專利名稱：可凝血酶活化的血纖溶酶原激活物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可凝血酶活化的血纖溶酶原激活物，治療血栓栓塞疾病的藥物，含這種血纖溶酶原激活物的藥物組合物和它們的用途。
組織血纖溶酶原激活物(t-PA)是一種由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的絲氨酸蛋白酶，它們催化血纖溶酶原向血纖溶酶的轉(zhuǎn)變并用于血纖維蛋白溶解的治療。
有許多t-PA變體和突變是眾所周知的，例如參見T.J.R.Harris(1987)和J.Krause(1988)的綜述文章。
此外，為了已知t-PA的作用原理，通過t-PA和血纖溶酶原激活物抑制劑I(PAI-1，一種得自絲氨酸蛋白酶抑制劑族的絲氨酸蛋白酶抑制劑)之間的相互作用來部分調(diào)節(jié)纖維蛋白的溶解作用。將PAI-1結(jié)合到t-PA上主要通過氨基酸296-302進(jìn)行。這些區(qū)域的突變降低了PAI-1對(duì)t-PA的抑制影響(E.L.Madison等人(1990))。為了了解PAI-1和t-PA的氨基酸區(qū)域296-302間的相互作用機(jī)理，人們進(jìn)行了大規(guī)模的試驗(yàn)(也參見E.L.Madison,《自然》339(1989)第721-723頁；R.V.Schohet,《血栓形成與止血法)》71(1994)第124-128頁；C.J.Refino,《血栓形成與止血法》70(1993)第313-319頁；N.F.Paoni,《蛋白質(zhì)工程》6(1993)第529-534頁和《血栓形成與止血法》70(1993)第307-312頁；W.F.Bennett,《生物化學(xué)》雜志266(1991)第5191-5201頁，D.Eastman,《生物化學(xué)》31(1992)第419-422頁)。
未修飾的人的t-PA(此外，特征在于t-PA)在血漿中存在的形式由527氨基酸組成并可通過血纖溶酶裂解成兩個(gè)鏈，該鏈然后又通過二硫化物橋結(jié)合在一起。A鏈(也稱為主(schwere)鏈)由四個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。指狀結(jié)構(gòu)域(氨基酸l-49)表示與纖連蛋白中指狀結(jié)構(gòu)相似。生長(zhǎng)-因子-結(jié)構(gòu)域(氨基酸50-86)在某些范圍內(nèi)與鼠和人的表皮生長(zhǎng)因子同源。Kringle結(jié)構(gòu)域(氨基酸87-261)在更大的范圍內(nèi)與第四個(gè)和第五個(gè)血纖溶酶原的Kringle結(jié)構(gòu)域同源。t-PA的指狀結(jié)構(gòu)域和Kringle-2-結(jié)構(gòu)域尤其是通過血纖蛋白包含在血纖蛋白結(jié)合和蛋白溶解活性的刺激中。t-PA的B-鏈(氨基酸276-527，蛋白酶結(jié)構(gòu)域)是一種絲氨酸蛋白酶，并主要與尿激酶和血纖溶酶的B-鏈同源(T.J.R.Harris(1987)和J.Krause(1988))。
t-PA的酶活性(血纖溶酶原對(duì)血纖溶酶的催化活性)在無血纖蛋白或血纖蛋白裂解產(chǎn)物的存在下較低，但是，在這種刺激劑的存在下可顯著地提高(約大于10個(gè)因子)。t-PA在體內(nèi)的作用機(jī)理例如在Kominger和Collen,《血栓形成與止血法》46(1981)第561-565頁中已有描述。t-PA使血纖溶酶原活化成血纖溶酶。血纖溶酶使血纖蛋白裂解成可溶的血纖蛋白裂解產(chǎn)物。通過血液中存在的蛋白酶/血纖溶酶，t-PA在氨基酸275(精氨酸)和276(異亮氨酸)之間進(jìn)行裂解，由此進(jìn)行活化。因此，通過半胱氨酸橋結(jié)合保留的鏈的兩部分。
通過血纖蛋白，血纖蛋白裂解產(chǎn)物的活性的可刺激性是t-PA的一個(gè)主要特征，該t-PA與另一個(gè)已知的血纖溶酶原激活物例如尿激酶或鏈激酶的t-PA是有區(qū)別。通過修飾t-PA的氨基酸序列可進(jìn)一步改善可刺激性。可刺激性的程度是在或不在血纖蛋白的存在下催化效率的比例(Kcat/Km)。Kcat是催化反應(yīng)的速度常數(shù)，而Km是米氏(Michael)常數(shù)。在修飾氨基酸292和/或305時(shí)，t-PA的可刺激性提高達(dá)19-81倍(E.L.Madison等人，《科學(xué)》262(1993))第419-421頁。
由USP5501853已知t-PA衍生物，它們?cè)诎被?72-280的區(qū)域內(nèi)，尤其在274-277的區(qū)域內(nèi)，另外在糖基位置(117-119和184-186)(Glykosylierungsstellen)的區(qū)域內(nèi)得到修飾。這種t-PA衍生物具有改進(jìn)的蛋白溶解活性和血纖溶酶原溶解活性，對(duì)于抑制具有降低的敏感性，對(duì)于血纖蛋白具有改進(jìn)的親合力和/或改進(jìn)的血纖溶酶原溶解活性的血纖蛋白依賴性。
Wen-Pin Yang等人在《生物化學(xué)》33(1994)第2306-2312頁中描述了可凝血酶活化的血纖溶酶原激活物。這種嵌合血纖溶酶原激活物(59D8-scu PA-t)由抗血纖蛋白抗體(59D8)的Fab片段和可凝血酶活化的低分子量單鏈尿激酶-血纖溶酶原激活物(scu PA-t)的C末端部分制備，它們通過氨基酸Phe-157和Lys-158的缺失，由低分子量單鏈尿激酶-血纖溶酶原激活物(scu PA)通過定點(diǎn)誘變而獲得。
K.N.Dawson等人在《生物化學(xué)》雜志269(1984)第15989-15992頁公開了一種血纖溶酶原突變體，它們通過凝血酶可活化。這些血纖溶酶原衍生物通過可凝血酶裂解的序列取代裂解位置的P3-,P2-和P1＇-氨基酸而獲得。
N.F.Paoni.等人在《蛋白質(zhì)工程》5(1992)第259-266頁中公開了在氨基酸區(qū)域296-299區(qū)的t-PA的修飾。借此，獲得改進(jìn)的血纖蛋白特異性。
USP5200340公開了可凝血酶活化的血纖溶酶原激活物，如此地進(jìn)行修飾使得它們含有用來活化的凝血酶裂解位置。進(jìn)一步進(jìn)行修飾使得在這種t-PA衍生物中，盡管生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域(EGF結(jié)構(gòu)域)可缺失，但是，必須保持血纖蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(指狀結(jié)構(gòu)域)和Kringle結(jié)構(gòu)。
由WO91/09118和WO94/10318已知，血纖溶酶原可通過將凝血酶的凝血酶裂解位置插入到血纖溶酶中進(jìn)行活化。因?yàn)樵谘獕K中含有凝血酶，所以這種活化主要在血塊上進(jìn)行。但是，這種方法的缺點(diǎn)在于必須向病人給藥大量的經(jīng)修飾的血纖溶酶原。
本發(fā)明的目的是提供使用一種改進(jìn)的血纖溶酶原激活物，這種激活物具有較高的特異性和有效性，能夠在體內(nèi)溶解血塊。
本發(fā)明的目的通過來源于人的組織血纖溶酶原激活物的血纖溶酶原激活物的下列修飾來實(shí)現(xiàn)(a)如此地進(jìn)行修飾使得血纖溶酶原激活物通過凝血酶可裂解并通過這種裂解轉(zhuǎn)變成雙鏈的形式，(b)如此地進(jìn)行修飾使得它們的酶原性(Zymogenitat)與人的t-PA相比至少大1.2個(gè)因子，優(yōu)選大于2個(gè)因子和(c)這種血纖蛋白的結(jié)合力要如此地降低，使得高于50％的血纖溶酶原激活物可進(jìn)入血塊中。
這種血纖溶酶原激活物在血塊上起特異作用，因此它們的副作用要比已知的血纖溶酶原激活物明顯地降低。
本發(fā)明的出發(fā)點(diǎn)是人的組織血纖溶酶原激活物的序列。因此，根據(jù)本發(fā)明，“來源于人的組織血纖溶酶原激活物”是指本發(fā)明的血纖溶酶原激活物的序列來源于人的血纖溶酶原激活物的序列。這表明在結(jié)構(gòu)上至少部分地保持了t-PA特性的結(jié)構(gòu)特征(結(jié)構(gòu)域)。例如結(jié)果表明本發(fā)明的血纖溶酶原激活物是可利用的，其中仍然保持了Kringel2和/或蛋白酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，并且另外可按本發(fā)明進(jìn)行修飾。同樣可能的是可進(jìn)一步保持結(jié)構(gòu)域并且通過氨基酸的缺失，突變和/或加入產(chǎn)生本發(fā)明的特征。氨基酸序列的改變可通過專業(yè)人員已知的方法例如定向誘變或PCR進(jìn)行。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，與人的組織血纖溶酶原激活物相比，如此地修飾本發(fā)明的血纖溶酶原激活物，使得本發(fā)明血纖溶酶原激活物的可裂解性通過血纖溶酶在氨基酸P1(275)和P1＇(276)之間降低。在本發(fā)明的血纖溶酶原激活物中，通過血纖溶酶使可裂解性有效地降低了10％或以上，更優(yōu)選20％或以上，特別優(yōu)選地50％或以上。因此無需完全保持可血纖溶酶的裂解性。尤其是，通過本發(fā)明血纖溶酶原激活物的可血纖溶酶裂解性，可改進(jìn)凝血酶的活化。
但是也優(yōu)選地是，應(yīng)如此地降低可裂解性，使得在體內(nèi)不再進(jìn)行與生理有關(guān)的裂解。借此可明顯地降低副作用。因此實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)凝血參數(shù)的分解(Abbau)明顯地得到削弱，并且如在已知的血纖溶酶原激活物中不會(huì)明顯地延長(zhǎng)出血時(shí)間。
可在一個(gè)體外試驗(yàn)中，測(cè)定通過血纖溶酶的可裂解性。因此，將具有提高量的血纖溶酶的血纖溶酶原激活物在25℃下溫育5分鐘，接著在具有12.5-15％丙烯酰胺的丙烯酰胺凝膠中根據(jù)血纖溶酶原激活物的量進(jìn)行SDS電泳(U.Kohnert等人，《蛋白質(zhì)工程》5(1992)第93-100頁)。
血纖溶酶原激活物的修飾可按以下的方式，以對(duì)于每個(gè)專業(yè)人員來說已知的方法進(jìn)行，使得在P1和P1＇之間(根據(jù)Schechter,J.和Berger A.,的命名法，《生物化學(xué)與物理研究通訊》27(1967)第157-162頁)不再進(jìn)行裂解或降低通過血纖溶酶的裂解。血纖溶酶裂解序列R275-I276(在單字母密碼中的氨基酸符號(hào))。例如，通過修飾一種或兩種氨基酸可提高或明顯降低通過血纖溶酶的可裂解性。
也可通過P4-P3＇位置(氨基酸272-278)的修飾來降低通過血纖溶酶的可裂解性。在這種情況下，最好將P2轉(zhuǎn)變成優(yōu)選不疏水的和/或非芳香族的氨基酸例如P。由此，令人驚奇地是除了降低可血纖溶酶的裂解性外，實(shí)現(xiàn)了凝血酶的可裂解性。
此外，優(yōu)選地遵守一個(gè)或多個(gè)下列的一般條件(P)P4任何氨基酸(但是不是P，如果P2是P，優(yōu)選是L,I,V)(Q)P3任何氨基酸(F)P2疏水的氨基酸(F,H,G,V,L,I,T,A或P，特別優(yōu)選P)(R)P1:R或K,優(yōu)選R(I)P1＇:V或I，優(yōu)選I(K)P2＇:V,L,I或K，優(yōu)選V(G)P3＇:G特別優(yōu)選地，將P4轉(zhuǎn)變成V,P2轉(zhuǎn)變成P,P2＇轉(zhuǎn)變成V。由此產(chǎn)生特別好的裂解位置(272-278)VQPRIVG。(序列NO:1)凝血酶裂解位置的插入也可按現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。但是，優(yōu)選地是在氨基酸264-288的區(qū)域內(nèi)插入相應(yīng)的突變。
向凝血酶引入親合力的t-PA的修飾也可通過環(huán)459-471，自溶環(huán)417-425和/或氨基酸Q475,K505和/或E506的修飾進(jìn)行。
對(duì)其底物來說，酶的特異性主要取決于裂解位置的序列(初級(jí)序列)。對(duì)于絲氨酸蛋白酶例如凝血酶和血纖溶酶來說，P1殘余物是主要的特定決定子?？烧郫B的蛋白底物的特異性也取決于酶(凝血酶或血纖溶酶)和底物(血纖溶酶原激活物)之間的特性接觸以及裂解位置的構(gòu)象和適應(yīng)性。因?yàn)檠w溶酶和凝血酶的初級(jí)特異性極為類似(根據(jù)精氨酸，在P1位置上兩種都裂解)，所以不再有另一種可能，為獲得血纖溶酶原激活物，其中通過血纖溶酶(血纖溶酶的可活化性)降低裂解并通過凝血酶(凝血酶的可活化性)保留裂解或基本上要比血纖溶酶的可活化性大(至少小2-10因子)但是，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過在酶和底物之間的二次結(jié)合位置上的修飾以及對(duì)活化環(huán)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力特性的修飾，可獲得這種特性。
優(yōu)選在降低可血纖溶酶的裂解性的同時(shí)，通過突變改變?cè)诨罨h(huán)中的初級(jí)特異性而在氨基酸264和288之間進(jìn)行插入凝血酶特異的裂解位置。對(duì)此，特別優(yōu)選地是上述突變?cè)趨^(qū)域272-277(P4-P2＇)內(nèi)進(jìn)行。
可通過適應(yīng)性的修飾和/或結(jié)合環(huán)的可接近性來提高可凝血酶的裂解性。此外，特別優(yōu)選地是修飾G265(突變引起適應(yīng)性降低)或R267(突變引起G265和E410之間鹽橋的改變或裂解)。同樣優(yōu)選地是在264和267之間的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行插入。特別優(yōu)選地是在S中修飾R267(D.Lamba等人，《分子生物》雜志258(1996)第117-135頁)。
一種可提高適應(yīng)性的突變是在S處改變R267，優(yōu)選與F處的P4,G處的P3和V處的P2＇的突變結(jié)合。
可通過二次特異結(jié)合位置的改變進(jìn)一步改進(jìn)可凝血酶的裂解性和特異性。此外，例如環(huán)459-471可完整或部分地缺失。這種環(huán)由下列氨基酸組成GDTRSGGPQANLH.(序列NO:2)優(yōu)選地，在這種環(huán)中，區(qū)域PQANLH(序列NO:3)完全或至少部分缺失(而且優(yōu)選保留H)或在它們的氨基酸序列中進(jìn)行改變。
優(yōu)選在氨基酸272-277的區(qū)域中使用下列序列GIPRIV(序列NO:4)AQPRIK(序列NO:5)同樣有利的是在265-277的氨基酸區(qū)域(t-PA原始序列GLRQYSQPQFRIK(序列NO:6))中，使用下列序列GLSQASQGIPRIV (序列NO:7)對(duì)于該區(qū)域，同樣優(yōu)選地是下列序列GLRQYSQAQGIPRIV (序列NO:8)在該序列中，將在Q和P(原始序列Q和F)之間插入氨基酸G和I以使其延長(zhǎng)。優(yōu)選地，這種插入可在264和276之間的區(qū)域內(nèi)在任何位置上進(jìn)行。
同樣特別優(yōu)選地是本發(fā)明的化合物，其中將裂解位置(序列NO:1)與一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選全部的F處的突變P4,G處的突變P3,P處的突變P2和V處的突變P2＇和S處的突變R267相結(jié)合。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，血纖溶酶原激活物含有另一個(gè)突變，其單鏈形式的活性，而不是雙鏈形式的活性顯著地降低，由此提高酶原性，使其達(dá)到約1.2因子，優(yōu)選為2因子或更高。
術(shù)語“酶原性”是指雙鏈形式活性和單鏈形式活性的商?；钚允酋０贩纸鉁y(cè)定的。使用這種血纖溶酶原激活物在明顯降低副作用的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)血栓溶解的高選擇性和有效性。在E.L.Madison等人《科學(xué)》262(1993)第419-421頁中描述了合適和優(yōu)選的單鏈形式的突變。
為提高酶原性(血纖溶酶原激活物的雙鏈形式的酰胺分解活性與單鏈形式的酰胺分解活性的比例)，特別優(yōu)選地是(也對(duì)于所有的血纖溶酶原激活物，它們是由人的組織血纖溶酶原激活物產(chǎn)生的)修飾Q處的K429和/或T處的H417和/或阻止或破壞在K429和H417之間的相互作用。
特別優(yōu)選的本發(fā)明的化合物含有裂解位置(272-278)VQPRIVG(SEQ ID NO:1)，它們?cè)赒處具有另外的突變K429和/或在T處的突變H417。
血纖蛋白結(jié)合的降低可這樣進(jìn)行，使對(duì)血纖蛋白結(jié)合呈特異性的t-PA結(jié)構(gòu)域(血纖蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，指狀結(jié)構(gòu)域)缺失或如此進(jìn)行突變，以使血纖蛋白的結(jié)合不是通過指狀結(jié)構(gòu)域進(jìn)行或者僅在小范圍內(nèi)進(jìn)行(不起作用的指狀結(jié)構(gòu)域)。通過這種血纖蛋白結(jié)合的降低，實(shí)現(xiàn)了可將血纖溶酶原激活物滲透到血塊中(優(yōu)選50％以上)并且分布均勻。在那兒，它們通過凝血酶發(fā)生裂解并使它們的活性以活化雙鏈的形式顯示。一種按這種方式降低其血纖蛋白結(jié)合的血纖溶酶原激活物對(duì)于t-PA不再具有典型的高親合力的血纖蛋白結(jié)合。通過這種特異的作用方式，血纖溶酶原激活物的能力增強(qiáng)，并且尤其是明顯地降低了副作用?？梢砸环N體外模型來確定本發(fā)明血纖溶酶原激活物在血塊中的滲透。肉眼觀察確定血塊滲透的程度和在血塊中的分布。為了進(jìn)行判斷，使用USP5223256中公開的滲透到血塊中分布均勻的血纖溶酶原激活物作為標(biāo)準(zhǔn)，并由此按定義將該值定為100％(在濃度為3μg/ml時(shí)進(jìn)行測(cè)定)。使用EP-B0093619的重組體人的組織血纖溶酶原激活物作為另一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，按定義不是滲透到血塊中，而是基本上結(jié)合到表面上。為了研究血塊的滲透，在實(shí)施例3c中描述了該過程。與該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比表明“未滲透到血塊中”是指絕大部分(80％或以上)的血纖溶酶原激活物位于血塊的四分之一位置上，而“均勻分布”是指至少50％的血纖溶酶原激活物進(jìn)一步地滲透到血塊中，并且因此在剩余的四分之三位置中定位。
當(dāng)使用本發(fā)明的血纖溶酶原激活物時(shí)，還可進(jìn)一步提高溶解凝結(jié)物的特異性和有效性，沒有或僅有極少量的非特異血纖蛋白的結(jié)合。這種分子滲透到凝血的內(nèi)部，從而使人們擔(dān)心血纖溶酶原對(duì)血塊中的血纖溶酶的有效活化。這種血纖溶酶原激活物例如基于t-PA的蛋白酶結(jié)構(gòu)域(WO96/17928)或基于一種物質(zhì)，這種物質(zhì)主要含有Kringle2-結(jié)構(gòu)域和蛋白酶結(jié)構(gòu)域作為t-PA結(jié)構(gòu)域，而不含指狀結(jié)構(gòu)域作為t-PA結(jié)構(gòu)域(WO90/09437,USP5223256,EP-B0297066,EP-B0196920)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的血纖溶酶原激活物另外還進(jìn)行如此地修飾，以使它們不是通過PAI-1來抑制的。一種這樣的修飾優(yōu)選通過突變氨基酸296-302(Madison,E.L.等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(1990)第3530-3533頁)，特別優(yōu)選通過由AAAA交換氨基酸296-299(KHRR)(WO96/01312)而進(jìn)行。
本發(fā)明的化合物是溶血栓活化蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)優(yōu)選與t-PA(Alteplase)不同，適合于以靜脈內(nèi)大丸劑注射液的形式給藥。它們?cè)趧┝枯^少時(shí)是有效的并且實(shí)際上具有相同的溶血栓作用，例如Alteplase臨床常用的輸注。
提高特異性和與此有關(guān)的降低出血副作用使得可將本發(fā)明的化合物變成對(duì)用于治療所有血栓栓塞疾病的極有價(jià)值的溶血栓藥。與迄今僅在最威脅生命的疾病如心肌梗塞和大面積肺栓塞容許的溶血栓藥不同，利用這種變體開辟了在輕度急性威脅生命的疾病例如深度腿靜脈血栓形成中也使用本發(fā)明的化合物進(jìn)行溶血栓的可能性。此外，現(xiàn)在可比以往更多地使用基于本發(fā)明化合物溶血栓藥，因?yàn)閷?duì)于更寬的應(yīng)用來說，主要的阻礙原因是存在出血并發(fā)癥的危險(xiǎn)。對(duì)此無關(guān)，本發(fā)明的化合物具有優(yōu)點(diǎn)，也可在急性疾病如心肌梗塞形成或肺栓塞中使用。
可根據(jù)專業(yè)人員常用的方法，在真核細(xì)胞或原核細(xì)胞中進(jìn)行本發(fā)明中所使用的血纖溶酶原激活物的制備方法。優(yōu)選采用基因工藝制備本發(fā)明的化合物。例如在WO90/09437,EP-A0297066,EP-A0302456,EP-A0245100和EP-A0400545中已公開了這種方法，這些文件公開的主題是這種制備方法。可通過“寡核苷酸的定點(diǎn)特異誘變”在t-PA或其衍生物的cDNA中插入突變。例如Zoller和Smith(1984)，根據(jù)T.A.Kunkel(1985)和Morinaga等人(1984)的修飾，描述了“定點(diǎn)特異誘變”。同樣適用的是PCR誘變法，例如Ausubel等人(1991)描述了該方法。
如果在適用于所使用的寄主細(xì)胞的表達(dá)載體中有核酸存在，那么按該方法獲得的核酸起表達(dá)本發(fā)明中使用的血纖溶酶原激活物的作用。
另外還可修飾本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸序列。這種修飾的實(shí)例是改變核酸序列，以便插入減少連接、克隆和誘變步驟的限制酶的不同的識(shí)別序列，改變核酸序列，以便構(gòu)建對(duì)于寄主細(xì)胞的優(yōu)選的密碼子，在附加的調(diào)節(jié)元件和轉(zhuǎn)錄元件周圍補(bǔ)充核酸序列，以便使在寄主細(xì)胞中的表達(dá)達(dá)到最佳。
所有其它的適于表達(dá)載體的制備和表達(dá)的方法步驟是現(xiàn)有技術(shù)并對(duì)專業(yè)人員是已知的。例如Sambrook等人在《分子克隆》的“在大腸桿菌中克隆基因的表達(dá)”中描述了這種方法實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(1989),Cold Spring Harbor實(shí)驗(yàn)出版社，美國紐約。
本發(fā)明所使用的糖基化的血纖溶酶原激活物的制備是在真核寄主細(xì)胞中進(jìn)行的。本發(fā)明所使用的非糖基化的血纖溶酶原激活物的制備也是在真核寄主細(xì)胞中進(jìn)行的(其中必須將首先獲得的糖基化產(chǎn)物通過專業(yè)人員常用的方法脫糖基化)或者優(yōu)選通過在非糖基化的寄主細(xì)胞中，特別優(yōu)選在原核寄主細(xì)胞中表達(dá)來進(jìn)行。
例如，將大腸桿菌，鏈酶菌素或枯草芽胞桿菌用作原核宿主生物體。為了制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)，按常規(guī)方法發(fā)酵原核細(xì)胞，在細(xì)菌分解后，按常規(guī)方法分離蛋白質(zhì)。如果蛋白質(zhì)以失活的形式(包含體)沉淀的話，那么按照專業(yè)人員已知的方法進(jìn)行溶解和天然化(naturiert)。同樣可按專業(yè)人員已知的方法，從微生物中分泌出作為活化蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。對(duì)此適用的表達(dá)載體優(yōu)選含有在使用的宿主細(xì)胞中適合于蛋白質(zhì)分泌的信號(hào)序列和編碼蛋白質(zhì)的核酸序列。在這種情況下，用這種載體表達(dá)的蛋白質(zhì)在培養(yǎng)基(在革蘭氏陽性菌時(shí))中或者在胞質(zhì)間隙(在革蘭氏陰性菌時(shí))中分泌。在信號(hào)序列和用于編碼本發(fā)明t-PA衍生物的序列之間含有適當(dāng)?shù)挠糜诰幋a裂解位置的序列，它們?cè)诩庸r(shí)或通過用蛋白酶處理允許蛋白質(zhì)裂解。
插入到用來編碼本發(fā)明血纖溶酶原激活物的DNA序列中的基礎(chǔ)載體的選擇取決于以后表達(dá)所使用的宿主細(xì)胞。合適質(zhì)粒以及對(duì)這種質(zhì)粒提出的最低要求(例如復(fù)制源，限制片段位置)是專業(yè)人員已知的。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，也可將一種質(zhì)粒調(diào)整成噬菌體(λ,M13)的復(fù)制雙股形式的粘?；蚴褂闷渌鼘I(yè)人員已知的載體。
在原核生物中制備本發(fā)明的血纖溶酶原激活物時(shí)，優(yōu)選不進(jìn)行分泌，由溶解細(xì)胞顆粒分離形成的包含體，在還原條件下通過用變性劑進(jìn)行處理，溶解含血纖溶酶原激活物的包含體，接著用GSSG進(jìn)行衍生，通過添加GSH和非變性濃縮物形式的變性劑或L精氨酸來復(fù)性血纖溶酶原激活物。EP-A0219874和EP-A0241022公開了活化t-PA和由包含體衍生的這類方法。但是，也可使用從包含體獲得活化蛋白質(zhì)的其它方法。
純化本發(fā)明血纖溶酶原激活物的過程優(yōu)選在L精氨酸的存在下進(jìn)行，精氨酸的濃度優(yōu)選為10-1000mmol/l。
異種蛋白的分離優(yōu)選通過親和色譜，特別優(yōu)選通過一種固定在ETI(刺酮屬胰蛋白酶抑制劑)上的吸附柱進(jìn)行。例如使用Sepharose作為載體材料。通過ETI吸附柱進(jìn)行純化的優(yōu)點(diǎn)是甚至在有如此高的精氨酸濃度例如0.8mol/l的存在下可裝填直接由濃縮復(fù)性添加劑而獲得的ETI吸附柱材料。優(yōu)選地，在0.6-0.8mol/l精氨酸的存在下，通過ETI吸附柱純化本發(fā)明的血纖溶酶原激活物。在這種情況下，所使用的溶液具有的pH優(yōu)選大于7，特別優(yōu)選在7.5-8.6的范圍內(nèi)。
既可以在精氨酸的存在下，也可以不在精氨酸的存在下，通過降低pH從ETI柱中洗脫本發(fā)明的血纖溶酶原激活物。優(yōu)選地，使pH值落在酸性范圍內(nèi)，特別優(yōu)選地pH為4.0-5.5。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含本發(fā)明溶血栓活化蛋白質(zhì)的藥物組合物，其中優(yōu)選起唯一溶血栓活性作用結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)含有蛋白酶結(jié)構(gòu)域和必要時(shí)含有人的組織血纖溶酶原激活物的Kringel2-結(jié)構(gòu)域。
為了進(jìn)行治療，按專業(yè)人員已知的方法配制本發(fā)明使用的血纖溶酶原激活物，其中通常將本發(fā)明的化合物與一種可藥用載體相結(jié)合進(jìn)行使用。這種組合物含有通常的有效量的按體重計(jì)0.1-7mg/kg，優(yōu)選0.7-5mg/kg，特別優(yōu)選1-3mg/kg的劑量。這種治療用的組合物通常以無菌水溶液或無菌可溶解的干制劑例如凍干物的形式存在。組合物通常含有適量的可藥用鹽，用等滲溶液制得。此外，可使用緩沖劑例如精氨酸緩沖劑，磷酸鹽緩沖劑以穩(wěn)定合適的pH值(優(yōu)選5.5-7.5)。本發(fā)明化合物劑量的增加通過每個(gè)專業(yè)人員無需進(jìn)一步的測(cè)定即可確定。例如，它們?nèi)Q于施用的種類(灌注或大丸劑)和治療的周期。根據(jù)它們延長(zhǎng)的半衰期(有關(guān)的體內(nèi)分解)，本發(fā)明的化合物特別適用于大丸劑施用(一倍大丸劑，多倍大丸劑)。一種大丸劑施用的合適形式的實(shí)例是安瓿，含有25-1000mg本發(fā)明的化合物，一種改進(jìn)血纖溶酶原激活物溶解性的物質(zhì)(例如精氨酸)和緩沖劑。優(yōu)選靜脈內(nèi)施用，但是也可皮下，肌內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)施用。同樣可以注入本發(fā)明的血纖溶酶原激活物或局部施用。
可將本發(fā)明的化合物作為多倍大丸劑(優(yōu)選作為雙倍大丸劑)施用。合適的時(shí)間間隔為20-180分鐘，優(yōu)選的時(shí)間間隔為30-90分鐘，特別優(yōu)選的時(shí)間間隔為30-60分鐘。此外，作為灌注時(shí)，一次劑量的時(shí)間間隔為1小時(shí)到2天。
本發(fā)明的化合物特別適合于治療所有血栓栓塞疾病例如急性心肌梗塞，腦梗塞，肺栓塞，深度腿靜脈血栓形成和急性動(dòng)脈阻塞等。特別優(yōu)選地是施用本發(fā)明的化合物治療亞慢性血栓栓塞疾病，其中必須進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的血栓溶解。
優(yōu)選地將本發(fā)明的化合物與一種凝塊抑制劑(抗凝血?jiǎng)?例如肝素和/或血小板聚集作用的抑制劑結(jié)合施用，由此在減小副作用的同時(shí)增強(qiáng)血管的擴(kuò)展作用。抗凝血?jiǎng)┑囊淮谓o藥劑量可與本發(fā)明化合物的一次給藥劑量同時(shí)進(jìn)行或者不同時(shí)進(jìn)行。同樣優(yōu)選地是添加使血液流通的物質(zhì)或改善微循環(huán)的物質(zhì)。
下面的實(shí)施例，公開物，序列記錄和附圖用于說明本發(fā)明，其保護(hù)范圍由權(quán)利要求書確定。可借助于實(shí)施例來理解所述方法，對(duì)實(shí)施例的一些改變也落入本發(fā)明的范圍。
此外，術(shù)語“r-PA”是指重組體的血纖溶酶原激活物，它們由人的t-PA的結(jié)構(gòu)域K2和P組成。例如，USP5223256公開了這種血纖溶酶原激活物的制備方法。
術(shù)語“r-PA(F274P,K277V)”是指在由結(jié)構(gòu)域K2和P組成的血纖溶酶原激活物中，用氨基酸P代替氨基酸274(F)，用氨基酸V代替氨基酸277(K)(類似于T.J.Harris(1987)的氨基酸符號(hào))。


圖1是血漿-血塊滲透模型和裂解模型的附圖。為了避免滿足碎片(Scherbe anspruchung)所引起的血漿凝固，通過緩沖劑室(畫影線的區(qū)域)產(chǎn)生壓力。可通過引入一種Blasenfalle來避免通過血塊而使緩沖劑與血漿的混合(加點(diǎn)區(qū)域)。1緩沖儲(chǔ)器；2蠕動(dòng)泵；3:Blasenfalle；4用于纖維蛋白溶解藥的注射器；5帶血塊的吸管尖(交叉陰影線區(qū)域)；6軟管夾頭；7壓力構(gòu)件。
圖2示出了r-PA(F274P,K277V)(A)或r-PA(B)通過凝血酶的裂解。(詳文參見實(shí)施例8)圖3示出了r-PA(F274P,K277V)(A)或r-PA(B)通過血纖溶酶的裂解。(詳文參見實(shí)施例9)圖4示出了r-PA(P272V,F274P,K277V)(A)通過凝血酶的裂解。(詳文參見實(shí)施例10)實(shí)施例1本發(fā)明化合物重組體的制備a)表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)EP0382174中公開的原始質(zhì)粒pA27fd含有下列組分tac啟動(dòng)子，具有ATG起始密碼子的lac操縱基因區(qū)域，由Kringle2結(jié)構(gòu)域和蛋白酶結(jié)構(gòu)域和fd轉(zhuǎn)錄終止子組成的用于t-PA-突變蛋白的編碼區(qū)域。原始載體是質(zhì)粒pkk223-3。
為了進(jìn)行突變，主要采用Morinaga等人《生物工藝學(xué)》(1984)第636頁的方法進(jìn)行。為了形成異源雙鏈，從pA27fd中分離出兩種合適的片段(例如片段A大的BamHI片段，片段B帶有PvuI的線性化載體)。
表1列出了所使用的寡核苷酸和由此產(chǎn)生的突變。
將異源雙鏈添加物與質(zhì)粒pUBS520一起轉(zhuǎn)化成大腸桿菌(Brinkmann等人，《基因》85(1989)第109頁)。通過向培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素和卡那霉素(分別50μg/ml)來選擇轉(zhuǎn)化。
分別由添加物產(chǎn)生的質(zhì)粒同樣示于表1中。b)在大腸桿菌中的表達(dá)為了測(cè)試表達(dá)效率，在氨芐青霉素和卡那霉素(分別50μg/ml)的存在下，在LB介質(zhì)(Sambrook等人，1989,《分子克隆》Cold Spring Harbor)中用各種質(zhì)粒(參見表1)和pUBS520培養(yǎng)大腸桿菌直到在550nm處的OD為0.4。通過添加5mmol/l IPTG開始表達(dá)。進(jìn)一步溫育培養(yǎng)物4小時(shí)。在這之后，通過離心收集大腸桿菌細(xì)胞，并再次懸浮到緩沖液(50mmol/lTris-HCl pH8,50mmol/l EDTA)中；通過超聲波作用引起細(xì)胞裂解。通過再次離心，收集未溶解的蛋白質(zhì)部分，并通過超聲波作用再次懸浮到上述緩沖液中。向懸浮液中加入1/4體積的培養(yǎng)緩沖液(Auftragspuffer)(250mmol/lTris-HCl pH6.8,10mmol/l EDTA,5％SDS,5％巰基乙醇，50％甘油和0.005％溴酚蘭)，并用12.5％SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分析。用一種具有大腸桿菌(含有未用IPTG誘導(dǎo)的各種質(zhì)粒)培養(yǎng)物的相同制劑作為對(duì)照物，并在凝膠中進(jìn)行分離。在IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的制劑中，在用考馬斯籃R250(溶解在30％甲醇和10％乙酸中)染色凝膠后，識(shí)別分子量約為40kD的明顯條帶；在對(duì)照物制劑中沒有這種帶存在。
EP-A0382174的實(shí)施例2和3中公開了制備相應(yīng)活化化合物的其它步驟。
表1
1)序列NO:92)序列NO:103)序列NO:114)序列NO:12實(shí)施例2體內(nèi)表征為了檢測(cè)本發(fā)明蛋白質(zhì)的溶血栓的能力和有效性，使用由D.Coolen(《臨床檢查》雜志71(1983)第368-376頁)建立的頸靜脈血栓溶解的家兔模型。在這種情況下，在動(dòng)物的頸靜脈中產(chǎn)生放射性標(biāo)記的血栓。對(duì)動(dòng)物皮下給藥100IU/kg肝素，進(jìn)行抗凝固試驗(yàn)。向家兔靜脈內(nèi)給藥Alteplase(重組體的野生型組織血纖溶酶原激活物，“t-PA”為德國，比貝臘赫，Thomae公司的市售產(chǎn)品，商標(biāo)為Actilyse)，實(shí)施例1中公開的蛋白質(zhì)，鏈激酶(德國，馬爾堡，Behring公司市售的產(chǎn)品，商標(biāo)為Streptase)或溶劑(0.2M精氨酸磷酸鹽緩沖液)。
靜脈內(nèi)一次給藥1mg/kg溶劑的大丸劑注射液，得到空白對(duì)照劑組。靜脈內(nèi)給藥總劑量為1.45mg/kg，得到Alteplase組，其中開始時(shí)的大丸劑注射量為0.2mg/kg,30分鐘時(shí)的灌注量為0.75mg/kg,60分鐘時(shí)直接進(jìn)行的持續(xù)灌注量為0.5mg/kg(總灌注時(shí)間90分鐘)。靜脈灌注給藥64000IU/kg達(dá)60分鐘得到鏈激酶組。靜脈一次給藥大丸劑注射液得到本發(fā)明的蛋白質(zhì)組。對(duì)于Alteplase和鏈激酶來說，這些是眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則。
在開始治療后2小時(shí)，除去剩余的血栓，借助于血栓中放射活性的降低測(cè)定的血栓溶解的程度。為了獲得血漿，采集治療前和治療開始后2小時(shí)的血樣。采用標(biāo)準(zhǔn)方法確定活化凝血致活酶的時(shí)間。此外，根據(jù)溶血栓治療來定量血液損失。對(duì)此，在向動(dòng)物給藥溶血栓藥前，用模板和解剖刀在動(dòng)物的股上切出長(zhǎng)4cm，深0.3cm的皮膚切口。因此產(chǎn)生的血通過自然凝固至停止。在開始治療后，在傷口上放置海綿，用它來抽吸由血栓溶解新產(chǎn)生血的血。通過稱重海綿(扣除本身重量后)，測(cè)定產(chǎn)生的血量并由此說明出血的副作用。
Alteplase和實(shí)施例1的本發(fā)明的蛋白質(zhì)都是溶血栓的高活化物質(zhì)，與溶劑對(duì)照物相比，它們顯著地溶解了血栓。實(shí)施例3血塊溶解活性的對(duì)比a)進(jìn)行血塊溶解測(cè)定在血塊溶解測(cè)定中，測(cè)定t-PA和實(shí)施例1重組的蛋白質(zhì)的活性。
通過添加緩沖劑(0.06M Na2HPO4,pH7.4,5mg/ml BSA(牛血清白蛋白),0.01％Tween80)，將試樣調(diào)節(jié)到各種所需的蛋白質(zhì)濃度。將1ml人的血纖蛋白原溶液(IMCO)(2mg/ml 0.006M Na2HPO4,pH7.4,0.5mg/mlBSA,0.01％Tween80)加入到0.1ml試樣中，在37℃下保溫5分鐘。接著，分別加入100μl血纖溶酶原溶液(10IU/ml 0.06M Na2HPO4/H3PO4,pH7.4,0.5mg/ml BSA,0.01％Tween80)和凝血酶溶液(30U/ml 0.06M Na2HPO4,pH7.4,0.5mg/ml BSA,0.01％Tween80)，重新在37℃下保溫試驗(yàn)添加物。在2分鐘后，在血纖蛋白血塊上放置Telflon球，直到該球已經(jīng)到達(dá)試驗(yàn)小管的底部停止時(shí)間。b)測(cè)定動(dòng)態(tài)血漿模型中的活性在該動(dòng)態(tài)血漿模型中，在極接近體內(nèi)條件的條件下，試驗(yàn)本發(fā)明的物質(zhì)。將該物質(zhì)通過血塊，在通過心搏動(dòng)引起的類似實(shí)際壓力的壓力作用下加入到血漿中。
將200μl檸檬酸鹽血漿與20μl 0.25mol/l CaCl2溶液混合，在37℃下保溫。加入0.16U凝血酶并將混合物加入到1ml吸管尖(Eppendorff，漢堡，BRD)中。將吸管尖在23℃下垂直貯存2分鐘，在0.01mol/l Tris/HCl,pH7.4,0.15mol/l NaCl2,0.025mol/l CaCl2,0.01％Tween80中保溫60分鐘，并將它們加入到血塊溶解裝置中。在一個(gè)由彈性軟管組裝的分段系統(tǒng)(圖1)中測(cè)定血塊溶解活性。通過一個(gè)蠕動(dòng)泵形成流量，并分成兩個(gè)平行的支路。支路A包括有用來密封支路并裝有血漿血塊的1ml吸管尖。支路B是與支路A平行隱性導(dǎo)管。借助于軟管夾頭將支路B中的壓力調(diào)節(jié)到10毫巴。向血塊上添加血漿(1ml)。關(guān)閉泵，測(cè)定各種血塊的穩(wěn)定性達(dá)15分鐘。借助于1ml結(jié)核菌素注射器，用肌內(nèi)注射的皮下針(Braun,Melsungen,BRD)小心地向血漿中注射纖維蛋白溶解藥(實(shí)施例1蛋白質(zhì)或CHO-t-PA的血漿最終濃度在0.5-10-20μg/ml之間)。血塊溶解時(shí)間按添加纖維蛋白溶解酶和添加纖維蛋白溶解藥前壓降達(dá)50％之間的時(shí)間差來計(jì)算。借助于水校正的壓電壓力識(shí)別系統(tǒng)測(cè)定壓力，并借助于依賴計(jì)算機(jī)的軟件程序表示。c)在靜態(tài)模型中血塊的滲透將800μl人的檸檬酸鹽血漿(健康的供體)與75μl的Ca緩沖劑(50mmol/l Tris/HCl,pH7.2,0.25mol/l CaCl2),20μl在0.9％NaCl的明膠溶液(10％w/v)和100ml凝血酶溶液(8U/ml,0.05mol/l檸檬酸鈉/HCl,pH6.5,0.15mol/lNaCl)混合。將800μl的這種混合物小心地轉(zhuǎn)移到2ml柱(Pierce,Rockfort,IL,USA)中。通過在37℃下保溫3小時(shí)形成血漿塊。用首先用Glu-Gly-Arg-氯甲基酮抑制血纖溶酶原激活物，并將2ml緩沖劑(0.008mol/lNa2HPO4,0.001mol/l KH2PO4,0.003mol/l KCl,0.137mol/l NaCl,0.1％牛血清白蛋白，0.01％Tween80)與之混合以調(diào)節(jié)到所需濃度(0,0.5,1.2和3μl/ml)，將1ml這種溶液涂在血塊的表面上。丟棄剩余的緩沖劑。用2mlPBS緩沖劑(0.008mol/l Na2HPO4,0.001mol/l KH2PO4,0.003mol/l KCl和0.137mol/l NaCl)洗滌血塊的表面，通過添加2ml PBS的戊二醛溶液固定蛋白質(zhì)。接著用2ml 50mmol/l Tris/HCl,pH8.0洗滌血塊表面，用1ml過氧化物酶標(biāo)記的多克隆抗體對(duì)t-PA(250mU/ml)進(jìn)行溫育。在用1ml PBS洗滌血塊后，通過用3-氨基-9-乙基咔唑溫育，測(cè)定抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)，通過過氧化物酶將它們轉(zhuǎn)變成難溶的紅色。
本發(fā)明的血纖溶酶原激活物不是集中在血塊的表面上，而是滲透到血塊中，并且均勻分布。血塊的免疫染色部分的強(qiáng)度隨著血漿中本發(fā)明血纖溶酶原激活物濃度的增加而增加。實(shí)施例4血纖蛋白結(jié)合的對(duì)比在該實(shí)施例中，對(duì)實(shí)施例1溶血栓活化蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行測(cè)試，以便將其結(jié)合到血纖蛋白上，還將有關(guān)的這種特性與Alteplase進(jìn)行對(duì)比。
以1.5μg蛋白質(zhì)/ml溶液的形式制備Alteplase和本發(fā)明蛋白質(zhì)的試樣。接著將溶血栓活化蛋白質(zhì)的試樣(100μl)分別與770μl緩沖劑(0.05MTris/HCl,pH7.4,0.15NaCl,0.01％Tween80),10μl牛血清白蛋白溶液(100mg/ml),10μl抑肽酶(3.75mg/ml),10μl牛凝血酶(濃度100U/ml)和提高量的血纖蛋白原(10μg/ml-300μg/ml)混合。所有溶液都是水性的。眾所周知，凝血酶將血纖蛋白原轉(zhuǎn)變成難溶的血纖蛋白血塊。
將這些組分混合，在37℃下保溫1小時(shí)。接著通過離心分離(15分鐘，13000UPM,4℃下)從血纖蛋白血塊中分離出上清液，通過標(biāo)準(zhǔn)的ELISA測(cè)定上清液中存在的血纖溶酶原激活物蛋白質(zhì)的量。實(shí)施例5血纖溶酶原溶解活性和可刺激性的對(duì)比Verheijen等人在《血栓形成與止血法》48(1982)第266-269頁中公開了測(cè)定血纖溶酶原溶解活性的可刺激性的一種已知方法。
在室溫下，用70％v/v氨基酸中的氰基溴化物(1g人的血纖蛋白原，100ml的1.3gCNBr水溶液)處理人的血纖蛋白原17小時(shí)，接著用蒸餾水進(jìn)行透析而制備起刺激劑作用的血纖蛋白原片段。
在進(jìn)行測(cè)定時(shí)，在含0.1％v/v Tween80,0.13μmol/l Glu-血纖溶酶原，0.3mmol底物S2251(顯色底物H-D-Val-Leu-Lys-對(duì)硝基N-酰苯胺HCl)和120μg/ml血纖蛋白原片段的1ml 0.1mol/1 Tris/HCl(pH7.5)中溫育5ng/nlt-PA或當(dāng)量濃度的實(shí)施例1的蛋白質(zhì)。將混合物在25℃下保溫2小時(shí)，與作為對(duì)照物的空白試驗(yàn)值相比較而測(cè)定沒有反應(yīng)間歇時(shí)405nm處的吸收率。測(cè)定顯色底物S2251的裂解作為衡量酶的血纖溶酶原溶解的活性?？纱碳ば园囱w蛋白原片段的活性除以沒有血纖蛋白原片段的活性來計(jì)算。
將相應(yīng)地用0.1mol/lTris,pH7.5,0.15％Tween80稀釋的各25μl試樣移液到微量滴定板的“孔”中。接著加入200μl試劑混合物，測(cè)定與空白試驗(yàn)值相比在2小時(shí)間隔中的405nm處的消光(25μl,0.1mol/lTris,pH7.5，0.15％Tween80,200μl試劑混合物)。
EBVt=2小時(shí)后的試劑空白試驗(yàn)值
EBV0=時(shí)間點(diǎn)t=0時(shí)的試劑空白試驗(yàn)值試劑混合物5ml試驗(yàn)緩沖劑(0.1mol/l Tris,pH7.5,0.15％Tween80)1ml t-PA刺激劑(1mg/ml人血纖蛋白原的溴氰基片段)1ml底物溶液(3mmol/l S2251,H-D-Val-Leu-Lys-pNA；顯色劑，Moelndal,SE)1ml血纖溶酶原溶液(7U/ml血纖溶酶原，Boehringer Mannheim GmbH)刺激因子的計(jì)算為計(jì)算刺激因子，用有t-PA刺激劑的存在下的活性除以無t-PA刺激劑的活性。應(yīng)分別進(jìn)行稀釋使得在兩種制劑中，達(dá)到基本上相同的消光。沒有t-PA刺激劑的反應(yīng)混合物中加入1mlH2O以代替1mlt-PA刺激劑，以相同的方式，不僅測(cè)定無刺激劑時(shí)的活性，而且也測(cè)定有刺激劑存在時(shí)的活性。按下式計(jì)算刺激因子F
特異活性是血纖溶酶原溶解活性(KU/ml)和蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)的商。實(shí)施例6組織血纖溶酶原激活物的實(shí)施例1的重組體蛋白質(zhì)的大丸劑注射液在冠狀動(dòng)脈血栓形成的狗模型中誘導(dǎo)起作用和安全的血栓溶解在左心臟冠狀動(dòng)脈的由電刺激誘導(dǎo)的血栓形成的狗模型中評(píng)價(jià)在大腸桿菌中產(chǎn)生的實(shí)施例1蛋白質(zhì)的血栓溶解。實(shí)施例7酰胺分解活性的測(cè)定為了測(cè)定酰胺分解活性，將200ml緩沖劑(0.1mol/l Tris/HCl,pH7.5,0.15％Tween80)和200μl血纖溶酶原激活物溶液(用緩沖劑稀釋至濃度為1-12μg/ml)的混合物在37℃下保溫5分鐘。添加200μlS2288(6mmol/l，H-D-Ile-Pro-Arg-P-硝基苯胺二鹽酸化物，Kabi Vitrum，瑞典)開始進(jìn)行測(cè)定。在37℃時(shí)預(yù)平衡S2288底物。在對(duì)-硝基苯胺的消光系數(shù)為9750l/mol/cm時(shí)，由第一個(gè)2.5分鐘內(nèi)在405nm處的消光的增加計(jì)算酰胺分解的活性。實(shí)施例8r-PA(F274P,K277V)通過凝血酶的裂解1．實(shí)施分別將44μgr-PA(F274P,K277V)和p-PA(參照物)在37℃下預(yù)保溫15分鐘，并且與同樣在37℃下預(yù)保溫15分鐘下述單位人的凝血酶(Sigma)混合并在37℃保溫30分鐘。接著以1∶1(v/v)的比例，將試樣與SDS試樣緩沖劑(0.125mol/l Tris/HCl,pH8.8,4.6％(w/v)SDS,4mol/l尿素，0.1％溴酚蘭，0.3mol/l二硫赤蘚醇)混合，在95℃下保溫3分鐘，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。2．結(jié)果圖2示出了r-PA(F274P,K277V)通過凝血酶的裂解。數(shù)據(jù)表明通過提高凝血酶的量可完全將r-PA(F274P,K277V)裂解成雙鏈形式。通過凝血酶裂解的r-PA(F274P,K277V)蛋白酶結(jié)構(gòu)域和Kringle2-結(jié)構(gòu)域和通過血纖溶酶-消化產(chǎn)生的r-PA(r-PA(tc))雙鏈形式的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域有相同高度上。
與r-PA(F274P,K277V)(A)不同，在下列所述條件下作為參照物的一起進(jìn)行的r-PA(B)不通過凝血酶來裂解。A刺激物1分子量標(biāo)準(zhǔn)*刺激物2: r-PA刺激物3: r-PA(tc)**刺激物4: r-PA(F274P,K277V)刺激物5: r-PA(F274P,K277V)+凝血酶緩沖劑刺激物6: r-PA(F274P,K277V)+0.055NIH單位凝血酶刺激物7: r-PA(F274P,K277V)+0.55NIH單位凝血酶刺激物8: r-PA(F274P,K277V)+2.74NIH單位凝血酶刺激物9凝血酶(5NIH單位)刺激物10分子量標(biāo)準(zhǔn)*B刺激物1分子量標(biāo)準(zhǔn)*刺激物2: r-PA刺激物3: r-PA(tc)**刺激物4: r-PA+凝血酶緩沖劑刺激物5: r-PA+0.055NIH單位凝血酶刺激物6: r-PA+0.55NIH單位凝血酶刺激物7: r-PA+2.74NIH單位凝血酶刺激物8凝血酶(5NIH單位)刺激物9分子量標(biāo)準(zhǔn)**)分子量標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶(14.307Da)，大豆-胰蛋白酶抑制劑(20.100Da)，磷酸丙糖異構(gòu)酶(26.626Da)，醛縮酶(39.212Da)，谷氨酸脫氫酶(55.562Da)，果糖-6-磷酸鹽-激酶(85.204Da),β-半乳糖苷酶(116.353Da),α-2-巨球蛋白(170.000Da)。**)r-PA(tc)通過用血纖溶酶溫育r-PA獲得的r-PA的雙鏈形式。實(shí)施例9r-PA(F274P,K277V)通過血纖溶酶的裂解1．實(shí)施分別將25μgr-PA(F274P,K277V)和r-PA(參照物)在37℃下預(yù)保溫15分鐘，并且與同樣在37℃下預(yù)保溫15分鐘下述單位人的凝血酶(人)混合并在37℃下保溫10分鐘。接著以1∶1(v/v)的比例，將試樣與SDS試樣緩沖劑(0.125mol/l Tris/HCl,pH8.8,4.6％(w/v)SDS,4mol/l尿素，0.1％溴酚蘭，0.3mol/l二硫赤蘚醇)混合，在95℃下保溫4分鐘，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。2．結(jié)果圖3示出了r-PA(F274P,K277V)(A)和作為參照物一起進(jìn)行的r-PA(B)通過凝血酶的裂解。
數(shù)據(jù)表明通過用提高量的凝血酶進(jìn)行溫育可將r-PA(B)轉(zhuǎn)變成雙鏈形式。在應(yīng)用條件下，通過25mU血纖溶酶可將使用量的r-PA完全轉(zhuǎn)變成雙鏈形式。
與此相反，r-PA(F274P,K277V)(A)通過血纖溶酶的裂解明顯差。在用0.025U和0.1U血纖溶酶進(jìn)行溫育時(shí)，沒有明顯地觀察到r-PA(F274P,K277V)通過血纖溶酶的裂解。在用25mU血纖溶酶溫育25μgr-PA(F274P,K277V)時(shí)，未進(jìn)行完全的裂解。
通過凝血酶裂解的r-PA(F274P,K277V)的蛋白酶結(jié)構(gòu)域和Kringle2-結(jié)構(gòu)域和通過用血纖溶酶瓊脂糖凝膠消化產(chǎn)生的r-PA(r-PA(tc))雙鏈形式的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域有相同高度，以致得出變體的裂解如同在氨基酸275和276之間的r-PA時(shí)所進(jìn)行的(根據(jù)Harris，《蛋白質(zhì)工程》1,449-458(1987))。A刺激物1分子量標(biāo)準(zhǔn)*刺激物2: r-PA刺激物3: r-PA(tc)**刺激物4: r-PA(F274P,K277V)刺激物5: r-PA(F274P,K277V)+0.25mU血纖溶酶刺激物6: r-PA(F274P,K277V)+2.5mU血纖溶酶刺激物7: r-PA(F274P,K277V)+12.5mU血纖溶酶刺激物8: r-PA(F274P,K277V)+25mU血纖溶酶B刺激物1分子量標(biāo)準(zhǔn)*刺激物2: r-PA刺激物3: r-PA(tc)**刺激物4: r-PA+0.25mU血纖溶酶刺激物5: r-PA+2.5mU血纖溶酶刺激物6: r-PA+12.5mU血纖溶酶刺激物7: r-PA+25mU血纖溶酶*)分子量標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶(14.307Da)，大豆-胰蛋白酶抑制劑(20.100Da)，磷酸丙糖異構(gòu)酶(26.626Da)，醛縮酶(39.212Da)，谷氨酸脫氫酶(55.562Da)，果糖-6-磷酸鹽-激酶(85.204Da),β-半乳糖苷酶(116.353Da),α-2-巨球蛋白(170.000Da)。**)r-PA(tc)通過用血纖溶酶-瓊脂糖溫育r-PA獲得的r-PA的雙鏈形式。實(shí)施例10r-PA(P272V,F274P,K277V)通過凝血酶的裂解1．實(shí)施將40μgr-PA(P272V,F274P,K277V)在37℃下預(yù)保溫15分鐘，并且與同樣在37℃下預(yù)保溫15分鐘下述單位的牛凝血酶(Sigma)混合并在37℃下保溫10分鐘。接著以1∶1(v/v)的比例，將試樣與SDS試樣緩沖劑(0.125mol/l Tris/HCl,pH8.8,4.6％(w/v)SDS,4mol/l尿素，0.1％溴酚蘭，0.3mol/l二硫赤蘚醇)混合，在95℃下保溫3分鐘，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。2．結(jié)果圖4示出了r-PA(P272V,F274P,K277V)通過凝血酶的裂解。數(shù)據(jù)表明通過提高凝血酶的量可完全將r-PA(P272V,F274P,K277V)裂解成雙鏈形式。通過凝血酶裂解的r-PA(P272V,F274P,K277V)的蛋白酶結(jié)構(gòu)域和Kringle2-結(jié)構(gòu)域和通過血纖溶酶-消化產(chǎn)生的r-PA(r-PA(tc))雙鏈形式的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域有相同高度上。刺激物1分子量標(biāo)準(zhǔn)*刺激物2: r-PA刺激物3: r-PA(tc)**刺激物4: r-PA(P272V,F274P,K277V)刺激物5: r-PA(P272V,F274P,K277V)+凝血酶緩沖劑刺激物6: r-PA(P272V,F274P,K277V)+0.055NIH單位凝血酶刺激物7: r-PA(P272V,F274P,K277V)+0.55NIH單位凝血酶刺激物8: r-PA(P272V,F274P,K277V)+2.74NIH單位凝血酶刺激物9分子量標(biāo)準(zhǔn)**)分子量標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶(14.307Da)，大豆-胰蛋白酶抑制劑(20.100Da)，磷酸丙糖異構(gòu)酶(26.626Da)，醛縮酶(39.212Da)，谷氨酸脫氫酶(55.562Da)，果糖-6-磷酸鹽-激酶(85.204Da),β-半乳糖苷酶(116.353Da),α-2-巨球蛋白(170.000Da)。**)r-PA(tc)通過用血纖溶酶溫育r-PA獲得的r-PA的雙鏈形式。參考文獻(xiàn)Ausubel等人，“分子生物學(xué)中的目前草案”，第2卷，第15章(GreenePubl.Associates & Wiley Interscience 1991)Bennett,W.F.,《生物化學(xué)》雜志266(1991)5191-5201Brinkmann等人，《基因》85(1989)109Dawson,K.N.等人，《生物化學(xué)》雜志269(1984)15989-15992Eastman,D.,《生物化學(xué)》31(1992)419-422EP-A0219874EP-A0241022EP-A0245100EP-A0302456EP-A0382174EP-A0400545EP-B0196920EP-B0297066Harris,T.J.R.,《蛋白質(zhì)工程》1(1987)449-459Kohnert,U.等人《蛋白質(zhì)工程》5(1992)93-100Kominger和Collen,《血栓形成和止血法》46(1981)561-565Krause,《血纖蛋白溶解》雜志2(1988)133-142Kunkel,T.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82(1985)488-492Lamba,D.等人《分子生物》雜志258(1996)117-135Madison,E.L.等人《科學(xué)》262(1993)419-421Madison,E.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(1990)3530-3533Madison,E.L.等人，《自然》339(1989)721-723Morinaga等人，《生物工程學(xué)》21(1984)634Paoni,N.F.等人，《蛋白質(zhì)工程》5(1992)259-266Paoni,N.F.等人，《蛋白質(zhì)工程》6(1993)529-534Paoni,N.F.等人，《血栓形成與止血法》70(1993)307-312Refino,C.J.,《血栓形成與止血法》70(1993)313-319Sambrook等人，“克隆基因在大腸桿菌中的表達(dá)”《分子克隆》試驗(yàn)手冊(cè)(1989)Cold Spring Harbor實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，美國
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序列記錄(1)一般數(shù)據(jù)(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名Boehringer Mannheim GMBH(B)街Sandhofer街116(C)地區(qū)曼海姆(E)國家德國(F)郵編D-68305(G)電話08856/60-3446(H)電傳08856/60-3451(ⅱ)發(fā)明名稱可凝血酶活化的血纖溶酶原激活物(ⅲ)序列數(shù)目12(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀的內(nèi)含(A)數(shù)據(jù)載體軟盤(B)計(jì)算機(jī)可兼容的IBM PC(C)驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentin Release#1.0,Version#1.30B(EPA)(ⅵ)原申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朎P96112487.2(B)申請(qǐng)日02.08.1996(2)序列NO:1的數(shù)據(jù)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度7氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈的形式單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子種類肽(ⅹⅰ)序列描述序列NO:1:Val Gln Pro Arg Ile Val Gly1 5(2)序列NO:2的數(shù)據(jù)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度13氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈的形式單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子種類肽(ⅹⅰ)序列描述序列NO:2:Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His1 5 10(2)序列NO:3的數(shù)據(jù)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度6氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈的形式單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子種類肽(ⅹⅰ)序列描述序列NO:3:Pro Gln Ala Asn Leu His1 5(2)序列NO:4的數(shù)據(jù)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度6氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈的形式單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子種類肽(ⅹⅰ)序列描述序列NO:4:Gly Pro Arg Ile Val1 5(2)序列NO:5的數(shù)據(jù)
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度6氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈的形式單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子種類肽(ⅹⅰ)序列描述序列NO:5:Ala Gln Pro Arg Ile Lys1 5(2)序列NO:6的數(shù)據(jù)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度13氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈的形式單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子種類肽(ⅹⅰ)序列描述序列NO:6:Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys1 5 10(2)序列NO:7的數(shù)據(jù)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度13氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈的形式單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子種類肽(ⅹⅰ)序列描述序列NO:7:Gly Leu Ser Gln Ala Ser Gln Gly Ile Pro Arg Ile Val1 5 10(2)序列NO:8的數(shù)據(jù)(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈的形式單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子種類肽(ⅹⅰ)序列描述序列NO:8:Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Ala Gln Gly Ile Pro Arg Ile Val1 5 10 15(2)序列NO:9的數(shù)據(jù)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度38堿基對(duì)(B)種類核苷酸(C)鏈的形式單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子種類其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列描述序列NO:9:GTACAGCCAG GTTCAGCCTC GCATCGTTGG AGGGCTCT(2)序列NO:10的數(shù)據(jù)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度53堿基對(duì)(B)種類核苷酸(C)鏈的形式單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子種類其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列描述序列NO:10:CTGCGGCCTG AGCCAGTACA GCCAGTTTGG CCCTCGCATCGTTGGAGGGC TCT(2)序列NO:11的數(shù)據(jù)(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度23堿基對(duì)(B)種類核苷酸(C)鏈的形式單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子種類其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列描述序列NO:11:GGAGCGGCTG CAGGAGGCTC ATG(2)序列NO:12的數(shù)據(jù)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23堿基對(duì)(B)種類核苷酸(C)鏈的形式單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子種類其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列描述序列NO:12:CTACGGCAAG ACCGAGGCCT TGT
權(quán)利要求
1．來源于人的組織血纖溶酶原激活物的血纖溶酶原激活物，它按下列方式進(jìn)行修飾(a)如此進(jìn)行修飾，使得血纖溶酶原激活物通過凝血酶可裂解并通過這種裂解轉(zhuǎn)變成雙鏈的形式，(b)如此進(jìn)行修飾，使得其酶原性與人的血纖溶酶原激活物相比至少大1.2因子和(c)該血纖蛋白結(jié)合力如此地降低，以使高于50％的血纖溶酶原激活物可滲透到血塊中。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的血纖溶酶原激活物，其特征在于，它是如此進(jìn)行修飾以使得通過血纖溶酶的可裂解性在氨基酸P1(275)和P1＇(276)之間降低10％以上，優(yōu)選降低20％以上。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的血纖溶酶原激活物，其特征在于，它們均勻地滲透到血塊中。
4．根據(jù)權(quán)利要求1-3的血纖溶酶原激活物，其特征在于，它在G264和A288之間的氨基酸區(qū)域如此修飾，以使得血纖溶酶原激活物通過凝血酶可裂解。
5．根據(jù)權(quán)利要求1-4的血纖溶酶原激活物，其特征在于，修飾氨基酸區(qū)域459-471,417-425和/或氨基酸Q475,K505和/或E506。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-5的血纖溶酶原激活物，其特征在于，修飾氨基酸G265和/或R267和/或在264和267之間的區(qū)域內(nèi)插入至少一種氨基酸。
7．根據(jù)權(quán)利要求1-6的血纖溶酶原激活物，其特征在于，缺失指狀結(jié)構(gòu)域。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的血纖溶酶原激活物，其特征在于，所述血纖溶酶原激活物僅含有蛋白酶結(jié)構(gòu)域或Kringle2-結(jié)構(gòu)域和人的組織血纖溶酶原激活物的蛋白酶結(jié)構(gòu)域。
9．權(quán)利要求1-8的血纖溶酶原激活物的用途，用來制備用于治療血栓栓塞疾病的藥物組合物。
10．重組體制備權(quán)利要求1-8血纖溶酶原激活物的方法，其特征在于，用能夠表達(dá)所述組織血纖溶酶原激活物的載體轉(zhuǎn)化真核或原核寄主細(xì)胞，培育該細(xì)胞并分離所述血纖溶酶原激活物。
11．含治療有效量的權(quán)利要求1-8血纖溶酶原激活物和必要時(shí)的藥物助劑，填料或添加劑的藥物組合物。
全文摘要
血纖溶酶原激活物(t－PA)具有改進(jìn)的血纖蛋白特異性和降低的副作用,它們按下列方式進(jìn)行修飾:(a)如此地進(jìn)行修飾使得血纖溶酶原激活物通過凝血酶可裂解并通過這種裂解轉(zhuǎn)變成雙鏈的形式,(b)如此地進(jìn)行修飾使得它們的酶原性與人的t－PA相比因子至少大于1.2和(c)這種血纖蛋白的結(jié)合力如此地降低,使得高于50%的血纖溶酶原激活物可滲透到血塊中。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1226926SQ97196933
公開日1999年8月25日 申請(qǐng)日期1997年7月21日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月2日
發(fā)明者烏爾里克·科納特, 斯蒂芬·費(fèi)希爾 申請(qǐng)人:貝林格爾曼海姆股份有限公司