本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)研發(fā)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測蛋白在聚合物溶液中的混合均勻度的方法。
背景技術(shù)：
：將藥物或其他蛋白粉末均勻地混合于聚合物水溶液在藥物制劑、醫(yī)療器械、以及其他高分子功能材料的設(shè)計與開發(fā)中是保證產(chǎn)品質(zhì)量的重要一環(huán)。如何在制備過程中及時而快速地檢測粉末混合的均勻度關(guān)乎整個生產(chǎn)工藝的效率。目前，一些用于粉末在黏度較大的聚合物溶液中混合的攪拌裝置，如所謂自轉(zhuǎn)公轉(zhuǎn)攪拌機(jī)等見于市場，但是，對攪拌過程進(jìn)行跟蹤檢測的快速方法仍然缺位。本發(fā)明在這一點(diǎn)上提供了方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測蛋白在聚合物溶液中的混合均勻度的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明的第一方面，提供一種快速檢測蛋白粉末在聚合物水溶液中的混合均勻度方法，其步驟包括：(1)在含有蛋白的聚合物水溶液的不同部位取樣品；(2)將步驟(1)所取樣品溶于非蛋白等電點(diǎn)的pH值水溶液或緩沖液，制備成樣品溶液；(3)將步驟(2)獲得的樣品溶液采用紫外分光光度計進(jìn)行測量，獲得樣品溶液在紫外光下的吸收值；(4)將所測得的吸收值與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，得出蛋白濃度。優(yōu)選地，步驟(1)包括：將含有蛋白的聚合物水溶液以中間平面分割，位于所述中間平面上部的為表層，位于所述中間平面下部的為深層；在表層的四個象限區(qū)各取樣品；并將含有蛋白的聚合物水溶液以在容器中所處位置劃分，分別在中心區(qū)和邊緣區(qū)各取樣品。優(yōu)選地，步驟(2)中，所述非蛋白等電點(diǎn)的pH值水溶液或緩沖液包括：高于或低于蛋白等電點(diǎn)的pH值水溶液或緩沖液。優(yōu)選地，步驟(3)中，采用紫外分光光度計進(jìn)行測量時，將樣品溶液置于紫外分光光度計的測試皿中。進(jìn)一步地，所述測試皿可以是不同容量的比色皿，也可以是酶標(biāo)儀的多孔板。本發(fā)明的實(shí)施例中，所述蛋白選自胰島素。所述胰島素選自豬胰島素或賴脯胰島素。步驟(3)中，所述所述紫外光的波長范圍是274～280nm。所述聚合物水溶液選自聚合物微針膠體。所述聚合物微針膠體的制備原料包括：聚乙烯醇、羥甲基纖維素鈉、葡聚糖。含有胰島素的聚合物微針膠體的制備方法，包括：1)聚乙烯醇水溶液的制備：按需要的濃度，將聚乙烯醇與水混合，室溫充分溶脹后，攪拌下加熱，直至澄明；2)羥甲基纖維素鈉和葡聚糖水溶液的制備：按需要的濃度，將羥甲基纖維素鈉和葡聚糖，與水混合，輕輕攪拌，直至澄明；3)聚合物微針膠體的制備：按需要的濃度，將聚乙烯醇水溶液、羥甲基纖維素鈉和葡聚糖水溶液、以及胰島素粉末，放置一體，攪拌混勻，獲得含有胰島素的聚合物微針膠體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明提供一種快速檢測聚合物溶液中蛋白粉末混合均勻度的方法，涉及到藥物或其蛋白粉末在聚合物制劑或其他聚合物溶液中混合均勻度的快速檢測和質(zhì)量控制。本發(fā)明在聚合物與蛋白粉末混合后，采用科學(xué)的取樣、溶出方法，并利用紫外分光光度計在最佳波長條件下實(shí)現(xiàn)快速檢測。結(jié)果顯示反應(yīng)體系的吸光值隨濃度的變化呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。檢測結(jié)果重復(fù)性好，檢測下限足夠低，靈敏度高，穩(wěn)定性好，成本低，污染小，可廣泛應(yīng)用于實(shí)驗室和工業(yè)生產(chǎn)質(zhì)量控制。附圖說明圖1：豬胰島素水溶液在采用紫外分光光度計在200～400nm波長下全掃描結(jié)果。圖2：實(shí)施例1中標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3：實(shí)施例2中標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點(diǎn)以及兩個端點(diǎn)之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。實(shí)施例1快速檢測豬胰島素相轉(zhuǎn)化聚合物微針膠體中胰島素分布的均勻性一、樣品的制備：聚乙烯醇水溶液的制備：按需要的濃度，將聚乙烯醇(CAS9002-89-5)與水混合，室溫充分溶脹后，攪拌下加熱至攝氏95度以上，直至澄明，備用。羥甲基纖維素鈉和葡聚糖水溶液的制備：按需要的濃度，將羥甲基纖維素鈉(CAS9004-32-4)和葡聚糖(CAS9004-54-0)，與水混合，輕輕攪拌，直至澄明，備用。聚合物微針膠體的制備：按需要的濃度，將聚乙烯醇水溶液、羥甲基纖維素鈉和葡聚糖水溶液、以及胰島素粉末，放置一體，攪拌混勻，獲得聚合物微針膠體，備用。二、取樣：將聚合物微針膠體以中間平面分割，位于所述中間平面上部的為表層，位于所述中間平面下部的為深層。在表層的四個象限區(qū)各取一個樣品，分別記為樣品1～4；在深層的四個象限區(qū)各取一個樣品，分別記為樣品5～8。此外，將聚合物微針膠體以在容器中所處位置劃分，分別在中心區(qū)取四個樣品，分別記為樣品9～12；在邊緣區(qū)任取四個樣品，分別記為樣品13～16。三、含量測定：將所獲得的16個樣品分別加入一定比例的非蛋白等電點(diǎn)的pH值水溶液(pH2、pH3、pH4、pH8、pH9、pH10、pH11、pH12)，使完全溶解，制備成樣品溶液。用非蛋白等電點(diǎn)的pH值水溶液(pH2、pH3、pH4、pH8、pH9、pH10、pH11、pH12)分別配置需要的豬胰島素水溶液、聚乙烯醇水溶液、羥甲基纖維素鈉水溶液、葡聚糖水溶液、以及不含豬胰島素的空白聚合物微針膠體水溶液。將上述各水溶液再分別采用紫外分光光度計在200～400nm波長下全掃描。如圖1所示，豬胰島素水溶液在200～400nm范圍內(nèi)有吸收峰，276～280nm為吸收峰值。而其他聚乙烯醇水溶液、羥甲基纖維素鈉水溶液、葡聚糖水溶液、以及不含豬胰島素的空白聚合物微針?biāo)芤涸?74～280nm幾乎無吸收或吸收值很低，對聚合物微針膠體中豬胰島素的測量干擾不大。表1羥甲基纖維素鈉12345678最佳波長下掃描(A)0.0040.00450.0060.00750.0120.0160.0210.0235溶液濃度(ug/ml)25.551.1102.1204.3408.6612.9817.21021.5表2葡聚糖12345678最佳波長下掃描(A)0.0010.0020.0050.0090.01750.02650.03650.048溶液濃度(ug/ml)25.050.1100.1200.2400.4600.5800.71000.9表3聚乙烯醇123456最佳波長下掃描(A)0.0070.0060.0070.0090.0120.019溶液濃度(ug/ml)330150300600900如表1～表3所示，在300ug/ml的濃度下，干擾物質(zhì)的吸收值均小于0.01，且小于目標(biāo)物質(zhì)豬胰島素在相同濃度下吸收值的1/30。由于本發(fā)明旨在跟蹤蛋白在聚合物溶液中分布的均勻性，對干擾物質(zhì)限制低，所以選擇274～280nm為檢測波長。如圖2所示，反應(yīng)體系的吸光值隨濃度的變化呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。表4豬胰島素12345678最佳波長下掃描(A)0.0340.0560.1090.2010.3910.5910.7790.963溶液濃度(ug/ml)24.449.298.4196.8393.6590.4787.2984如表4所示，實(shí)驗得檢測限為：25ug/ml。上述溶液用高效液相，在274～280nm波長下檢測，所得結(jié)果和紫外分光光度法進(jìn)行對比。表5豬胰島素樣品1樣品2樣品3樣品4取樣量(mg)134.78130.22136.39136.46UV測含量(ug)5189529452225352HPLC測含量(ug)5211530153305363如表5所示，HPLC與UV測量結(jié)果最大差值比為2.02％，在可接受范圍內(nèi)。相對于常用檢測方法HPLC而言，本發(fā)明所需時間更短，1分鐘內(nèi)可完成(HPLC需要兩小時以上)；本發(fā)明所需溶劑全部為安全性水溶液，用量為5ml左右，相對HPLC所需大量的有機(jī)溶劑，污染更小。此外，將所得16個樣品溶液采用紫外分光光度計在274～280nm波長下掃描，測量其中的胰島素含量。比較來自不同部位的各樣品中胰島素含量的差別，判斷胰島素在聚合物微針膠體中分布的均勻性。表6如表6所示，可知本實(shí)施例的聚合物微針膠體中胰島素的分布情況，最大分布差異百分比(最大值與最小值之差/最大值)為3.04％。在可接受范圍內(nèi)。最大分布差異百分比是指最大值和最小值之差占最大值的百分比例。該比例越小，表明胰島素在聚合物微針膠體中分布地越均勻。實(shí)施例2快速檢測賴脯胰島素相轉(zhuǎn)化聚合物微針膠體中胰島素分布的均勻性一、樣品的制備：聚乙烯醇水溶液的制備：按需要的濃度，將聚乙烯醇(CAS9002-89-5)與水混合，室溫充分溶脹后，攪拌下加熱至攝氏95度以上，直至澄明，備用。羥甲基纖維素鈉和葡聚糖水溶液的制備：按需要的濃度，將羥甲基纖維素鈉(CAS9004-32-4)和葡聚糖(CAS9004-54-0)，與水混合，輕輕攪拌，直至澄明，備用。聚合物微針膠體的制備：按需要的濃度，將聚乙烯醇水溶液、羥甲基纖維素鈉和葡聚糖水溶液、以及胰島素粉末，放置一體，攪拌混勻，獲得聚合物微針膠體，備用。二、取樣：將聚合物微針膠體以中間平面分割，位于所述中間平面上部的為表層，位于所述中間平面下部的為深層。在表層的四個象限區(qū)各取一個樣品，分別記為樣品1～4；在深層的四個象限區(qū)各取一個樣品，分別記為樣品5～8。此外，將聚合物微針膠體以在容器中所處位置劃分，分別在中心區(qū)取四個樣品，分別記為樣品9～12；在邊緣區(qū)任取四個樣品，分別記為樣品13～16。三、含量測定：將所獲得的16個樣品分別加入一定比例的非蛋白等電點(diǎn)的pH值水溶液(pH2、pH3、pH4、pH8、pH9、pH10、pH11、pH12)，使完全溶解，制備成樣品溶液。用非蛋白等電點(diǎn)的pH值水溶液(pH2、pH3、pH4、pH8、pH9、pH10、pH11、pH12)分別配置需要的賴脯胰島素水溶液、聚乙烯醇水溶液、羥甲基纖維素鈉水溶液、葡聚糖水溶液、以及不含賴脯胰島素的空白聚合物微針膠體水溶液。將上述各水溶液在分別采用紫外分光光度計在200～400nm波長下全掃描，結(jié)果賴脯胰島素水溶液在200～400nm范圍內(nèi)有吸收峰，276～280nm為吸收峰值。而其他聚乙烯醇水溶液、羥甲基纖維素鈉水溶液、葡聚糖水溶液、以及不含賴脯胰島素的空白聚合物微針?biāo)芤涸?74～280nm幾乎無吸收或吸收值很低，對聚合物微針膠體中賴脯胰島素的測量干擾不大。所以選擇274～280nm為檢測波長。如圖3所示，反應(yīng)體系的吸光值隨濃度的變化呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。此外，將所得樣品溶液采用紫外分光光度計在274～280nm波長下掃描，測量其中的胰島素含量。比較來自不同部位的各樣品中胰島素含量的差別，判斷胰島素在聚合物微針膠體中分布的均勻性。表7如表7所示，可知本實(shí)施例的聚合物微針膠體中胰島素的分布情況，最大分布差異百分比(最大值與最小值之差/最大值)為2.20％。在可接受范圍內(nèi)。最大分布差異百分比是指最大值和最小值之差占最大值的百分比例。該比例越小，表明胰島素在聚合物微針膠體中分布地越均勻。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對上述實(shí)施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3