本發(fā)明屬于藥物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體來(lái)說(shuō)，涉及到一種溴芬酸鈉滴眼液有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：溴芬酸鈉是2-氨基-3-苯甲?；揭宜犷?lèi)衍生物，其結(jié)構(gòu)與酮洛芬和雙氯芬酸類(lèi)似，能抑制環(huán)氧合酶介導(dǎo)的前列腺素類(lèi)炎癥介質(zhì)的合成，是最有效的環(huán)氧合酶抑制劑之一，具有強(qiáng)力消炎鎮(zhèn)痛作用，作用強(qiáng)度是其它的非甾體抗炎藥(NSAIDs)的10倍。藥理實(shí)驗(yàn)顯示,溴芬酸鈉對(duì)花生四烯酸、角叉菜膠所致的大鼠實(shí)驗(yàn)性急性結(jié)膜浮腫有抗炎作用；幾乎完全抑制家兔前房穿刺后激光照射所致的房水蛋白濃度增加。日本已于2000年批準(zhǔn)Senju公司溴芬酸鈉滴眼液上市，商品名為XibromTM，規(guī)格為5ml:5mg，臨床用于外眼部及前眼部的炎癥性疾病的對(duì)癥治療：眼瞼炎、結(jié)膜炎、強(qiáng)膜炎(包括上強(qiáng)膜炎)、術(shù)后炎癥等。溴芬酸鈉滴眼液在放置的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生降解雜質(zhì)，而影響產(chǎn)品的質(zhì)量。這幾個(gè)雜質(zhì)即藥物質(zhì)量控制中的有關(guān)物質(zhì)，對(duì)于溴芬酸鈉滴眼液控制的雜質(zhì)主要有三個(gè)：雜質(zhì)1：2-氨基-3-(4-溴代苯甲?；?苯甲酸、雜質(zhì)2：2-氨基-3-(4-溴代苯甲?；?苯甲酰甲酸、雜質(zhì)3：7-(4-溴代苯甲酰基)吲哚啉-2,3-二酮。對(duì)與降解產(chǎn)生的有關(guān)物質(zhì)，在制劑中需要進(jìn)行質(zhì)量控制的，因此，實(shí)現(xiàn)溴芬酸鈉與其有關(guān)物質(zhì)的分離與分析，對(duì)于溴芬酸鈉滴眼液的質(zhì)量控制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種分離度好，專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高的溴芬酸鈉滴眼液有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法。本發(fā)明所述的一種溴芬酸鈉滴眼液有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，所述測(cè)定方法具體步驟為：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱或N-氧化石松堿M鍵合硅膠柱，以磷酸鹽緩沖液-乙腈為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為250-280nm，柱溫為10-30℃，流速為0.8-3ml/min，進(jìn)樣量為20-70uL。本發(fā)明所述的一種溴芬酸鈉滴眼液有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，所述柱溫為室溫；所述檢測(cè)波長(zhǎng)為266nm；本發(fā)明所述的一種溴芬酸鈉滴眼液有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，所述流速為調(diào)節(jié)溴芬酸鈉的出峰時(shí)間為18min；所述進(jìn)樣量為60uL。本發(fā)明所述的一種溴芬酸鈉滴眼液有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，所述洗脫梯度：時(shí)間(分鐘)流動(dòng)相A(％)流動(dòng)相B0100020.1100060.1109060.21000801000其中所述的流動(dòng)相A為磷酸鹽緩沖液:乙腈＝75:25；流動(dòng)相B為磷酸鹽緩沖液-乙腈＝30:70；所述磷酸鹽緩沖液為取磷酸氫二銨2.64g，加水溶解并稀釋至1000ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.3所得。本發(fā)明所述的一種溴芬酸鈉滴眼液有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，所述N-氧化石松堿M鍵合硅膠柱的制備步驟為：1)取20g活化的硅膠于500mL三口瓶中，再量取100mL甲苯和40mL的γ-氨丙基三乙氧基硅烷，120℃下油浴，攪拌回流13h，待冷卻后，產(chǎn)物依次用甲苯，乙醇洗滌抽濾至無(wú)膠狀物存在；在60℃下干燥24h，干燥箱內(nèi)冷卻；2)在500mL的單口瓶中加入步驟1)的產(chǎn)物，然后依次加入120mL35％的甲醛溶液和2mL的乙酸溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h，經(jīng)無(wú)水乙醇抽濾后，置于500mL三口瓶中備用；取N-氧化石松堿M4g溶于適量水溶液中，調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，加入上述三口瓶中，60℃攪拌下反應(yīng)10h；待產(chǎn)物冷卻，依次用大量二次水、無(wú)水乙醇洗滌抽濾至濾液清亮；60℃恒溫干燥6h，于干燥箱內(nèi)冷卻后裝棕色瓶?jī)?nèi)得N-氧化石松堿M鍵合硅膠；3)將N-氧化石松堿M鍵合硅膠常規(guī)裝柱，即得。本發(fā)明所述的一種溴芬酸鈉滴眼液有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，所述測(cè)定方法具體步驟為：1)精密量取溴芬酸鈉滴眼液5ml，置50ml量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1ml，置200ml量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液；2)精密稱(chēng)取溴芬酸鈉水合物對(duì)照品25mg，置25ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，制成每1ml中約含無(wú)水溴芬酸鈉0.93mg的溶液，搖勻，作為對(duì)照品溶液貯備液；另精密量取對(duì)照品溶液貯備液1ml，置200ml量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液；3)精密稱(chēng)取聚維酮K30對(duì)照品200mg，置10ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，制成每1ml中含20mg的溶液，搖勻，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，作為空白溶液；4)精密量取對(duì)照品溶液、對(duì)照溶液、空白溶液和供試品溶液各60μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，其他單一雜質(zhì)峰面積與對(duì)照溶液主峰面積相比較；除聚合物外，各雜質(zhì)峰面積的和與對(duì)照溶液主峰面積相比較；5)計(jì)算公式式中：SK為空白溶液中聚維酮K30的峰面積；SX為供試品溶液中與空白溶液聚維酮K30峰保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)峰的峰面積；S對(duì)為對(duì)照品溶液的峰面積；C樣為供試品溶液的標(biāo)示濃度；C對(duì)為對(duì)照品溶液的濃度；W對(duì)為對(duì)照品的重量，mg；1.076為溴芬酸鈉的水合物與無(wú)水溴芬酸鈉的換算因子。式中：S雜、S對(duì)分別為其它單個(gè)雜質(zhì)峰面積與對(duì)照溶液的主峰面積；S和為除聚合物外，各雜質(zhì)峰面積的和。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述溴芬酸鈉滴眼液有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法實(shí)現(xiàn)了溴芬酸鈉與其有關(guān)物質(zhì)的分離與分析，并且分離度好，專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高，可以采用不加校正因子的自身對(duì)照法對(duì)這三個(gè)已知雜質(zhì)進(jìn)行定量。該測(cè)定方法對(duì)于溴芬酸鈉滴眼液的質(zhì)量控制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述溴芬酸鈉滴眼液有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法做進(jìn)一步說(shuō)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。實(shí)施例1利用液相色譜法分析溴芬酸鈉滴眼液的有關(guān)物質(zhì)，采用N-氧化石松堿M鍵合硅膠柱，以磷酸鹽緩沖液-乙腈為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為266nm，流速為調(diào)節(jié)溴芬酸鈉的出峰時(shí)間為18min左右，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為60uL；洗脫梯度程序具體為：時(shí)間(分鐘)流動(dòng)相A(％)流動(dòng)相B0100020.1100060.1109060.21000801000其中所述的流動(dòng)相A：磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二銨2.64g，加水溶解并稀釋至1000ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.3)-乙腈(75:25)；流動(dòng)相B：磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二銨2.64g，加水溶解并稀釋至1000ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.3)-乙腈(30:70)。所述N-氧化石松堿M鍵合硅膠柱的制備步驟為：1)取20g活化的硅膠于500mL三口瓶中，再量取100mL甲苯和40mL的γ-氨丙基三乙氧基硅烷，120℃下油浴，攪拌回流13h，待冷卻后，產(chǎn)物依次用甲苯，乙醇洗滌抽濾至無(wú)膠狀物存在；在60℃下干燥24h，干燥箱內(nèi)冷卻；2)在500mL的單口瓶中加入步驟1)的產(chǎn)物，然后依次加入120mL35％的甲醛溶液和2mL的乙酸溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h，經(jīng)無(wú)水乙醇抽濾后，置于500mL三口瓶中備用；取N-氧化石松堿M4g溶于適量水溶液中，調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，加入上述三口瓶中，60℃攪拌下反應(yīng)10h；待產(chǎn)物冷卻，依次用大量二次水、無(wú)水乙醇洗滌抽濾至濾液清亮；60℃恒溫干燥6h，于干燥箱內(nèi)冷卻后裝棕色瓶?jī)?nèi)得N-氧化石松堿M鍵合硅膠；3)將N-氧化石松堿M鍵合硅膠常規(guī)裝柱，即得。確證試驗(yàn)：1.波長(zhǎng)的選擇精密稱(chēng)取雜質(zhì)1、雜質(zhì)2和雜質(zhì)3各約10mg，分別置100ml量瓶中，均用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，置100ml量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，于200～400nm進(jìn)行紫外掃描，雜質(zhì)1、雜質(zhì)2和雜質(zhì)3在266nm波長(zhǎng)處有較大吸收。2.分離專(zhuān)屬性試驗(yàn)供試品溶液：精密稱(chēng)取溴芬酸鈉原料約10mg，置100ml量瓶中，加流動(dòng)相A溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml中約含0.1mg的溶液，作為供試品溶液。對(duì)照溶液：精密量取供試品溶液1ml，置200ml量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。中間體Ⅴ溶液：精密稱(chēng)取中間體Ⅴ約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml中約含0.1mg的溶液，作為中間體Ⅴ溶液。雜質(zhì)1溶液：精密稱(chēng)取雜質(zhì)1約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml中約含0.1mg的溶液，作為雜質(zhì)1溶液。雜質(zhì)2溶液：精密稱(chēng)取雜質(zhì)2約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml中約含0.1mg的溶液，作為雜質(zhì)2溶液。雜質(zhì)3溶液：精密稱(chēng)取雜質(zhì)2約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml中約含0.1mg的溶液，作為雜質(zhì)3溶液。空白輔料溶液：按處方量的輔料，配制空白輔料溶液?；旌先芤海壕芊Q(chēng)取溴芬酸鈉原料約20mg，置200ml量瓶中，加入上述雜質(zhì)溶液各1ml，加流動(dòng)相A溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml中約含溴芬酸鈉0.1mg、雜質(zhì)各0.5μg的溶液，作為混合溶液。取對(duì)照溶液60μl注入液相色譜儀，調(diào)整流速使溴芬酸鈉水合物的保留時(shí)間約為18分鐘，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿(mǎn)量程的20％～30％；再取空白輔料溶液、雜質(zhì)1溶液、雜質(zhì)2溶液、雜質(zhì)3溶液、中間體Ⅴ溶液、混合溶液及供試品溶液各60μl分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。出峰順序?yàn)殡s質(zhì)1、溴芬酸鈉、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3、中間體Ⅴ。試驗(yàn)結(jié)果表明，和以往采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱相比，采用N-氧化石松堿M鍵合硅膠柱后，各雜質(zhì)峰之間分離更好，溶劑峰及輔料峰不影響主峰及雜質(zhì)峰的檢出，同時(shí)對(duì)流動(dòng)相的梯度洗脫條件選擇性要求相對(duì)可以更低。3.檢出限(1)溴芬酸鈉精密稱(chēng)取溴芬酸鈉約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1ml，置200ml量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，精密吸取60μl注入液相色譜儀，從圖中可看出，此時(shí)信噪比(S/N)約為3，即在該色譜條件下，溴芬酸鈉的檢測(cè)限為0.15ng，相對(duì)于供試品溶液中溴芬酸鈉的定量限為0.0025％。(2)雜質(zhì)1精密稱(chēng)取雜質(zhì)1約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取2ml，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，精密吸取60μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，從圖中可看出,此時(shí)信噪比(S/N)約為3，即在該色譜條件下，雜質(zhì)1的最小檢出量為0.24ng，相對(duì)于供試品溶液中溴芬酸鈉的最小檢出限為0.004％。(3)雜質(zhì)2精密稱(chēng)取雜質(zhì)2約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1ml，置100ml量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，精密吸取60μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，從圖中可看出，此時(shí)信噪比(S/N)約為3，即在該色譜條件下，雜質(zhì)2的最小檢出量為0.24ng，相對(duì)于供試品溶液中溴芬酸鈉的最小檢出限為0.004％。(4)雜質(zhì)3精密稱(chēng)取雜質(zhì)Ⅲ約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1ml，置100ml量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，精密吸取60μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，從圖中可看出，此時(shí)信噪比(S/N)約為3，即在該色譜條件下，雜質(zhì)3的最小檢出量為0.24ng，相對(duì)于供試品溶液中溴芬酸鈉的最小檢出限為0.004％。4.定量限(1)溴芬酸鈉精密稱(chēng)取溴芬酸鈉約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1ml，置50ml量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，精密吸取60μl注入液相色譜儀，從圖中可看出，此時(shí)信噪比(S/N)約為10，即在該色譜條件下，溴芬酸鈉的定量限為0.6ng，相對(duì)于供試品溶液中溴芬酸鈉的定量限為0.01％，測(cè)定液連續(xù)進(jìn)樣6次的標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于2.0％。(2)雜質(zhì)1精密稱(chēng)取雜質(zhì)1約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1ml，置50ml量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，精密吸取60μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，此時(shí)信噪比(S/N)約為10，即在該色譜條件下，雜質(zhì)1的定量限為0.6ng，相對(duì)于供試品溶液中溴芬酸鈉的定量限為0.01％，測(cè)定液連續(xù)進(jìn)樣6次的標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于2.0％。(3)雜質(zhì)2精密稱(chēng)取雜質(zhì)2約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1ml，置50ml量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，精密吸取60μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，此時(shí)信噪比(S/N)約為10，即在該色譜條件下，雜質(zhì)2的定量限為0.6ng，相對(duì)于供試品溶液中溴芬酸鈉的定量限為0.01％，測(cè)定液連續(xù)進(jìn)樣6次的標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于2.0％。(4)雜質(zhì)3精密稱(chēng)取雜質(zhì)3約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1ml，置50ml量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，精密吸取60μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，此時(shí)信噪比(S/N)約為10，即在該色譜條件下，雜質(zhì)3的定量限為0.6ng，相對(duì)于供試品溶液中溴芬酸鈉的定量限為0.01％，測(cè)定液連續(xù)進(jìn)樣6次的標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于2.0％。5.雜質(zhì)校正因子的測(cè)定精密稱(chēng)取溴芬酸鈉對(duì)照品、雜質(zhì)1、雜質(zhì)2和雜質(zhì)3各約10mg，分別置100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，各精密量取1ml，分別置200ml量瓶中，用流動(dòng)相A溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密取上述溶液各60μl進(jìn)樣，記錄色譜圖，同法，分別測(cè)定六次，具體結(jié)果見(jiàn)下表。由以上數(shù)據(jù)可知，雜質(zhì)1、雜質(zhì)2和雜質(zhì)3相對(duì)響應(yīng)因子均在0.9-1.1范圍內(nèi)，所以可以采用不加校正因子的自身對(duì)照法對(duì)這三個(gè)已知雜質(zhì)進(jìn)行定量。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3