本發(fā)明涉及食品藥品檢測分析領(lǐng)域，具體涉及一種中藥材中非法添加的合成酸性色素的提取分離方法，還涉及該非法添加的合成酸性色素的快速檢測方法。

背景技術(shù)：

由于合成色素具有不同程度的致敏性甚至致癌性，根據(jù)中藥材監(jiān)管相關(guān)規(guī)定，中藥材中不允許添加任何人工著色劑（合成色素），然而，目前市面上中藥材的非法染色現(xiàn)象十分嚴(yán)重，不法分子通過對(duì)藥材染色以達(dá)到掩蓋摻偽、以次充好、以提取后的藥材重新入藥等不法目的。其中，市場上常見的染色中藥有：紅花、黃連、丹參、蒲黃、五味子等，而且所添加的色素種類越來越復(fù)雜，這對(duì)中藥材的檢驗(yàn)提出了新的要求。

中藥材非法染色過程中常見的著色劑包括食用色素、工業(yè)染料、紡織品染料等幾大類，如胭脂紅、檸檬黃、亮藍(lán)、蘇丹紅、金胺O、808猩紅等。一般的中藥材非法染色方式包括噴涂、浸泡等手段，并且，由于中藥材多為植物組織，以水溶性合成酸性色素為主的各種合成色素會(huì)與植物組織的纖維素、木質(zhì)素、半纖維素等物質(zhì)發(fā)生緊密的結(jié)合從而發(fā)揮染色的作用。在進(jìn)行中藥材非法染色檢測時(shí)，由于二者結(jié)合緊密，因此使用傳統(tǒng)的方法較難將合成酸性色素等從中藥材中充分提取，普通提取方法的回收率僅為30~70%，且方法準(zhǔn)確性較差，無法進(jìn)行后續(xù)定量分析。

另外，由于部分藥廠對(duì)染色中藥材的檢查缺乏經(jīng)驗(yàn)，生產(chǎn)過程中以非法染色中藥材投料生產(chǎn)，導(dǎo)致部分成藥中檢出了合成色素。由于染色中藥材在藥品生產(chǎn)中一般只占有很少的比例，因此成藥中的合成色素含量很低，使用傳統(tǒng)提取方法較難檢出，而且對(duì)檢測儀器要求較高。經(jīng)樣品分析還發(fā)現(xiàn)，市場上存在以少量染色中藥材摻入正品中藥材中的現(xiàn)象，在這種情況下，由于摻入的量比較少，因此，使用傳統(tǒng)的提取方法很有可能無法檢出。針對(duì)上述存在的技術(shù)問題，中藥材的現(xiàn)實(shí)檢測中，亟需一種有效地從非法染色的中藥材中提取合成色素、尤其是合成酸性色素的方法，以滿足實(shí)際檢測的需要。

現(xiàn)有技術(shù)中，如“聚酰胺固相萃取-HPLC法同時(shí)測定中藥材中16種合成酸性色素”（《中成藥》2015，37（5）：1031-1036）所披露的方法能夠同時(shí)進(jìn)行16種合成酸性色素的測定。然而，該文獻(xiàn)所記載的方法包括繁瑣的提取分離過程，即反復(fù)加液、離心、移取、超聲等步驟，耗時(shí)較長，因此，整體的提取分離與檢測效率還有待進(jìn)一步提高，以滿足現(xiàn)實(shí)中各食品藥品檢驗(yàn)所或藥企的快速檢測需求。

因此，研發(fā)出一種全新的提取分離方法及后續(xù)的檢測方法，從中藥材中高效分離提取出各種合成色素，并進(jìn)行定性與定量分析，成為當(dāng)今本領(lǐng)域研發(fā)人員的研究重點(diǎn)之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的種種缺陷，尤其是針對(duì)現(xiàn)有方法提取分離耗時(shí)較長且效率較低、檢測分析回收率不夠高等技術(shù)問題。

因此，本發(fā)明的第一方面，提供了一種中藥材中非法添加的合成酸性色素的提取分離方法，其包括以下步驟：

首先，將一片不銹鋼篩網(wǎng)12墊置于所述提取器下蓋2的內(nèi)底面上，精密稱取中藥材細(xì)粉，并將所述中藥材細(xì)粉填充至提取器上蓋1與提取器下蓋2可拆卸地閉合圍成的空腔內(nèi)，然后整平中藥材細(xì)粉餅，再于所述中藥材細(xì)粉餅上覆蓋一片不銹鋼濾片13，旋緊所述提取器上蓋1；其中，所述提取器上蓋1中心設(shè)有小通孔，并在所述提取器上蓋1的外頂面中心設(shè)置有公魯爾接口，用于連接魯爾考克閥7；所述提取器下蓋2中心設(shè)有小通孔，并在所述提取器下蓋2的外底面中心設(shè)置有母魯爾接口，用于連接雙公魯爾接頭6；

接著，將WAX固相萃取柱3插入固相萃取缸4內(nèi)，采用提取液預(yù)洗活化，并保持WAX固相萃取柱中的提取液充盈；在所述WAX固相萃取柱的入口處插接SPE轉(zhuǎn)接頭5，將所述SPE轉(zhuǎn)接頭5的上端插接至雙公魯爾接頭6，最后將所述雙公魯爾接頭6的上端插接至所述提取器下蓋2的所述母魯爾接口內(nèi)；此外，值得說明的是，WAX固相萃取柱3可借助于所述固相萃取缸4上蓋的魯爾口而插入。

將一端插接有魯爾考克閥7的提取軟管8的另一端插入提取液試劑瓶10，并浸沒在提取液中；開啟所述魯爾考克閥7，再將注射器插入所述魯爾考克閥7的母口，拉動(dòng)注射器的活塞桿，抽吸提取液，直至提取液充滿所述提取軟管8和所述魯爾考克閥7后，關(guān)閉所述魯爾考克閥7并抽出該注射器；

然后，將所述魯爾考克閥7的母口插接至所述提取器上蓋1的頂面中心設(shè)置的所述公魯爾接口；將所述提取液試劑瓶10放置于高處，使得所述提取液試劑瓶10的瓶底所處的水平面至少高于所述SPE轉(zhuǎn)接頭5的出液口；接著，開啟所述魯爾考克閥7，使得提取液流經(jīng)所述中藥材細(xì)粉并不斷流入所述WAX固相萃取柱3內(nèi)，進(jìn)行固相萃取；在此過程中，所述中藥材細(xì)粉中含有的合成酸性色素會(huì)被固相萃取柱中的混合型弱陰離子交換反相吸附劑所吸附；待滴下的液體呈無色后，關(guān)閉所述魯爾考克閥7，取下所述雙公魯爾接頭6及其以上的構(gòu)件，然后使用洗脫劑對(duì)所述WAX固相萃取柱3進(jìn)行洗脫，合并洗脫液，即提取分離得到所述合成酸性色素；

其中，通過設(shè)置在所述提取器上蓋1內(nèi)側(cè)的外螺紋與設(shè)置在所述提取器下蓋2內(nèi)側(cè)的相匹配的內(nèi)螺紋，所述提取器上蓋1與所述提取器下蓋2實(shí)現(xiàn)可拆卸地閉合；并且，所述提取器上蓋1的內(nèi)頂面固定連接有一個(gè)空心的餅狀體，所述外螺紋設(shè)置在所述餅狀體的側(cè)面上，所述餅狀體的底面上具有若干個(gè)透孔，供提取液流出；

其中，所述不銹鋼篩網(wǎng)12和所述不銹鋼濾片13的材質(zhì)均為304不銹鋼或316不銹鋼，并且，所述不銹鋼篩網(wǎng)12的直徑小于所述不銹鋼濾片13的直徑。

值得一提的是，所述不銹鋼篩網(wǎng)在阻擋中藥材粉末的同時(shí)具有一定的過濾作用，而所述不銹鋼濾片也起到過濾雜質(zhì)的作用；說明書全文中所述的“滴下的液體呈無色”，是指研發(fā)人員或操作人員觀察到所述SPE轉(zhuǎn)接頭5的出液口滴下的液體呈無色。

優(yōu)選地，在上述提取分離方法中，所述不銹鋼篩網(wǎng)12的篩孔為600目，所述不銹鋼濾片13的篩孔為100目。

優(yōu)選地，在上述提取分離方法中，所述提取器上蓋1、所述提取器下蓋2、所述SPE轉(zhuǎn)接頭5、所述雙公魯爾接頭6與所述魯爾考克閥7的材質(zhì)均為聚丙烯；所述提取軟管8的材質(zhì)為硅膠。上述材質(zhì)對(duì)色素均無吸附作用。

更進(jìn)一步優(yōu)選地，在上述提取分離方法中，所述提取器下蓋2內(nèi)放置有橡膠環(huán)11，用于密封。此處所述的橡膠環(huán)即相當(dāng)于水管接頭中的密封圈。

此外，值得注意的是，精密稱取中藥材細(xì)粉后，填充所述空腔即可，但切勿填充過滿，以免造成中藥材細(xì)粉堵塞流路或影響上下蓋的旋緊閉合。

優(yōu)選地，在上述提取分離方法中，所述提取液為70%甲醇水溶液。

優(yōu)選地，在上述提取分離方法的固相萃取過程中，使用與所述固相萃取缸4連通的抽氣泵14進(jìn)行加速提取，通過控制抽氣泵14來調(diào)節(jié)固相萃取缸4的負(fù)壓，使得提取液以2~3滴每秒的速度流出為宜；并且，待滴下的液體呈無色后，先關(guān)閉抽氣泵14，再關(guān)閉所述魯爾考克閥7，取下所述雙公魯爾接頭6及其以上的構(gòu)件，然后使用洗脫劑對(duì)所述WAX固相萃取柱3進(jìn)行洗脫，合并洗脫液，即提取分離得到所述合成酸性色素。此外，值得說明的是，該抽氣泵14優(yōu)選為隔膜抽氣泵，并且還可連接有廢液瓶，供存儲(chǔ)廢液并抽出廢氣。

實(shí)際上，上述提取分離方法采用了發(fā)明人所設(shè)計(jì)的全新的提取分離裝置，才得以有效實(shí)施。該提取分離裝置包括：所述提取器上蓋1，所述提取器下蓋2，所述WAX固相萃取柱3，所述固相萃取缸4，所述SPE轉(zhuǎn)接頭5，所述雙公魯爾接頭6，所述魯爾考克閥7與所述提取軟管8，所述不銹鋼篩網(wǎng)12和所述不銹鋼濾片13；并且，可選地進(jìn)一步包括：所述橡膠環(huán)11。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種中藥材中非法添加的合成酸性色素的快速檢測方法，其先采用本發(fā)明第一方面所述的提取分離方法得到含所述合成酸性色素的洗脫液，然后將洗脫液調(diào)節(jié)pH至中性，接著定容，再經(jīng)高速離心，取上清液進(jìn)樣至HPLC系統(tǒng)或HPLC-MS系統(tǒng)進(jìn)行檢測。由于上述快速檢測方法中所使用的HPLC系統(tǒng)或HPLC-MS系統(tǒng)可從現(xiàn)有的常規(guī)高效液相色譜設(shè)備、質(zhì)譜設(shè)備中選擇，因此高效液相分析和質(zhì)譜分析的操作方法均為常規(guī)方法，在本發(fā)明說明書中將不再贅述。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

①通過使用發(fā)明人所設(shè)計(jì)的全新的提取分離裝置，包括固相萃取柱以及相關(guān)連接組件，實(shí)施本發(fā)明第一方面所述的提取分離方法，能夠以比現(xiàn)有技術(shù)更短的耗時(shí)，高效地提取分離出合成酸性色素；②采用本發(fā)明第一方面所述的提取分離方法作為前處理，然后實(shí)施本發(fā)明第二方面所述的快速檢測方法，發(fā)現(xiàn)各種合成酸性色素的回收率顯著高于現(xiàn)有技術(shù)；③本發(fā)明所提供的提取分離方法和快速檢測方法能夠大幅改進(jìn)對(duì)于多種合成酸性色素的提取效率，并相應(yīng)提高其檢測能力，因此，具有廣闊的應(yīng)用前景與良好的市場潛力。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中的所述提取器上蓋1的俯視圖、仰視圖與側(cè)視圖；其中：1a-公魯爾接口，1b-餅狀體，1c-外螺紋，1d-透孔；

圖2為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中的所述提取器下蓋2的俯視圖、仰視圖與側(cè)視圖；其中：2a-內(nèi)螺紋，2b-母魯爾接口；

圖3為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中的所述提取分離裝置的結(jié)構(gòu)簡圖；

其中：1-提取器上蓋，2-提取器下蓋，3-WAX固相萃取柱，4-固相萃取缸，5-SPE轉(zhuǎn)接頭，6-雙公魯爾接頭，7-魯爾考克閥，8-提取軟管；

圖4為11-橡膠環(huán)、12-不銹鋼篩網(wǎng)和13-不銹鋼濾片的散件圖，它們被放置于提取器上蓋1與提取器下蓋2所閉合而成的所述空腔內(nèi)；

圖5為圖3所示的提取分離裝置的安裝運(yùn)行示意圖；

其中：A-提取分離裝置，10-提取液試劑瓶，14-抽氣泵；

圖6為本發(fā)明所述的提取分離方法和快速檢測方法的工藝流程框圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施方式。

本發(fā)明第一方面提供了一種中藥材中非法添加的合成酸性色素的提取分離方法，其包括以下步驟：

首先，將一片不銹鋼篩網(wǎng)12墊置于所述提取器下蓋2的內(nèi)底面上，精密稱取中藥材細(xì)粉，并將所述中藥材細(xì)粉填充至提取器上蓋1與提取器下蓋2可拆卸地閉合圍成的空腔內(nèi)，然后整平中藥材細(xì)粉餅，再于所述中藥材細(xì)粉餅上覆蓋一片不銹鋼濾片13，旋緊所述提取器上蓋1；其中，所述提取器上蓋1中心設(shè)有小通孔，并在所述提取器上蓋1的外頂面中心設(shè)置有公魯爾接口，用于連接魯爾考克閥7；所述提取器下蓋2中心設(shè)有小通孔，并在所述提取器下蓋2的外底面中心設(shè)置有母魯爾接口，用于連接雙公魯爾接頭6；

接著，將WAX固相萃取柱3插入固相萃取缸4內(nèi)，采用提取液預(yù)洗活化，并保持WAX固相萃取柱中的提取液充盈；在所述WAX固相萃取柱的入口處插接SPE轉(zhuǎn)接頭5，將所述SPE轉(zhuǎn)接頭5的上端插接至雙公魯爾接頭6，最后將所述雙公魯爾接頭6的上端插接至所述提取器下蓋2的所述母魯爾接口內(nèi)；

將一端插接有魯爾考克閥7的提取軟管8的另一端插入提取液試劑瓶10，并浸沒在提取液中；開啟所述魯爾考克閥7，再將注射器插入所述魯爾考克閥7的母口，拉動(dòng)注射器的活塞桿，抽吸提取液，直至提取液充滿所述提取軟管8和所述魯爾考克閥7后，關(guān)閉所述魯爾考克閥7并抽出該注射器；

然后，將所述魯爾考克閥7的母口插接至所述提取器上蓋1的頂面中心設(shè)置的所述公魯爾接口；將所述提取液試劑瓶10放置于高處，使得所述提取液試劑瓶10的瓶底所處的水平面至少高于所述SPE轉(zhuǎn)接頭5的出液口；接著，開啟所述魯爾考克閥7，使得提取液流經(jīng)所述中藥材細(xì)粉并不斷流入所述WAX固相萃取柱3內(nèi)，進(jìn)行固相萃??；待滴下的液體呈無色后，關(guān)閉所述魯爾考克閥7，取下所述雙公魯爾接頭6及其以上的構(gòu)件，然后使用洗脫劑對(duì)所述WAX固相萃取柱3進(jìn)行洗脫，合并洗脫液，即提取分離得到所述合成酸性色素；

其中，通過設(shè)置在所述提取器上蓋1內(nèi)側(cè)的外螺紋與設(shè)置在所述提取器下蓋2內(nèi)側(cè)的相匹配的內(nèi)螺紋，所述提取器上蓋1與所述提取器下蓋2實(shí)現(xiàn)可拆卸地閉合；并且，所述提取器上蓋1的內(nèi)頂面固定連接有一個(gè)空心的餅狀體，所述外螺紋設(shè)置在所述餅狀體的側(cè)面上，所述餅狀體的底面上具有若干個(gè)透孔，供提取液流出；

其中，所述不銹鋼篩網(wǎng)12和所述不銹鋼濾片13的材質(zhì)均為304不銹鋼或316不銹鋼，并且，所述不銹鋼篩網(wǎng)12的直徑小于所述不銹鋼濾片13的直徑。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述不銹鋼篩網(wǎng)12的篩孔為600目，所述不銹鋼濾片13的篩孔為100目。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述提取器上蓋1、所述提取器下蓋2、所述SPE轉(zhuǎn)接頭5、所述雙公魯爾接頭6與所述魯爾考克閥7的材質(zhì)均為聚丙烯；所述提取軟管8的材質(zhì)為硅膠。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述提取器下蓋2內(nèi)放置有橡膠環(huán)11，用于密封。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述提取液為70%甲醇水溶液。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，固相萃取過程中，使用與所述固相萃取缸4連通的抽氣泵14進(jìn)行加速提取；并且，待滴下的液體呈無色后，先關(guān)閉抽氣泵14，再關(guān)閉所述魯爾考克閥7，取下所述雙公魯爾接頭6及其以上的構(gòu)件，然后使用洗脫劑對(duì)所述WAX固相萃取柱3進(jìn)行洗脫，合并洗脫液，即提取分離得到所述合成酸性色素。

本發(fā)明第二方面提供了一種中藥材中非法添加的合成酸性色素的快速檢測方法，其先采用本發(fā)明第一方面所述的提取分離方法得到含所述合成酸性色素的洗脫液，然后將洗脫液調(diào)節(jié)pH至中性，接著定容，再經(jīng)高速離心，取上清液進(jìn)樣至HPLC系統(tǒng)或HPLC-MS系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

以下實(shí)施例1~4中，所使用的主要儀器、材料與試劑包括：

Agilent 1290 Infinity 超高效液相色譜儀（帶DAD檢測器），Agilent 6495三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（AJS ESI離子源）美國安捷倫公司，數(shù)據(jù)分析軟件（Agilent MassHunter 軟件包包含數(shù)據(jù)采集、定性、定量分析、離子優(yōu)化軟件，版本B.07），Millipore Milli-Q Gradient A10 純水儀（美國Millipore公司），Sartorius CP225D 分析天平（德國Sartorius公司），離心機(jī)；

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100mm*2.1mm，1.8μm），Waters ACQUITY UPLC HSS T3 VanGuard預(yù)柱（2.1mm*5mm）及Waters Guard Filter在線過濾器（配0.22μm濾片）；SPE小柱（所述WAX固相萃取柱3，500mg/6cc，天津博納艾杰爾公司）；

乙腈為色譜純?cè)噭ǖ聡鳰erck公司）；甲酸（前處理用）、氨水、甲醇、異丙醇均為分析純?cè)噭ㄉ虾Ａ璺寤瘜W(xué)試劑有限公司），乙酸銨為質(zhì)譜級(jí)純度（上海阿拉丁公司）；

實(shí)施例1

對(duì)某A廠生產(chǎn)的黃連飲片粉末中非法添加的合成酸性色素進(jìn)行提取分離與檢測：

在此實(shí)施例1中，使用如圖3所示的提取分離裝置，包括：提取器上蓋1，提取器下蓋2，WAX固相萃取柱3，固相萃取缸4，SPE轉(zhuǎn)接頭5，雙公魯爾接頭6，魯爾考克閥7與提取軟管8；其中，所述提取器上蓋1、所述提取器下蓋2、所述SPE轉(zhuǎn)接頭5、所述雙公魯爾接頭6與所述魯爾考克閥7的材質(zhì)均為聚丙烯；所述提取軟管8的材質(zhì)為硅膠，內(nèi)徑4mm，外徑6mm。

所述提取器上蓋1的結(jié)構(gòu)如圖1所示，所述提取器下蓋2的結(jié)構(gòu)如圖2所示；其中，所述提取器上蓋1中心設(shè)有小通孔，并在所述提取器上蓋1的外頂面中心設(shè)置有公魯爾接口1a；所述提取器下蓋2中心設(shè)有小通孔，并在所述提取器下蓋2的外底面中心設(shè)置有母魯爾接口2b；通過設(shè)置在所述提取器上蓋1內(nèi)側(cè)的外螺紋1c與設(shè)置在所述提取器下蓋2內(nèi)側(cè)的相匹配的內(nèi)螺紋2a，所述提取器上蓋1與所述提取器下蓋2實(shí)現(xiàn)可拆卸地閉合，旋緊閉合后可圍成一個(gè)空腔；并且，所述提取器上蓋1的內(nèi)頂面固定連接有一個(gè)空心的餅狀體1b，所述外螺紋1c設(shè)置在所述餅狀體1b的側(cè)面上，所述餅狀體1b的底面上具有若干個(gè)透孔1d，供提取液流出。

步驟一：

先將提取器上蓋1與提取器下蓋2旋開，在提取器下蓋2的內(nèi)底面上墊置一片不銹鋼篩網(wǎng)12（304不銹鋼，直徑10mm，600目），然后放入一個(gè)橡膠環(huán)11；接著，將該提取器下蓋2放入天平，精密稱取0.25g黃連飲片粉末填充于該提取器下蓋2中，輕敲以整平黃連飲片粉末餅，再于所述黃連飲片粉末餅上覆蓋一片不銹鋼濾片13（304不銹鋼，直徑15mm，100目），之后旋緊所述提取器上蓋1。

步驟二：

將WAX固相萃取柱3插入固相萃取缸4內(nèi)，采用甲醇6ml，0.1%甲酸水6ml預(yù)洗活化該WAX固相萃取柱3，之后加水4 ml，以保持該WAX固相萃取柱中的提取液充盈且濕潤；在所述WAX固相萃取柱3的入口處插接SPE轉(zhuǎn)接頭5，將所述SPE轉(zhuǎn)接頭5的上端插接至雙公魯爾接頭6，最后將所述雙公魯爾接頭6的上端插接至所述提取器下蓋2的母魯爾接口2b內(nèi)；

步驟三：

將一端插接有魯爾考克閥7的提取軟管8的另一端插入提取液試劑瓶10，并浸沒在提取液（70%甲醇水溶液）中；開啟所述魯爾考克閥7，再將注射器插入所述魯爾考克閥7的母口，拉動(dòng)注射器的活塞桿，抽吸提取液，直至提取液充滿所述提取軟管8和所述魯爾考克閥7后，關(guān)閉所述魯爾考克閥7并抽出該注射器；

步驟四：

將所述魯爾考克閥7的母口插接至所述提取器上蓋1的頂面中心設(shè)置的所述公魯爾接口1a；將所述提取液試劑瓶10放置于高臺(tái)上，使得所述提取液試劑瓶10的瓶底所處的水平面高于所述SPE轉(zhuǎn)接頭5的出液口；接著，開啟所述魯爾考克閥7，使得提取液流經(jīng)所述黃連飲片粉末并不斷流入所述WAX固相萃取柱3內(nèi)，進(jìn)行固相萃?。淮蜗碌囊后w呈無色后，關(guān)閉所述魯爾考克閥7，取下所述雙公魯爾接頭6及其以上的構(gòu)件；然后使用6ml甲醇沖洗該WAX固相萃取柱3，排盡柱內(nèi)液體，再以4ml的10%氨水甲醇溶液洗脫兩次，合并洗脫液；

步驟五：

向上述合并的洗脫液中加入甲酸調(diào)pH至近中性，再定容至10ml，高速離心（14000rpm，10min），取上清液2ul進(jìn)樣至HPLC系統(tǒng)；通過HPLC系統(tǒng)，對(duì)黃連飲片中非法添加的若干種合成酸性色素完成檢測。

其中，HPLC色譜條件為：

柱溫：30℃，進(jìn)樣體積2μL；流速0.55ml/min。洗針時(shí)間20秒，洗針溶劑異丙醇：乙腈：甲醇：水=1:1:1:1

流動(dòng)相：A相：10mmol乙酸銨，B相乙腈。流動(dòng)相梯度洗脫程序如表1所示：

HPLC系統(tǒng)中線性關(guān)系確定：

選取了食品、藥用輔料中允許添加的、國際禁用的、中藥中常被報(bào)道的合成酸性色素，常見紡織品染料，及部分生物染料、顯色劑，共50種。

分別精密稱取50種色素對(duì)照品10mg置于20ml容量瓶中，根據(jù)色素的溶解性，水溶性色素使用水定容；脂溶性色素使用乙腈定容。定容后的溶液轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)液瓶中，貼標(biāo)簽，保存于4℃冰箱中。使用前恢復(fù)至室溫，根據(jù)需要進(jìn)行稀釋，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

將上述混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液等比稀釋，分別取2μl進(jìn)樣，進(jìn)行測定；以峰面積與對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸分析，軟件計(jì)算的出回歸方程、線性范圍和相關(guān)性系數(shù)，具體結(jié)果如表2所示：

實(shí)施例2

對(duì)某B廠生產(chǎn)的黃連飲片粉末中非法添加的合成酸性色素進(jìn)行提取分離與檢測：

在此實(shí)施例2中，使用如圖3所示的提取分離裝置，包括：提取器上蓋1，提取器下蓋2，WAX固相萃取柱3，固相萃取缸4，SPE轉(zhuǎn)接頭5，雙公魯爾接頭6，魯爾考克閥7與提取軟管8；其中，所述提取器上蓋1、所述提取器下蓋2、所述SPE轉(zhuǎn)接頭5、所述雙公魯爾接頭6與所述魯爾考克閥7的材質(zhì)均為聚丙烯；所述提取軟管8的材質(zhì)為硅膠，內(nèi)徑4mm，外徑6mm。

所述提取器上蓋1的結(jié)構(gòu)如圖1所示，所述提取器下蓋2的結(jié)構(gòu)如圖2所示；其中，所述提取器上蓋1中心設(shè)有小通孔，并在所述提取器上蓋1的外頂面中心設(shè)置有公魯爾接口1a；所述提取器下蓋2中心設(shè)有小通孔，并在所述提取器下蓋2的外底面中心設(shè)置有母魯爾接口2b；通過設(shè)置在所述提取器上蓋1內(nèi)側(cè)的外螺紋1c與設(shè)置在所述提取器下蓋2內(nèi)側(cè)的相匹配的內(nèi)螺紋2a，所述提取器上蓋1與所述提取器下蓋2實(shí)現(xiàn)可拆卸地閉合，旋緊閉合后可圍成一個(gè)空腔；并且，所述提取器上蓋1的內(nèi)頂面固定連接有一個(gè)空心的餅狀體1b，所述外螺紋1c設(shè)置在所述餅狀體1b的側(cè)面上，所述餅狀體1b的底面上具有若干個(gè)透孔1d，供提取液流出。

步驟一：

先將提取器上蓋1與提取器下蓋2旋開，在提取器下蓋2的內(nèi)底面上墊置一片不銹鋼篩網(wǎng)12（304不銹鋼，直徑10mm，600目），然后放入一個(gè)橡膠環(huán)11；接著，將該提取器下蓋2放入天平，精密稱取0.40g黃連飲片粉末填充于該提取器下蓋2中，輕敲以整平黃連飲片粉末餅，再于所述黃連飲片粉末餅上覆蓋一片不銹鋼濾片13（304不銹鋼，直徑19mm，100目），之后旋緊所述提取器上蓋1。

步驟二：

將WAX固相萃取柱3插入固相萃取缸4內(nèi)，采用甲醇6ml，0.15%甲酸水6ml預(yù)洗活化該WAX固相萃取柱3，之后加水5 ml，以保持該WAX固相萃取柱中的提取液充盈且濕潤；在所述WAX固相萃取柱3的入口處插接SPE轉(zhuǎn)接頭5，將所述SPE轉(zhuǎn)接頭5的上端插接至雙公魯爾接頭6，最后將所述雙公魯爾接頭6的上端插接至所述提取器下蓋2的母魯爾接口2b內(nèi)；

步驟三：

將一端插接有魯爾考克閥7的提取軟管8的另一端插入提取液試劑瓶10，并浸沒在提取液（70%甲醇水溶液）中；開啟所述魯爾考克閥7，再將注射器插入所述魯爾考克閥7的母口，拉動(dòng)注射器的活塞桿，抽吸提取液，直至提取液充滿所述提取軟管8和所述魯爾考克閥7后，關(guān)閉所述魯爾考克閥7并抽出該注射器；

步驟四：

將所述魯爾考克閥7的母口插接至所述提取器上蓋1的頂面中心設(shè)置的所述公魯爾接口1a；將所述提取液試劑瓶10放置于高臺(tái)上，使得所述提取液試劑瓶10的瓶底所處的水平面高于所述SPE轉(zhuǎn)接頭5的出液口；接著，開啟所述魯爾考克閥7，并啟動(dòng)抽氣泵14進(jìn)行抽氣，使得提取液流經(jīng)所述黃連飲片粉末并不斷流入所述WAX固相萃取柱3內(nèi)，進(jìn)行固相萃取，如圖5所示；待滴下的液體呈無色后，先關(guān)閉抽氣泵14，再關(guān)閉所述魯爾考克閥7，取下所述雙公魯爾接頭6及其以上的構(gòu)件；然后使用6ml甲醇沖洗該WAX固相萃取柱3，排盡柱內(nèi)液體，再以3.5ml的10%氨水甲醇溶液洗脫兩次，合并洗脫液；其中所使用的抽氣泵14為Waters公司生產(chǎn)的隔膜抽氣泵；

步驟五：

向上述合并的洗脫液中加入甲酸調(diào)pH至近中性，再定容至10ml，高速離心（14000rpm，10min），取上清液2ul進(jìn)樣至HPLC-MS系統(tǒng)；通過HPLC-MS系統(tǒng)，對(duì)黃連飲片中非法添加的若干種合成酸性色素完成檢測。

在此實(shí)施例2中，HPLC色譜條件以及HPLC系統(tǒng)中線性關(guān)系的確定與實(shí)施例1相同，MS質(zhì)譜儀及其所用調(diào)諧液由美國安捷倫公司提供，并按其操作手冊(cè)設(shè)置合適的質(zhì)譜條件。

實(shí)施例3

對(duì)某A廠生產(chǎn)的丹參飲片粉末中非法添加的合成酸性色素進(jìn)行提取分離與檢測：

在此實(shí)施例3中，使用如圖3所示的提取分離裝置，包括：提取器上蓋1，提取器下蓋2，WAX固相萃取柱3，固相萃取缸4，SPE轉(zhuǎn)接頭5，雙公魯爾接頭6，魯爾考克閥7與提取軟管8；其中，所述提取器上蓋1、所述提取器下蓋2、所述SPE轉(zhuǎn)接頭5、所述雙公魯爾接頭6與所述魯爾考克閥7的材質(zhì)均為聚丙烯；所述提取軟管8的材質(zhì)為硅膠，內(nèi)徑4mm，外徑5mm。

所述提取器上蓋1的結(jié)構(gòu)如圖1所示，所述提取器下蓋2的結(jié)構(gòu)如圖2所示；其中，所述提取器上蓋1中心設(shè)有小通孔，并在所述提取器上蓋1的外頂面中心設(shè)置有公魯爾接口1a；所述提取器下蓋2中心設(shè)有小通孔，并在所述提取器下蓋2的外底面中心設(shè)置有母魯爾接口2b；通過設(shè)置在所述提取器上蓋1內(nèi)側(cè)的外螺紋1c與設(shè)置在所述提取器下蓋2內(nèi)側(cè)的相匹配的內(nèi)螺紋2a，所述提取器上蓋1與所述提取器下蓋2實(shí)現(xiàn)可拆卸地閉合，旋緊閉合后可圍成一個(gè)空腔；并且，所述提取器上蓋1的內(nèi)頂面固定連接有一個(gè)空心的餅狀體1b，所述外螺紋1c設(shè)置在所述餅狀體1b的側(cè)面上，所述餅狀體1b的底面上具有若干個(gè)透孔1d，供提取液流出。

步驟一：

先將提取器上蓋1與提取器下蓋2旋開，在提取器下蓋2的內(nèi)底面上墊置一片不銹鋼篩網(wǎng)12（316不銹鋼，直徑10mm，400目），然后放入一個(gè)橡膠環(huán)11；接著，將該提取器下蓋2放入天平，精密稱取0.30g丹參飲片粉末填充于該提取器下蓋2中，輕敲以整平丹參飲片粉末餅，再于所述丹參飲片粉末餅上覆蓋一片不銹鋼濾片13（316不銹鋼，直徑15mm，100目），之后旋緊所述提取器上蓋1。

步驟二：

將WAX固相萃取柱3插入固相萃取缸4內(nèi)，采用甲醇6ml，0.1%甲酸水6ml預(yù)洗活化該WAX固相萃取柱3，之后加水4 ml，以保持該WAX固相萃取柱中的提取液充盈且濕潤；在所述WAX固相萃取柱3的入口處插接SPE轉(zhuǎn)接頭5，將所述SPE轉(zhuǎn)接頭5的上端插接至雙公魯爾接頭6，最后將所述雙公魯爾接頭6的上端插接至所述提取器下蓋2的母魯爾接口2b內(nèi)；

步驟三：

將一端插接有魯爾考克閥7的提取軟管8的另一端插入提取液試劑瓶10，并浸沒在提取液（70%甲醇水溶液）中；開啟所述魯爾考克閥7，再將注射器插入所述魯爾考克閥7的母口，拉動(dòng)注射器的活塞桿，抽吸提取液，直至提取液充滿所述提取軟管8和所述魯爾考克閥7后，關(guān)閉所述魯爾考克閥7并抽出該注射器；

步驟四：

將所述魯爾考克閥7的母口插接至所述提取器上蓋1的頂面中心設(shè)置的所述公魯爾接口1a；將所述提取液試劑瓶10放置于高臺(tái)上，使得所述提取液試劑瓶10的瓶底所處的水平面高于所述SPE轉(zhuǎn)接頭5的出液口；接著，開啟所述魯爾考克閥7，使得提取液流經(jīng)所述丹參飲片粉末并不斷流入所述WAX固相萃取柱3內(nèi)，進(jìn)行固相萃取；待滴下的液體呈無色后，關(guān)閉所述魯爾考克閥7，取下所述雙公魯爾接頭6及其以上的構(gòu)件；然后使用6ml甲醇沖洗該WAX固相萃取柱3，排盡柱內(nèi)液體，再以4ml的10%氨水甲醇溶液洗脫兩次，合并洗脫液；

步驟五：

向上述合并的洗脫液中加入甲酸調(diào)pH至近中性，再定容至10ml，高速離心（14000rpm，10min），取上清液2ul進(jìn)樣至HPLC系統(tǒng)；通過HPLC系統(tǒng)，對(duì)丹參飲片中非法添加的若干種合成酸性色素完成檢測。其中，HPLC色譜條件以及HPLC系統(tǒng)中線性關(guān)系的確定與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例4

對(duì)某B廠生產(chǎn)的丹參飲片粉末中非法添加的合成酸性色素進(jìn)行提取分離與檢測：

在此實(shí)施例4中，使用如圖3所示的提取分離裝置，包括：提取器上蓋1，提取器下蓋2，WAX固相萃取柱3，固相萃取缸4，SPE轉(zhuǎn)接頭5，雙公魯爾接頭6，魯爾考克閥7與提取軟管8；其中，所述提取器上蓋1、所述提取器下蓋2、所述SPE轉(zhuǎn)接頭5、所述雙公魯爾接頭6與所述魯爾考克閥7的材質(zhì)均為聚丙烯；所述提取軟管8的材質(zhì)為硅膠，內(nèi)徑4mm，外徑5mm。

所述提取器上蓋1的結(jié)構(gòu)如圖1所示，所述提取器下蓋2的結(jié)構(gòu)如圖2所示；其中，所述提取器上蓋1中心設(shè)有小通孔，并在所述提取器上蓋1的外頂面中心設(shè)置有公魯爾接口1a；所述提取器下蓋2中心設(shè)有小通孔，并在所述提取器下蓋2的外底面中心設(shè)置有母魯爾接口2b；通過設(shè)置在所述提取器上蓋1內(nèi)側(cè)的外螺紋1c與設(shè)置在所述提取器下蓋2內(nèi)側(cè)的相匹配的內(nèi)螺紋2a，所述提取器上蓋1與所述提取器下蓋2實(shí)現(xiàn)可拆卸地閉合，旋緊閉合后可圍成一個(gè)空腔；并且，所述提取器上蓋1的內(nèi)頂面固定連接有一個(gè)空心的餅狀體1b，所述外螺紋1c設(shè)置在所述餅狀體1b的側(cè)面上，所述餅狀體1b的底面上具有若干個(gè)透孔1d，供提取液流出。

步驟一：

先將提取器上蓋1與提取器下蓋2旋開，在提取器下蓋2的內(nèi)底面上墊置一片不銹鋼篩網(wǎng)12（316不銹鋼，直徑10mm，400目），然后放入一個(gè)橡膠環(huán)11；接著，將該提取器下蓋2放入天平，精密稱取0.40g丹參飲片粉末填充于該提取器下蓋2中，輕敲以整平丹參飲片粉末餅，再于所述丹參飲片粉末餅上覆蓋一片不銹鋼濾片13（316不銹鋼，直徑19mm，100目），之后旋緊所述提取器上蓋1。

步驟二：

將WAX固相萃取柱3插入固相萃取缸4內(nèi)，采用甲醇6ml，0.15%甲酸水6ml預(yù)洗活化該WAX固相萃取柱3，之后加水5 ml，以保持該WAX固相萃取柱中的提取液充盈且濕潤；在所述WAX固相萃取柱3的入口處插接SPE轉(zhuǎn)接頭5，將所述SPE轉(zhuǎn)接頭5的上端插接至雙公魯爾接頭6，最后將所述雙公魯爾接頭6的上端插接至所述提取器下蓋2的母魯爾接口2b內(nèi)；

步驟三：

將一端插接有魯爾考克閥7的提取軟管8的另一端插入提取液試劑瓶10，并浸沒在提取液（70%甲醇水溶液）中；開啟所述魯爾考克閥7，再將注射器插入所述魯爾考克閥7的母口，拉動(dòng)注射器的活塞桿，抽吸提取液，直至提取液充滿所述提取軟管8和所述魯爾考克閥7后，關(guān)閉所述魯爾考克閥7并抽出該注射器；

步驟四：

將所述魯爾考克閥7的母口插接至所述提取器上蓋1的頂面中心設(shè)置的所述公魯爾接口1a；將所述提取液試劑瓶10放置于高臺(tái)上，使得所述提取液試劑瓶10的瓶底所處的水平面高于所述SPE轉(zhuǎn)接頭5的出液口；接著，開啟所述魯爾考克閥7，并啟動(dòng)抽氣泵14進(jìn)行抽氣，使得提取液流經(jīng)所述丹參飲片粉末并不斷流入所述WAX固相萃取柱3內(nèi)，進(jìn)行固相萃取，如圖5所示；待滴下的液體呈無色后，先關(guān)閉抽氣泵14，再關(guān)閉所述魯爾考克閥7，取下所述雙公魯爾接頭6及其以上的構(gòu)件；然后使用6ml甲醇沖洗該WAX固相萃取柱3，排盡柱內(nèi)液體，再以3.5ml的10%氨水甲醇溶液洗脫兩次，合并洗脫液；其中所使用的抽氣泵14為Waters公司生產(chǎn)的隔膜抽氣泵；

步驟五：

向上述合并的洗脫液中加入甲酸調(diào)pH至近中性，再定容至10ml，高速離心（14000rpm，10min），取上清液2ul進(jìn)樣至HPLC-MS系統(tǒng)；通過HPLC-MS系統(tǒng)，對(duì)丹參飲片中非法添加的若干種合成酸性色素完成檢測。

在此實(shí)施例4中，HPLC色譜條件以及HPLC系統(tǒng)中線性關(guān)系的確定與實(shí)施例1相同，MS質(zhì)譜儀及其所用調(diào)諧液由美國安捷倫公司提供，并按其操作手冊(cè)設(shè)置合適的質(zhì)譜條件。

對(duì)比例1

根據(jù)“聚酰胺固相萃取-HPLC法同時(shí)測定中藥材中16種合成酸性色素”（《中成藥》2015，37（5）：1031-1036）所披露的方法，對(duì)某A廠生產(chǎn)的黃連飲片粉末中非法添加的合成酸性色素進(jìn)行檢測，主要步驟如下：

取黃連飲片粉末（過二號(hào)篩）1.0g，精密稱定，置于50ml 具塞離心管中，用甲醇-0.1%甲酸水溶液 (3:2) 避光超聲提取，第1次10ml提取30min，第2次5ml提取15min，第3次5ml提取15min；然后離心3次，每次離心5min，合并上清液置25ml棕色量瓶中，用甲醇-0.1%甲酸水溶液 (3:2)稀釋至刻度，搖勻；

精密取以上搖勻后的溶液5ml，快速通過聚酰胺固相萃取柱（1g，內(nèi)徑為1cm，依次用甲醇3ml和0.1%甲酸水溶液3ml預(yù)洗），用甲醇-氨水-水（7:2:1）8ml快速洗脫，收集洗脫液，精密加25%甲酸水溶液2ml，搖勻，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)，5分鐘），取上清液2ul進(jìn)樣至HPLC系統(tǒng)，完成檢測。

在此對(duì)比例1中，HPLC色譜條件以及HPLC系統(tǒng)中線性關(guān)系的確定與實(shí)施例1相同。

對(duì)比例2

與對(duì)比例1的檢測條件與具體操作步驟完全相同，唯一區(qū)別在于此對(duì)比例2的檢測對(duì)象為某B廠生產(chǎn)的丹參飲片粉末中非法添加的合成酸性色素。

在以上實(shí)施例1~4中，提取環(huán)節(jié)的耗時(shí)，即從藥材粉末中在線提取色素的所有操作步驟的耗時(shí)，根據(jù)樣品中色素的深淺、以及抽氣泵14的有無而異，包括滲漉時(shí)間在內(nèi)總計(jì)約20~30分鐘；而后續(xù)分離環(huán)節(jié)的耗時(shí)，包括使用氨水甲醇溶液洗脫柱子約3分鐘，合并洗脫液后使用甲酸調(diào)pH以及定容操作約3分鐘，高速離心等操作約10分鐘，因此，總計(jì)約16分鐘。由此可知，使用本發(fā)明所述的提取分離方法，在色素的提取分離階段，或者稱之為HPLC樣品的前處理階段（HPLC進(jìn)樣之前），提取環(huán)節(jié)與分離環(huán)節(jié)的總耗時(shí)約為46分鐘。

然而，與此不同，在以上對(duì)比例1~2中，提取環(huán)節(jié)包括：離線超聲提取3次共60分鐘，離心3次共15分鐘；期間還需每次等待離心機(jī)恢復(fù)到轉(zhuǎn)速為0，并反復(fù)傾出離心后的上清液再補(bǔ)充溶劑，以及用甲醇-0.1%甲酸水溶液稀釋的操作，共計(jì)約30分鐘；因此，提取環(huán)節(jié)耗時(shí)約105分鐘；而后續(xù)分離環(huán)節(jié)包括：精密移取約需3分鐘，洗脫約需3分鐘，加液定容等約3分鐘，離心等操作約5分鐘；因此，分離環(huán)節(jié)耗時(shí)約14分鐘。由此可見，在色素的提取分離階段，提取環(huán)節(jié)與分離環(huán)節(jié)的總耗時(shí)約為119分鐘。

因此，通過比較可知，本發(fā)明所提供的提取分離方法，在線操作更為簡便，省去了一般方法所需的反復(fù)加液、離心、移取、超聲的步驟；尤其是省去了需要精密移取一定量溶液進(jìn)一步凈化的操作；從而大幅縮短了HPLC樣品的前處理耗時(shí)（總耗時(shí)縮短近一半），因此也提高了后續(xù)HPLC檢測效率，甚至HPLC-MS檢測的效率。

此外，發(fā)明人分別按照實(shí)施例1與對(duì)比例1中所記載的操作步驟，以某A廠生產(chǎn)的黃連飲片粉末為基質(zhì)，考察了不同檢測方法對(duì)以下16種合成酸性色素的回收率的影響，檢測數(shù)據(jù)如下表3：

可見，與文獻(xiàn)所記載的方法相比，采用本發(fā)明所述快速檢測方法檢測的16種色素中，有14種色素的回收率顯著提高，有1種色素（日落黃）的回收率基本一致，僅有1種色素（酸性橙）的回收率略低。因此，本發(fā)明所述快速檢測方法普遍提高了色素的回收率。

此外，發(fā)明人分別按照實(shí)施例4與對(duì)比例2中所記載的操作步驟，以某B廠生產(chǎn)的丹參飲片粉末為基質(zhì)，考察了不同檢測方法對(duì)以下16種合成酸性色素的回收率的影響，檢測數(shù)據(jù)如下表4：

可見，與文獻(xiàn)所記載的方法相比，采用本發(fā)明所述快速檢測方法檢測的16種色素中，有13種色素的回收率顯著提高，僅有3種色素（檸檬黃、日落黃、酸性橙）的回收率基本一致。因此，本發(fā)明所述快速檢測方法普遍提高了色素的回收率。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。