉及的試劑中的磷脂的量通常是，優(yōu)選為20～1000μg/mL、更優(yōu)選為30～500μg/mL。磷脂是磷脂酰絲氨酸時，本實施方式涉及的試劑中的磷脂的濃度通常是，優(yōu)選為3～300μg/mL、更優(yōu)選為5～150μg/mL。磷脂是磷脂酰甘油時，本實施方式涉及的試劑中的磷脂的量通常是，優(yōu)選為3～300μg/mL、更優(yōu)選為5～150μg/mL。水系溶劑可自在血液凝固性的臨床檢查中通常使用的水系溶劑適宜選擇。作為水系溶劑，例如，可舉出水、生理鹽水等，但不特別限定。本實施方式涉及的試劑的pH優(yōu)選為6～8、更優(yōu)選為7～7.6。本實施方式涉及的試劑的pH可由APTT測定用試劑中通常使用的緩沖液成分適宜調(diào)整。緩沖液成分優(yōu)選為在pH5～9、優(yōu)選為pH6～8的范圍有緩沖作用的緩沖液成分。作為緩沖液成分，例如，可舉出2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)、2-氨基-2-(羥甲基)-1,3-丙二醇(Tris)、3-嗎啉代丙磺酸(MOPS)等，但不特別限定。本實施方式涉及的試劑優(yōu)選為還含金屬離子形成化合物。金屬離子形成化合物是在本實施方式涉及的試劑中形成金屬離子的化合物即可。當本實施方式涉及的試劑作為防腐劑含氨基糖苷系抗生物質(zhì)時，金屬離子形成化合物優(yōu)選為選自鋅離子形成化合物、錳離子形成化合物及鋁離子形成化合物的任意的組合。就是在其中，鋅離子形成化合物與鋁離子形成化合物的混合物、及錳離子形成化合物與鋁離子形成化合物的混合物，在從有效抑制由氨基糖苷系抗生物質(zhì)導(dǎo)致的凝固時間的過度的延長的觀點是優(yōu)選的。作為鋅離子形成化合物，例如，可舉出氯化鋅等的鹵化鋅等，但不特別限定。作為錳離子形成化合物，例如，可舉出氯化錳等的鹵化錳等，但不特別限定。作為鋁離子形成化合物，例如，可舉出氯化鋁等的鹵化鋁等，但不特別限定。本實施方式涉及的試劑中的金屬離子形成化合物的量通常是，自使接觸因子的活化作用提高的觀點來看，優(yōu)選為1μM以上、更優(yōu)選為10μM以上，自抑制沉淀物的發(fā)生的觀點來看，優(yōu)選為1mM以下，更優(yōu)選為500μM以下。本實施方式涉及的試劑中的金屬離子形成化合物是鋅離子形成化合物與鋁離子形成化合物的混合物、或者錳離子形成化合物與鋁離子形成化合物的混合物時，本實施方式涉及的試劑中的金屬離子形成化合物的量，自有效抑制由氨基糖苷系抗生物質(zhì)導(dǎo)致的凝固時間的過度的延長的觀點來看，優(yōu)選為10～500μM。本實施方式涉及的試劑優(yōu)選為還含芳香族氨基酸化合物。此時，可由芳香族氨基酸化合物更有效抑制鞣花酸化合物的沉淀。在本說明書中，“芳香族氨基酸化合物”是指芳香族氨基酸、及芳香族氨基酸的衍生物的總稱。芳香族氨基酸是側(cè)鏈上有芳香環(huán)的氨基酸。作為芳香環(huán)，例如，可舉出苯環(huán)、稠環(huán)苯環(huán)、非苯芳香環(huán)、芳香雜環(huán)等，但不特別限定。芳香族氨基酸化合物中的芳香環(huán)的數(shù)可為1個，也可為多個。在芳香族氨基酸化合物有多個芳香環(huán)時，多個芳香環(huán)可相同，可互相不同。芳香族氨基酸是α-氨基酸。芳香族氨基酸優(yōu)選為選自在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的種類的氨基酸及其衍生物的至少1種。作為芳香族氨基酸，例如，可舉出苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨酸等，但不特別限定。芳香族氨基酸的衍生物是指芳香族氨基酸中所含的芳香環(huán)中的氫原子或羥基進一步任意地被適宜的取代基取代的化合物。取代基是不妨礙血液凝固反應(yīng)及鞣花酸的增溶或分散化的取代基即可。在芳香族氨基酸化合物之中，優(yōu)選為苯丙氨酸及酪氨酸，更優(yōu)選為苯丙氨酸。再者，芳香族氨基酸化合物可為L-體、D-體及它們的混合物的任何。另外，芳香族氨基酸化合物可為天然來源的化合物，可為合成的化合物。本實施方式涉及的試劑中的芳香族氨基酸化合物的量可根據(jù)芳香族氨基酸化合物的種類、本實施方式涉及的試劑中所含的鞣花酸化合物的量等適宜確定。本實施方式涉及的試劑中的芳香族氨基酸化合物的量通常是，從充分地確保分散效力的觀點來看，優(yōu)選為0.001w/v％以上、更優(yōu)選為0.01w/v％以上，自確保對水系溶劑的充分的溶解性的觀點來看，優(yōu)選為10w/v％以下，更優(yōu)選為1.0w/v％以下。本實施方式涉及的試劑也可還含添加劑。作為添加劑，例如，可舉出防腐劑、抗氧化劑、穩(wěn)定化劑等，但不特別限定。作為防腐劑，例如，可舉出氨基糖苷系抗生物質(zhì)等的抗生物質(zhì)、疊氮化鈉等，但不特別限定。作為抗氧化劑，例如，可舉出3-t-丁基-4-羥基苯甲醚等，但不特別限定。作為穩(wěn)定化劑，例如，可舉出聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮等，但不特別限定。本實施方式涉及的試劑，例如，可通過將水系溶劑、磷脂及聚乙烯醇化合物和鞣花酸化合物混合，將得到的混合物的pH調(diào)整到適宜的pH等來制造。再者，向得到的試劑，根據(jù)需要，也可還添加金屬離子形成化合物、芳香族氨基酸化合物、添加劑等。本實施方式涉及的試劑，在一般的APTT的測定條件下，與鈣鹽的溶液一同適宜地使用時，可得到與以往的APTT測定用試劑同程度的測定結(jié)果。更具體而言，使用本實施方式涉及的試劑，測定指定的正常血漿〔例如，Sysmex(株)制的商品名：CoagtrolIX〕的APTT時，優(yōu)選為APTT處于25～35秒鐘的范圍內(nèi)。另外，測定指定的異常血漿〔例如，Sysmex(株)制、商品名：CoagtrolIIX〕的APTT時，優(yōu)選為APTT處于60～100秒鐘的范圍內(nèi)。本實施方式涉及的試劑可在APTT的測定及LA的檢測中適宜地使用。本實施方式涉及的試劑的使用方法與以往的APTT測定用試劑同樣。2.APTT測定用試劑盒本實施方式涉及的APTT測定用試劑盒(以下，也簡稱為“試劑盒”)的特征在于含：含鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物的第1試劑，和含鈣鹽的第2試劑。作為本實施方式涉及的試劑盒的一例，可舉出圖1所示的試劑盒10等，但不特別限定。圖1所示的試劑盒10含第1試劑容器11和第2試劑容器12。第1試劑容器11收容含鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物的第1試劑。第2試劑容器12收容含鈣鹽的第2試劑。本實施方式涉及的試劑盒也可還含附帶文書。附帶文書也可含使用本實施方式涉及的試劑盒進行APTT的測定的操作順序等的記載。在第1試劑中使用的鞣花酸化合物、磷脂及聚乙烯醇化合物是與前述的本實施方式涉及的APTT測定用試劑中使用的鞣花酸、磷脂及聚乙烯醇化合物同樣。另外，第1試劑中的鞣花酸化合物、磷脂及聚乙烯醇化合物各自的量是與前述的本實施方式涉及的APTT試劑中的鞣花酸、磷脂及聚乙烯醇化合物各自的量同樣。第1試劑也可適宜地含水系溶劑、添加劑等。水系溶劑及添加劑是與前述的本實施方式涉及的APTT測定用試劑中使用的水系溶劑及添加劑同樣。第1試劑是優(yōu)選為前述的本實施方式涉及的APTT測定用試劑。再者，在本實施方式涉及的試劑盒中，鞣花酸化合物、磷脂及聚乙烯醇化合物也可被收容到不同的容器中。此時，可通過將收容到不同的容器的鞣花酸化合物、磷脂及聚乙烯醇化合物各自在使用時混合來調(diào)制第1試劑。第2試劑含鈣鹽。鈣鹽是在測定APTT時使用的測定樣品中形成鈣離子的鹽即可。作為鈣鹽，可舉出氯化鈣、硫酸鈣、亞硝酸鈣、碳酸鈣、乳酸鈣、酒石酸鈣等，但不特別限定。這些鈣鹽可單獨使用，也可將2種以上混合而使用。第2試劑中的鈣鹽的量優(yōu)選為2.5～40mM、更優(yōu)選為10～30mM。第2試劑也可適宜地含水系溶劑、添加劑等。水系溶劑及添加劑是與前述的本實施方式涉及的APTT測定用試劑中使用的水系溶劑及添加劑同樣。本實施方式涉及的試劑盒也可根據(jù)需要，還含稀釋用的水系溶劑、對照血漿等。水系溶劑與前述的本實施方式涉及的APTT測定用試劑中使用的水系溶劑同樣。作為對照血漿，例如，可舉出正常血漿、精度管理用血漿、缺乏各種凝血因子的血漿、LA陽性血漿等，但不特別限定。作為精度管理用血漿，例如，可舉出Sysmex(株)制的商品名：CoagtrolIX、Sysmex(株)制的商品名：CoagtrolIIX等，但不特別限定。使用本實施方式涉及的試劑盒，例如，檢測LA時，可用稀釋用的水系溶劑將第1試劑稀釋至期望的稀釋率，調(diào)制磷脂濃度互相不同的2種第1試劑。本實施方式涉及的試劑盒可在APTT的測定及LA的檢測中適宜地使用。本實施方式涉及的試劑盒的使用方法與以往的APTT測定用試劑盒同樣。3.APTT的測定方法本實施方式涉及的APTT的測定方法(以下，也簡稱為“測定方法”)的特征在于包括：將血液待測樣品、鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物混合而得到樣品的第1混合工序；將上述第1混合工序中得到的樣品和鈣鹽混合而得到測定樣品的第2混合工序；及測定上述第2混合工序中得到的測定樣品的APTT的工序。由本實施方式涉及的測定方法即使在使用含第IX因子的血液待測樣品時也可以充分的靈敏度測定APTT。再者，在本說明書中，“樣品”是指血液待測樣品、鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物的混合物。另外，“測定樣品”是指血液待測樣品、鞣花酸化合物、磷脂、聚乙烯醇化合物和鈣鹽的混合物。在第1混合工序中，將血液待測樣品、鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物混合而得到樣品。再者，在第1混合工序之前，也可將血液待測樣品加溫到對于進行凝固反應(yīng)適宜的溫度。此時，血液待測樣品的加溫溫度，通常優(yōu)選為30～45℃、更優(yōu)選為36～38℃。作為血液待測樣品，例如，可舉出血液、自血液得到的血漿等，但不特別限定。在本實施方式涉及的測定方法中，作為血液待測樣品，可使用自被檢者的血液得到的血漿、前述的對照血漿及它們的混合物等。就血漿而言，例如，通過不使血液溶血地進行離心分離而血除去細胞成分等而得到。另外，也可在血液中添加在血液凝固性的臨床檢查中通常使用的公知的抗凝固劑。作為抗凝固劑，例如，可舉出檸檬酸鈉等，但不特別限定。在本實施方式涉及的測定方法中，作為對照血漿，可使用正常血漿、精度管理用血漿、缺乏各種的凝血因子的血漿、LA陽性血漿等。正常血漿可為自健康者的血液得到的血漿，可為市售的正常血漿。在將LA的檢測作為目的時，作為血液待測樣品，優(yōu)選還使用有存在LA的可能性的血漿與正常血漿的混合物。在被檢者缺損凝血因子時，通過被檢者的血漿與正常血漿的混合而防止凝固時間的延長，檢查的靈敏度提高。再者，被驗血漿/正常血漿(體積比)，通常，優(yōu)選為8/2～2/8、特別優(yōu)選為5/5。在第1混合工序中，血液待測樣品、鞣花酸化合物、磷脂與聚乙烯醇化合物的混合的順序不特別限定。在第1混合工序中，與血液待測樣品混合的鞣花酸化合物的量是測定樣品中的鞣花酸化合物的濃度達指定濃度的量即可。測定樣品中的鞣花酸化合物的濃度，通常，優(yōu)選為3.5～150μM、更優(yōu)選為10～50μM。與血液待測樣品混合的磷脂的量是測定樣品中的磷脂的濃度達指定濃度的量即可。測定樣品中的磷脂的濃度可根據(jù)磷脂的種類適宜設(shè)定。磷脂是磷脂酰乙醇胺時，測定樣品中的磷脂的濃度，通常，優(yōu)選為1～150μg/mL、更優(yōu)選為5～50μg/mL。磷脂是磷脂酰膽堿時，測定樣品中的磷脂的濃度，通常，優(yōu)選為1～100μg/mL、更優(yōu)選為5～80μg/mL。磷脂是磷脂酰絲氨酸時，測定樣品中的磷脂的濃度，通常，優(yōu)選為0.1～50μg/mL、更優(yōu)選為1～10μg/mL。磷脂是磷脂酰二醇時，測定樣品中的磷脂的濃度，通常，優(yōu)選為0.1～50μg/mL、更優(yōu)選為1～10μg/mL。磷脂是2種以上的磷脂的混合物時，測定樣品中的各磷脂的濃度的合計，通常，優(yōu)選為5～400μg/mL、更優(yōu)選為20～100μg/mL。再者，在第1混合工序中，代替分別使用鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物，可使用前述的本實施方式涉及的APTT測定用試劑或前述的本實施方式涉及的APTT測定用試劑盒的第1試劑。再者，將LA的檢測作為目的時，優(yōu)選為稀釋APTT測定用試劑或第1試劑而調(diào)制有互相不同的磷脂濃度的2種APTT測定用試劑或第1試劑而使用。在血液待測樣品與APTT測定用試劑或第1試劑混合時，[血液待測樣品]/[APTT測定用試劑或第1試劑](體積比)，通常，優(yōu)選為8/2～2/8、更優(yōu)選為6/4～4/6、特別優(yōu)選為5/5。第1混合工序中的加溫溫度是對于進行血液的凝固反應(yīng)適宜的溫度即可。加溫溫度，通常，優(yōu)選為25～45℃、更優(yōu)選為35～38℃。另外，加溫時間，通常，優(yōu)選為1～10分鐘、更優(yōu)選為3～5分鐘。在第2混合工序中，將第1混合工序中得到的樣品和鈣鹽混合而調(diào)制測定樣品，測定測定樣品的APTT。在第2混合工序中，在向樣品添加鈣鹽之前，也可將樣品加溫到對于進行凝固反應(yīng)適宜的溫度。樣品的加溫溫度，從凝固反應(yīng)的反應(yīng)性的觀點來看，優(yōu)選為30℃以上、更優(yōu)選為36℃以上，自蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的觀點來看，優(yōu)選為45℃以下，更優(yōu)選為38℃以下。此時，加溫時間，從凝固反應(yīng)的反應(yīng)性的觀點來看，優(yōu)選為1分鐘以上、更優(yōu)選為2分鐘以上，自蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的觀點來看，優(yōu)選為6分鐘以下，更優(yōu)選為5分鐘以下。與樣品混合的鈣鹽的量是測定樣品中的鈣鹽的濃度達指定濃度的量即可。測定樣品中的鈣鹽的濃度優(yōu)選為2～20mM、更優(yōu)選為4～10mM。再者，在第2混合工序中，作為鈣鹽，可使用前述的本實施方式涉及的試劑盒的第2試劑。在第1混合工序中得到的樣品與第2試劑混合時，血液待測樣品/第2試劑(體積比)，通常，優(yōu)選為8/2～5/5、更優(yōu)選為7/3～6/4、特別優(yōu)選為2/1。第2混合工序中的加溫溫度是與第1混合工序中的加溫溫度同樣。測定樣品的APTT可基于凝固信息研究。作為凝固信息，例如，可舉出向測定樣品照射光時的透射光或散射光的變化、測定樣品的粘度的變化等，但不特別限定。此時，測定樣品的APTT可通過向測定樣品照射光，監(jiān)測來自透過測定樣品的透射光或測定樣品的散射光的變化，監(jiān)測測定樣品的粘度的變化等而研究。在APTT的測定中，使用在一般的APTT的測定中使用的測定裝置。作為測定裝置，例如，可舉出具備光學信息檢測部的市售的血液凝固測定裝置等，但不特別限定。作為測定裝置的具體例，可舉出Sysmex(株)制的商品名：CS-2000i、商品名：CS-2100i等。再者，在本說明書中，APTT是自向在第1混合工序中得到的樣品的鈣鹽的添加開始時起至血漿凝固的時間。血漿的凝固，例如，可以來自照射光的測定樣品的光的變化消失、測定樣品的粘度的變化消失等作為指標判斷。將LA的檢測作為目的時，優(yōu)選分別對于檢查對象的血漿(以下也稱為“被檢血漿”)及正常血漿使用APTT測定用試劑及稀釋其的試劑和鈣鹽。另外，LA的檢測優(yōu)選比較基于各自使用APTT測定用試劑及稀釋其的試劑、從被檢血漿得到的APTT而得到的值和閾值，基于比較結(jié)果進行。再者，也可代替使用APTT測定用試劑而使用APTT測定用試劑盒的第1試劑。作為閾值，例如，使用相對于正常血漿的APTT的被檢血漿的APTT之比等。作為閾值的具體例，可舉出狼瘡比(以下也稱為“LR值”)、Rosner指數(shù)等，但不特別限定。其中，LR值是指根據(jù)式(I)：[LR值]＝(b/a)/(d/c)＝bc/ad(I)(式中，a表示使用被檢血漿和第1試劑而得到的APTT、b表示使用被檢血漿和稀釋的APTT測定用試劑而得到的APTT、c表示使用正常血漿和APTT測定用試劑而得到的APTT、d表示使用正常血漿和稀釋的APTT測定用試劑而得到的APTT)算出的值。正常血漿的情況，LR值是1左右。另外，來源于血液凝血因子缺損患者、華法林施用患者或肝素施用患者的血漿的情況，LR值成為1左右。與此相比，來源于LA陽性患者的血漿的情況，LR值比1大。從而，從被檢血漿的LR值與正常血漿的LR值的比較結(jié)果，可檢測被檢血漿中的LA?！緦嵤├吭谙挛闹?，各縮略語的含意如下所述。再者，“重量平均分子量”是由凝膠滲透層析法求出的值。<縮略語>PVA：聚乙烯醇HEPES：2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸Tris：2-氨基-2-(羥甲基)-1,3-丙二醇PVP：聚乙烯基吡咯烷酮(岸田化學(株)制、聚乙烯基吡咯烷酮K-30)PEG6000：聚乙二醇6000(重量平均分子量：7300～9300)PE：磷脂酰乙醇胺PC：磷脂酰膽堿PS：磷脂酰絲氨酸PG：磷脂酰甘油BHA：3-t-丁基-4-羥基苯甲醚另外，在下文中，使用的聚乙烯醇的特性如表1所示?！颈?】(實施例1～12及比較例1)將表2所示的緩沖液成分、活化劑、金屬離子形成化合物、聚乙烯醇化合物、添加劑及水混合成表2所示的組成，得到不含有酚的試劑(實施例1～12)。另外，將表2所示的緩沖液成分、活化劑、金屬離子形成化合物、添加劑及水混合至表2所示的組成而得到試劑(比較例1)?！颈?】將實施例1～12及比較例1的試劑各自于60℃保存。通過用肉眼觀察自保存開始起經(jīng)過6天時及經(jīng)過12天時沉淀的有無，評價實施例1～12及比較例1的試劑各自的長期保存穩(wěn)定性。結(jié)果示于表3。再者，長期保存穩(wěn)定性的評價基準如下所述。<評價基準>AA：經(jīng)過12天時觀察不到沉淀，有優(yōu)良的長期保存穩(wěn)定性A：經(jīng)過6天時觀察不到沉淀，有良好的長期保存穩(wěn)定性NG：經(jīng)過6天時觀察到沉淀，無長期保存穩(wěn)定性【表3】從表3所示的結(jié)果知，在用含鞣花酸和聚乙烯醇化合物的實施例1～12的試劑時，在自保存開始起經(jīng)過6天時，觀察不到沉淀。從而得知，實施例1～12的試劑有良好的長期保存穩(wěn)定性。另外，在用含皂化度是72～89的聚乙烯醇化合物的實施例5～12中得到的試劑時，在自保存開始起12天經(jīng)過時，觀察不到沉淀。從而得知，實施例5～12的試劑有優(yōu)良的長期保存穩(wěn)定性。一方面，在用不含聚乙烯醇化合物的比較例1的試劑時，在自保存開始起6天經(jīng)過時觀察到沉淀。這些結(jié)果提示，通過向含鞣花酸的APTT測定用試劑還配合聚乙烯醇化合物，可抑制長期保存時的沉淀的發(fā)生。另外得知，從長期保存時的穩(wěn)定性的方面來看，聚乙烯醇化合物的皂化度優(yōu)選為72～89。(實施例13～15及比較例2)(1)試劑的調(diào)制及熱處理將表4所示的緩沖液成分、活化劑、金屬離子形成化合物、磷脂、聚乙烯醇化合物、添加劑及水混合成表4所示的組成，得到不含有酚的試劑(實施例13～15)。另外，將表4所示的緩沖液成分、活化劑、金屬離子形成化合物、磷脂、添加劑及水混合成表4所示的組成而得到試劑(比較例2)。將得到的試劑于45℃保存2周。【表4】(2)APTT的測定將被檢血漿50μL于30℃加溫1分鐘。接下來，將加溫后的被驗血漿和第1試劑50μL混合。將得到的混合物于37℃加溫3分鐘。將加溫后的混合物和第2試劑50μL混合，使用全自動血液凝固分析裝置〔Sysmex(株)制、商品名：CS-2100i〕測定APTT。再者，作為被檢血漿，使用正常血漿〔Sysmex(株)制的商品名：CoagtrolIX〕、正常血漿〔PrecisionBioLogicIncorporated制、商品名：CRYOcheckNormalReferencePlasma〕、異常血漿〔Sysmex(株)制的商品名：CoagtrolIIX〕、肝素添加血漿〔PrecisionBioLogicIncorporated制、商品名：CRYOcheckHeparinControl〕或陽性對照〔PrecisionBioLogicIncorporated制、商品名：CRYOcheckLupusPositiveControl〕。另外，作為第1試劑，使用實施例13、14、15或比較例2的試劑。作為第2試劑，使用25mM氯化鈣水溶液。APTT的測定對于各被檢血漿各進行2次。結(jié)果示于表5?！颈?】異常血漿〔Sysmex(株)制的商品名：CoagtrolIIX〕及肝素添加血漿〔PrecisionBioLogicIncorporated制、商品名：CRYOcheckHeparinControl〕各自的APTT的規(guī)格范圍通常是60～100秒鐘。從表5所示的結(jié)果得知，在使用實施例13～15中得到的試劑時，異常血漿〔Sysmex(株)制的商品名：CoagtrolIIX〕及肝素添加血漿〔PrecisionBioLogicIncorporated制、商品名：CRYOcheckHeparinControl〕各自的APTT與通常的APTT的規(guī)格范圍同樣地是60～100秒鐘。另外，含聚乙烯醇化合物的試劑抑制用不含聚乙烯醇化合物的試劑(比較例2)確認的異常血漿的APTT的縮短及鞣花酸的沉淀。再者，通過對于規(guī)格范圍內(nèi)的APTT，得知使用一般的異常域?qū)φ諛悠?異常血漿)凝固時間測定時的精度管理是可能的。另外得知，在鞣花酸的沉淀和異常血漿的APTT的縮短現(xiàn)象之間有因果關(guān)系。從而，從這些結(jié)果得知，實施例13～15中得到的試劑在實施熱處理時也可確保充分的靈敏度，并且長期保存穩(wěn)定性優(yōu)良。(實施例16、比較例3～5)(1)試劑調(diào)制將表6所示的緩沖液成分、活化劑、金屬離子形成化合物、磷脂、聚乙烯醇化合物、添加劑及水混合成表6所示的組成，得到不含有酚的試劑(實施例16)。另外，將表6所示的緩沖液成分、活化劑、金屬離子形成化合物、磷脂、添加劑及水混合成表6所示的組成而得到試劑(比較例3)?！颈?】將市售的APTT測定用試劑〔SiemensHealthcareDiagnostics制、商品名：ACTIN-FS〕作為比較例4的試劑使用，將市售的APTT測定用試劑〔SiemensHealthcareDiagnostics制、商品名：ACTIN-FSL〕作為比較例5的試劑使用。(2)APTT的基準范圍的測定將被檢血漿50μL于30℃加溫1分鐘。接下來，將加溫后的被驗血漿和第1試劑50μL混合。將得到的混合物于37℃加溫3分鐘。將加溫后的混合物和第2試劑50μL混合，使用全自動血液凝固分析裝置〔Sysmex(株)制、商品名：CS-2100i〕測定APTT。再者，作為被檢血漿，使用正常血漿49個待測樣品。另外，作為第1試劑，使用實施例16、比較例3、4或5的試劑。作為第2試劑，使用25mM氯化鈣水溶液。APTT的測定對于各被檢血漿各進行1次。自APTT的測定值求出平均值、SD、基準范圍上限及基準范圍下限。結(jié)果示于表7?！颈?】實施例16(sec)比較例3(sec)比較例4(sec)比較例5(sec)平均值28.427.524.525.0SD1.71.51.51.6基準范圍下限(平均值-2.01SD)25.024.421.621.8基準范圍上限(平均值+2.01SD)31.830.527.428.2(3)第IX因子靈敏度試驗將正常血漿〔PrecisionBioLogicIncorporated制、商品名：CRYOcheckNormalReferencePlasma〕和IX因子缺乏血漿〔Sysmex國際試劑(株)制、商品名：第IX因子缺乏血漿〕混合成正常血漿/IX因子缺乏血漿(體積比)達3/7而得到被檢血漿。將被檢血漿50μL于30℃加溫1分鐘。接下來，將加溫后的被驗血漿和第1試劑50μL混合。將得到的混合物于37℃加溫3分鐘。將加溫后的混合物和第2試劑50μL混合，使用全自動血液凝固分析裝置〔Sysmex(株)制、商品名：CS-2100i〕測定APTT。再者，作為第1試劑，使用實施例16、比較例3、4或5的試劑。作為第2試劑，使用25mM氯化鈣水溶液。APTT的測定對于各被檢血漿各進行5次。自APTT的測定值求出APTT的平均值及APTT的平均值與平均基準范圍上限的差。APTT的平均值與平均基準范圍上限的差根據(jù)式(II)：[APTT的平均值與平均基準范圍上限的差]＝[平均基準范圍上限]-[APTT的平均值](II)求出。結(jié)果示于表8?！颈?】實施例16(sec)比較例3(sec)比較例4(sec)比較例5(sec)APTT的平均值32.929.927.826.5與基準范圍上限的差1.14-0.630.36-1.73從表8所示的結(jié)果得知，使用含鞣花酸和聚乙烯醇化合物的實施例16的試劑時，測定的APTT的平均值比基準范圍上限大。另外得知，實施例16的試劑中得到的APTT的平均值與基準范圍上限的差比比較例4的試劑中得到的APTT的平均值與基準范圍上限的差大。另一方面得知，在用不含聚乙烯醇化合物的比較例3及5的試劑時，測定的APTT的平均值比基準范圍上限小。認為APTT的平均值比基準范圍上限大表明可區(qū)分正常待測樣品和第IX因子7成缺損的待測樣品。從而得知，由含鞣花酸和聚乙烯醇化合物的APTT測定用試劑可以高靈敏度檢測IX因子。(參考例1、2、比較例6及7)將表9所示的緩沖液成分、活化劑、金屬離子形成化合物、磷脂、添加劑及水混合成表9所示的組成，得到不含有酚的試劑(參考例1及2)。參考例1的試劑是配合了作為鋅離子形成化合物的氯化鋅和作為鋁離子形成化合物的氯化鋁。另外，參考例2的試劑是配合了作為錳離子形成化合物的氯化錳和作為鋁離子形成化合物的氯化鋁?！颈?】將含銅離子形成化合物和鋁形成化合物的市售的APTT測定用試劑〔Sysmex(株)制、商品名：ThromboCheckAPTT-SLA〕作為比較例6的試劑使用，將含銅離子形成化合物的市售的APTT測定用試劑〔Sysmex(株)制、商品名：ThromboCheckAPTT〕作為比較例7的試劑使用。將被檢血漿50μL于30℃加溫1分鐘。接下來，將加溫后的被驗血漿和第1試劑50μL混合。將得到的混合物于37℃加溫3分鐘。將加溫后的混合物和第2試劑50μL混合，使用全自動血液凝固分析裝置〔Sysmex(株)制、商品名：CS-2100i〕測定APTT。再者，作為被檢血漿使用被檢血漿A〔Sysmex(株)制、商品名：CoagtrolI〕、或者被檢血漿B〔Sysmex(株)制的商品名：向CoagtrolI添加妥布霉素至其濃度成10μg/mL而得到的混合物〕。另外，作為第1試劑，使用參考例1、2、比較例6或7的試劑。作為第2試劑，使用25mM氯化鈣水溶液。自APTT的測定值，根據(jù)式(III)：[APTT比]＝[被檢血漿B的APTT]/[被檢血漿A的APTT](III)算出APTT比。將APTT的測定值示于表10、APTT比示于圖2。【表10】參考例1參考例2比較例6比較例7被檢血漿A的APTT(sec)28.929.125.926.5被檢血漿B的APTT(sec)31.832.131.566.7從表10及圖2所示的結(jié)果知，在用參考例1及2的試劑時，APTT比是1.1。與此相比，在用比較例6及7的試劑時，APTT比是1.2～2.5。APTT比的容許范圍通常是1.2。自這些結(jié)果得知，由參考例1及2的試劑可進一步抑制妥布霉素等的氨基糖苷系抗生物質(zhì)導(dǎo)致的APTT的過度的延長。從而，自這些結(jié)果提示，在含鞣花酸化合物和磷脂和聚乙烯醇化合物的APTT試劑中，在還配合鋅離子形成化合物或錳離子形成化合物和鋁離子形成化合物時，也與參考例1及2的試劑同樣地，可進一步抑制氨基糖苷系抗生物質(zhì)導(dǎo)致的APTT的過度的延長。當前第1頁1 2 3