本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學領域，尤其是涉及一種透明質酸(HA)測試試劑盒及其制備方法。
背景技術：
透明質酸(hyaluronic acid，HA)是一種大分子葡萄氨基多糖，分子量為4000萬～8000萬，主要由間質細胞合成。HA主要存在于結締組織、皮膚、關節(jié)液、軟骨及玻璃體液等處。構成該部位的組織基質。血清HA水平主要反映肝臟內皮細胞功能及受損程度，反映活動性纖維化，預測肝硬化等疾病的良好指標。如肝硬化，病程長，肝組織纖維化變性程度嚴重，血清HA水平明顯增高，甚至達1000μg/L以上，主要因為肝硬化時門-腔靜脈分流，攜HA的體循環(huán)血進入肝臟分解代謝減少；肝組織受損，肝內皮細胞數(shù)量減少，代謝功能降低。肝硬化時HA增高水平與肝組織病理改變程度有密切關系；HA水平達250μg/L，可判定為肝硬化。慢性活動性肝炎和慢性遷延性肝炎，血清HA水平亦有較明顯改變，前者高于后者，其水平亦與肝細胞損害和肝纖維化活動程度有關；HA水平達165μg/L，可作為慢性活動性肝炎和慢性遷延性肝炎的分界。急性肝炎，由于肝細胞受損，壞死物質間接刺激肝臟間質細胞合成HA增多，血清HA水平可有輕度升高。對肝病患者而言，HA總體水平依據(jù)病損和病理改變程度表現(xiàn)為：肝硬化＞慢性活動性肝炎＞慢性遷延性肝炎＞急性肝炎。可見HA做為反映肝細胞纖維化損害的指標，優(yōu)于ALT。因為ALT在肝細胞停止破壞，肝內纖維化，肝硬化時反而不見升高。對于肝癌，HA亦可有明顯增高。對于肺癌，由于癌浸潤組織及周圍結締組織釋放HA及透明質酸酶抑制物增加，特別是肺間皮細胞癌，血清HA水平可明顯升高，同時肺泡灌洗液HA(即BAL-HA)水平增高遠遠超過血清HA(S-HA)水平，如果BAL-HA/S-HA比值明顯增高，則對肺部惡性腫瘤的診斷有一定參考價值。慢性腎炎及慢性腎功能不全，血清HA水平明顯高于正常對照組，并與肌酐、尿素氮呈正相關。腎病時血清HA可反映腎功能的損害程度。這與血中有毒代謝物聚集刺激組織間質細胞合成HA增多有關。而腎透析前后HA水平沒有明顯變化，由于HA是一種大分子物質，而透析用透膜只能濾過分子量小于35000的物質，故透析法不能把HA清除；HA作為腎臟功能損害的一項指標，反映腎損害的程度有一定參考價值。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種透明質酸(HA)測試試劑盒及其制備方法，特異性強，靈敏度高，獲得檢測結果的時間短，操作方式簡便，檢測結果準確可靠。
為了解決上述問題，本發(fā)明實施例公開了一種透明質酸測試試劑盒，包括：
磁分離試劑，標記HABP蛋白的納米磁性微球，濃度為167μg/ml；
試劑R1，含有堿性磷酸酶標記的aggrecan蛋白，所述堿性磷酸酶標記的aggrecan蛋白濃度為1μg/ml；
試劑R2，含有牛γ球蛋白質組分的緩沖液；
含有HA抗原的牛血清白蛋白組分五(BSA V)溶液的標準品、質控品和校準品；
清洗濃縮液，含有Tween-20和Proclin-300的緩沖液；
稀釋液，含有牛血清白蛋白組分五(BSA V)的溶液；
發(fā)光底物，金剛烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金剛烷的衍生物IUMIPHOS530的濃度為10μg/ml。
優(yōu)選地，各試劑體積比為：磁分離試劑4-6，試劑R1 4-6，試劑R2 4-6，標準品4-6，質控品1-3，校準品1-3，清洗濃縮液20-30，稀釋液10-20，發(fā)光底物25-40。
一種透明質酸測試試劑盒的制備方法，包括如下步驟：
(1)磁分離試劑的制備
配制磁珠緩沖液：分別稱取Tris、NaCl于容器中，配制Tween-20溶液，倒入所述容器中；量取Proclin-300，溶解于水中后倒入所述容器中，在所述容器中加入水，并充分攪拌，使加入的試劑完全溶解；調節(jié)PH值在7.95～8.05范圍內；稱取BSA V(牛血清白蛋白組分五)倒入所述容器中；定容，配制溶液中Tris濃度為4.58g/L，NaCl濃度為6.81g/L,Tween-20濃度為0.96g/L，濃度0.02％的Proclin-300，BSA V濃度為3g/L，PH值在7.95～8.05范圍內，配制好的溶液用0.2μm濾器過濾，過濾后在于2～8℃下保存；
配制磁分離試劑：將DSS(辛二酸二琥珀酰亞胺)溶于DMSO中，配制成濃度為20mg/mL的溶液；取HABP蛋白溶于PH 9.5的0.1mol/L PB緩沖液中，濃度為2mg/mL；將DSS溶液加入到HABP蛋白溶液中，室溫放置90分鐘；離心處理；另取濃度為100mg/ml的磁珠，按與HABP蛋白溶液的體積比為1:2量取，加入反應杯中，經磁鐵吸附2分鐘后吸取上清液；用PH 9.5、0.1mol/L的PB清洗磁珠；將離心處理后的濃縮HABP蛋白溶液加入到清洗后的磁珠中混勻，室溫放置4小時，保持混勻狀態(tài)；磁珠-HABP蛋白混合液中加入1mol/L的Tris溶液，37℃下放置15分鐘，所述Tris的加樣量為1mgHABP蛋白加0.15mlTris；用PH 7.2、0.1mol/L的PB清洗已經標記好HABP蛋白的磁珠；用磁珠保存液稀釋并制得濃度為0.05％的HA磁分離試劑；再將制得的HA磁分離試劑與制得的磁珠緩沖液按照1：1的比例混勻得磁分離試劑；
(2)試劑R1的制備
試劑R1稀釋液的配制：量取Tris、NaCl、Zncl2、Proclin-300、MgCl2于容器中，加入水，充分攪拌，使加入的試劑完全溶解；調節(jié)PH在7.35～7.45范圍內；加入BSA V；定容，配制溶液中Tris濃度為6.06g/L，NaCl濃度為13g/L,Zncl2的濃度為0.05g/L，Proclin-300的濃度0.02％，MgCl2的濃度為0.05g/L，BSA V濃度為3g/L，PH在7.35～7.45范圍內，配制好的溶液用0.2μm濾器過濾，過濾后在于2～8℃下保存；
配制試劑R1，稱取1mg堿性磷酸酶(ALP)溶于生理鹽水中，離心濃縮處理；與離心濃縮后的ALP濃縮液按體積比5:1加入濃度為0.1M的NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘；將攪拌后ALP溶液透析處理；透析處理后的ALP溶液中加入濃度為0.2M、PH9.5的碳酸鹽緩沖液，使醛化ALP的PH升高到9.0～9.5，立即加入aggrecan蛋白，加入aggrecan蛋白的量按與ALP的重量比為1:10加入，在濃度為0.01M的碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時；加入濃度為4mg/ml的NaBH4溶液混勻，置于4℃下2小時；透析處理；之后在攪拌下逐滴加入等體積的飽和硫酸銨，置于4℃下1小時；離心處理棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨清洗，將沉淀物溶于濃度為0.15M、PH7.4的PBS溶液中；透析處理，去除銨離子；離心處理去除沉淀，上清液為酶結合物，按與1M Mgcl2溶液100:1的體積比加入1M Mgcl2溶液，與制得的酶反應物稀釋液以1：100的體積比混合均勻，即的試劑R1；
(3)試劑R2的制備
稱取Tris、NaCl于容器中，量取Proclin-300，用水溶解后加入到所述容器中；在所述容器中加水，攪拌，使得加入到所述容器中的試劑完全溶解，調節(jié)PH在7.35～7.45的范圍內；稱取牛γ球蛋白(IgG)，加入到所述容器中；定容，配制溶液中，Tris濃度為1.56g/L,NaCl濃度為4.23g/L,Proclin-300的濃度0.02％，牛γ球蛋白(IgG)的濃度為0.9g/L,PH在7.35～7.45的范圍內，配制好的溶液用0.2μm濾器過濾，過濾后在于2～8℃下保存；
(4)標準品、質控品及校準品的配制
HA標準品配制濃度為0，25，180，200,600，1500ng/ml；質控品配制濃度點為47.5，600ng/ml；校準品配制濃度為70,600ng/ml；充分混勻后，2-8℃下保存；
(5)清洗濃縮液的配制
稱取Tris和NaCl于容器中，稱取Tween-20于水中溶解后將溶液加入到所述容器中；量取Proclin-300于水中溶解后將溶液加入到所述容器中；向所述容器中加入水，充分攪拌，使所加入的試劑完全溶解；調節(jié)PH在7.35～7.45范圍內；定容，配制溶液中Tris濃度為12.54g/L，NaCl濃度為325.6g/L，Tween-20濃度為5g/L，Proclin-300的濃度0.02％，PH在7.35～7.45的范圍內，配制好的溶液用0.2μm濾器過濾，過濾后在于2～8℃下保存；
(6)稀釋液的配制
稱取NaCl和BSA V于容器中；量取Proclin-300于水中溶解后將溶液加入到所述容器中；定容，配制溶液中NaCl濃度為9g/L和BSA V濃度為60g/L，Proclin-300的濃度0.05％，配制好的溶液用0.2μm濾器過濾，過濾后在于2～8℃下保存；
(7)發(fā)光底物的配制
稱取Tris、NaCl、Na2SO3和Proclin-300于容器中，加入水，充分攪拌，使加入的試劑完全溶解；調節(jié)PH在7.95～8.05的范圍內；定容，配制溶液中Tris濃度為2.35g/L，NaCl濃度為6.41g/L，Na2SO3濃度為0.002g/L，Proclin-300的濃度為0.02％，PH在7.95～8.05范圍內，配制好的溶液用0.2μm濾器過濾，過濾后，配制溶液與IUMIPHOS530按4:1的體積比加入IUMIPHOS530，混勻后于2～8℃下保存。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中，DSS的投入量計算公式為：投入量＝HABP蛋白質量/16000×10×368/CDSS。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述離心處理為將加入DSS的HABP蛋白溶液于高速冷凍離心機中在3000g的離心力下濃縮30分鐘，至濃縮體積為小于0.5ml。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述磁珠直徑為0.9～1.5μm，加入濃度為100mg/ml的磁珠。
一種透明質酸測試試劑盒的測試方法，包括如下步驟：
(1)加HA標準品、質控品、待測標本至對應試管底部；
(2)加試劑R1至每一試管中；
(3)加試劑R2至每一試管中；
(4)加磁分離試劑至每一試管中；
(5)各試管內試劑混勻后，置37℃水浴30分鐘；
(6)將各試管放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘；緩慢倒出上清液，除去各試管內的液滴；
(7)清洗濃縮液用水稀釋7倍后，加稀釋后的清洗液至每一試管中，混勻；
(8)重復操作步驟(5)、(6)、(5)一遍；
(9)加底物溶液至試管中混勻3秒，迅速用準備好的發(fā)光檢測儀進行檢測。
優(yōu)選地，所述步驟(1)之前使用校準品進行曲線校正，并用質控品進行質量控制。
本發(fā)明具有如下有益效果：
(1)本發(fā)明試劑盒將化學發(fā)光技術與免疫磁微粒相結合，提供了一種接近均相的反應體系，與現(xiàn)有技術相比，在出結果時間上較傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫法少10-20分鐘，同時使用HABP和aggrecan蛋白來檢測HA抗原使得檢測的準確性得到了很大的提高。
(2)本發(fā)明公開了一種新的專用試劑R2，通過添加牛IgG蛋白，和使用Tris體系使得反應過程更加穩(wěn)定可靠，具有更高的檢測靈敏度和特異性，并達到了較佳的性能參數(shù)。(3)試劑盒中的磁分離試劑，試劑R1，試劑R2，標準品，質控品，校準品，清洗濃縮液、稀釋液以及發(fā)光底物的配比優(yōu)化合理，在此反應體系下檢測結果精準可靠，并且該配比體系為本發(fā)明試劑盒的使用有效期及檢測性能提供了有力保障。
(4)本發(fā)明試劑盒因其近液相反應，同時采用了HABP和aggrecan兩種蛋白來檢測，使得試劑的精確度、靈敏度以及穩(wěn)定性均優(yōu)于現(xiàn)有技術中的同類產品。
具體實施方式
下文中將結合實施例來詳細說明本發(fā)明。需要說明的是，在不沖突的情況下，本發(fā)明中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。
實施例1
本實施例提供了一種透明質酸(HA)測試試劑盒，所述試劑盒包括：
磁分離試劑，標記有HABP蛋白的納米磁性微球，所述標記HABP蛋白的納米磁性微球的濃度為167μg/ml；
試劑R1，含有堿性磷酸酶標記的aggrecan蛋白的偶聯(lián)物，所述堿性磷酸酶標記的aggrecan蛋白的偶聯(lián)物濃度為1μg/ml；
試劑R2，含有牛γ球蛋白質組分的緩沖液；
標準品，含有HA抗原的牛血清白蛋白組分五(BSA V)溶液，濃度為0(S0)、25(S1)、180(S2)、200(S3)、600(S4)、1500(S5)ng/ml；
質控品，含有HA抗原的牛血清白蛋白組分五(BSA V)溶液，濃度為47.5ng/ml,600ng/ml；
校準品，含有HA抗原的牛血清白蛋白組分五(BSA V)溶液，濃度為70ng/ml,600ng/ml；
清洗濃縮液，含有Tween-20和Proclin-300的緩沖液
稀釋液，含有牛血清白蛋白組分五(BSA V)的溶液；
發(fā)光底物，金剛烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金剛烷的衍生物IUMIPHOS530的濃度為10μg/ml。
其中，本實施例試劑盒中各試劑按下述體積比配制：磁分離試劑4，試劑R1 4，試劑R2 4，校準品4，質控品1，校準品1，清洗濃縮液20，稀釋液10，發(fā)光底物25。
本實施例透明質酸(HA)測試試劑盒的制備方法，包括如下步驟：
第一步：磁分離試劑的制備過程
一、磁珠緩沖液配制操作規(guī)程：配方見表1，以配制1L為例：
(1)稱取Tris 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，稱取0.96g Tween-20于20ml容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
(2)用移液器將Proclin-300量取0.2ml于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；然后在1L容器中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；
(3)調節(jié)PH計測量其PH值；用4M HCl或4M NaOH調PH，測量其PH在7.95～8.05之間即符合要求；
(4)稱取BSA V(牛血清白蛋白)3g倒入上述1L容器中；
(5)最后定容至1000ml，測PH值，范圍在7.95～8.05之間即符合要求，用0.2um濾器過濾即得；過濾完后貼好標簽于2～8℃冷庫貯存；
表1磁珠緩沖液的配制
二、磁分離試劑的配制
(1)將1.0mg DSS(辛二酸二琥珀酰亞胺)溶于50ul DMSO中，即濃度為20mg/mL；取2mg HABP蛋白溶于PH 9.5的0.1mol/L PB緩沖液中至總體積為1ml；
(2)計算DSS的投入量，按照以下公式計算：(HABP蛋白質量/2000)×10×368/CDSS)，其中CDSS指代DSS的物質的量濃度mol/L；
(3)用移液槍吸取相應體積的DSS加入到步驟1的HABP蛋白溶液中，置室溫90min；
(4)將步驟3HABP蛋白溶液加入到Centricon-10濃縮管中,然后放入到sigma2-16k高速冷凍離心機中在3000g的離心力下濃縮約30min至體積為0.5ml；
(5)取0.5ml磁珠，所述的磁珠直徑在0.01～5.0μm之間，加入5ml反應杯中，放入專用試管架，經磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；
(6)每次加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB，混勻30秒，上架，去上清，重復操作3次；將步驟4獲得的HABP蛋白溶液加入到磁珠中，混勻后室溫反應4小時，保持混勻狀態(tài)；
(7)加入0.3ml 1mol/L的Tris溶液37℃15分鐘，其中Tris的加樣量為1mgHABP蛋白加0.15mlTris；
(8)每次加入1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB清洗已經標記的磁珠，混勻30秒，上架，去上清，重復操作3次；
(9)用100ml磁珠保存液將磁珠轉入125ml玻璃瓶，即為0.05％的HA磁分離試劑；
(10)將步驟9獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1：1的比例混勻，即得本發(fā)明試劑盒中分離試劑。
第二步：試劑R1的制備過程
一、試劑R1稀釋液配制操作規(guī)程：配方見表2，以配制1L為例：
(1)取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl2 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl20.05g于燒瓶中；然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；
(2)用4M HCl或4M NaOH調PH，測量使PH在7.35-7.45范圍內；
(3)稱取BSA V 3g倒入上述燒瓶中；
(4)最后定容至1000ml，測PH值，范圍在7.35-7.45之間即符合要求，用0.2um濾器過濾；過濾完后，貼好標簽于2-8℃冷庫貯存；
表2試劑R1稀釋液的配制
二、試劑R1的配制(堿性磷酸酶(ALP)標記的aggrecan蛋白)
(1)取10mgALP加入5ml生理鹽水中，加入到Centricon-10濃縮管中，3000rpm離心大約20分鐘，濃縮至1毫升。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
(3)將上述溶液裝入透析袋中，用1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜。
(4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化ALP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入0.05mgaggrecan蛋白，在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。
(5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4℃2小時。
(6)將上述液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4PBS透析，4℃過夜。
(7)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時。
(8)3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
(9)將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析約5個小時，去除銨離子后，10000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，加入體積1/100的1M Mgcl2溶液4℃保存。收集到的堿性磷酸酶(ALP)與aggrecan蛋白的偶聯(lián)物用上述酶反應物稀釋液以1：100的體積比混合均勻，即得本發(fā)明試劑盒中試劑R1。
第三步：試劑R2的制備
試劑R2配制操作規(guī)程：配方見表3，以配制1L為例：
(1)稱取Tris(三羥甲基氨基甲烷，分子式:(HOCH2)3CNH2)1.56g和NaCl 4.23g于1L燒杯中；用移液器將Proclin-300量取0.2ml于少量純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
(2)用量筒量取800ml純化水于燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解；用4MHCL或4M NaOH調PH，測量其范圍在7.35～7.45之間；
(3)稱取牛γ球蛋白IgG 0.9g于800ml純化水的燒杯中；
(4)最后定容1000ml，完全溶解后，測PH值，范圍在7.35～7.45之間即符合要求，用0.2μm濾器過濾；過濾完后，貼好標簽于2-8℃冷庫貯存；
表3試劑R2的配制
第四步：標準品和質控品的配制：
(1)最高點：最高濃度點為X，目標點濃度為A,B,C,D,E,F，配制V體積的溶液時，需加入原料的體積如表4所示
表4配制V體積溶液時需加入原料的體積
(2)透明質酸(HA)定量測定試劑盒HA標準品原料配制成濃度點為0，0.1，1，5，50，100ng/ml；質控品配制的濃度點為0.6，50ng/ml。校準品配制的濃度點為1，50ng/ml
(3)完全溶解后，貼好標簽于2-8℃冷庫貯存；
第五步：清洗濃縮液配制操作規(guī)程：配方見表5，以配制1L為例：
(1)稱取Tris 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；
(2)稱取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
(3)用移液器將Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
(4)用量筒量取800ml純化水于上述1L容器中，充分攪拌，直至完全溶解；
(5)用4M HCL或4M NaOH調PH，測量其范圍在7.35－7.45之間；
(6)最后定容1000ml，測PH值，范圍在7.35-7.45之間即符合要求，完全溶解后用0.2μm濾器過濾即得；過濾完后，貼好標簽于2-8℃冷庫貯存；
表5清洗濃縮液的配制
第六步：稀釋液配方見表6，以配制1L為例：
(1)稱取NaCl9.0g和BSA V 60g于1L的容器中；
(2)用移液器將Proclin-300量取0.5ml加10ml純化水溶解，倒入上述1L的容器中；
(3)最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過濾，貼好標簽于2～8℃冷庫貯存；
表6稀釋液的配制
第七步：發(fā)光底物配制操作規(guī)程：配方見表7，以配制1L為例：
(1)稱取Tris 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO3 0.002g和Proclin-300 0.2ml于1L燒杯中；
(2)用量筒量取800ml純化水于燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解；用4M HCl或4M NaOH調PH，測量其范圍在7.95～8.05之間；
(3)最后定容至1000ml，測PH值，范圍在7.95～8.05之間即符合要求，用0.2μm濾器過濾；過濾完后，加入250ml IUMIPHOS530，混勻后，貼好標簽于2～8℃冷庫貯存；
表7發(fā)光底物的配制
本實施例透明質酸(HA)測試試劑盒的測試方法，包括如下步驟：
(1)使用前，需使用試劑盒內校準品(采用全自動儀器)進行曲線校正，并用質控品進行質量控制；測試結果在質控范圍內方可進行樣本的檢測。
(2)加4份HA標準品、質控品、待測標本至對應試管底部；
(3)加4份試劑R1至每一試管中；
(4)加4份試劑R2至每一試管中；
(5)加4份磁分離試劑至每一試管中；
(6)用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30s后，置37℃水浴30分鐘；
(7)試管連架放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘。緩慢的倒轉分離器倒出上清液，把倒轉的試管連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
(8)清洗濃縮液用純化水稀釋7倍后，加26.7份稀釋后的清洗液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s。加樣時應避免加樣力度過大而導致磁珠濺出。混勻要徹底；
(9)重復步驟(6)、(7)、(6)一遍；
(10)加25份底物溶液至試管中混勻3秒，迅速用準備好的發(fā)光檢測儀進行檢測；
(11)如遇到高值HOOK樣本，建議臨床醫(yī)師根據(jù)其余測試指標選擇合適的稀釋倍數(shù)用稀釋液對樣品進行稀釋。
實施例2
本實施例提供了一種透明質酸(HA)測試試劑盒，所述試劑盒包括：
磁分離試劑，標記有HABP蛋白的納米磁性微球，所述標記有HABP蛋白的納米磁性微球的濃度為167μg/ml；
試劑R1，含有堿性磷酸酶標記的aggrecan蛋白，所述堿性磷酸酶標記的aggrecan蛋白濃度為1μg/ml；
試劑R2，含有牛γ球蛋白質組分的緩沖液；
標準品，含有HA抗原的牛血清白蛋白組分五(BSA V)溶液，濃度為0(S0)ng/ml、25(S1)ng/ml、70(S2)ng/ml、200(S3)ng/ml、500(S4)ng/ml、1000(S5)ng/ml；
質控品，含有HA抗原的牛血清白蛋白組分五(BSA V)溶液，濃度為45.5ng/ml,500ng/ml；
校準品，含有HA抗原的牛血清白蛋白組分五(BSA V)溶液，濃度為70ng/ml,500ng/ml；
清洗濃縮液，含有Tween-20和Proclin-300的緩沖液
稀釋液，含有牛血清白蛋白組分五(BSA V)的溶液；
發(fā)光底物，金剛烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金剛烷的衍生物IUMIPHOS530的濃度為10μg/ml。
其中，本實施例試劑盒中各試劑按下述體積比配制：磁分離試劑5.1，試劑R1 5.1，試劑R2 4，校準品5.1，質控品1.7，校準品1.7，清洗濃縮液25，稀釋液17，發(fā)光底物34。
本實施例透明質酸(HA)測試試劑盒的制備方法與實施例1相同。
本實施例透明質酸(HA)測試試劑盒的測試方法，包括如下步驟：
(1)使用前，需使用試劑盒內校準品(采用全自動儀器)進行曲線校正，并用質控品進行質量控制；測試結果在質控范圍內方可進行樣本的檢測。
(2)加5.1份HA標準品、質控品、待測標本至對應試管底部；
(3)加5.1份試劑R1至每一試管中；
(4)加5.1份試劑R2至每一試管中；
(5)加5.1份磁分離試劑至每一試管中；
(6)用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30s后，置37℃水浴30分鐘；
(7)試管連架放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘。緩慢的倒轉分離器倒出上清液，把倒轉的試管連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
(8)清洗濃縮液用純化水稀釋7倍后，加26.7份稀釋后的清洗液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s。加樣時應避免加樣力度過大而導致磁珠濺出?；靹蛞獜氐?；
(9)重復步驟(6)、(7)、(6)一遍；
(10)加34份底物溶液至試管中混勻3秒，迅速用準備好的發(fā)光檢測儀進行檢測；
(11)如遇到高值HOOK樣本，建議臨床醫(yī)師根據(jù)其余測試指標選擇合適的稀釋倍數(shù)用稀釋液對樣品進行稀釋。
實施例3
本實施例提供了一種透明質酸(HA)測試試劑盒，所述試劑盒包括：
磁分離試劑，標記有小鼠抗人HA的單克隆HABP蛋白的納米磁性微球，所述標記有HABP蛋白的納米磁性微球的濃度為167μg/ml；
試劑R1，含有堿性磷酸酶標記的aggrecan蛋白，所述堿性磷酸酶標記的aggrecan蛋白濃度為1μg/ml；
試劑R2，含有牛γ球蛋白質組分的緩沖液；
標準品，含有HA抗原的牛血清白蛋白組分五(BSA V)溶液，濃度為0(S0)ng/ml、30(S1)ng/ml、90(S2)ng/ml、180(S3)ng/ml、450(S4)ng/ml、900(S5)ng/ml；
質控品，含有HA抗原的牛血清白蛋白組分五(BSA V)溶液，濃度為60ng/ml,450ng/ml；
校準品，含有HA抗原的牛血清白蛋白組分五(BSA V)溶液，濃度為1ng/ml,50ng/ml；
清洗濃縮液，含有Tween-20和Proclin-300的緩沖液
稀釋液，含有牛血清白蛋白組分五(BSA V)的溶液；
發(fā)光底物，金剛烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金剛烷的衍生物IUMIPHOS530的濃度為10μg/ml。
本實施例透明質酸(HA)測試試劑盒的制備方法與實施例1相同。
本實施例透明質酸(HA)測試試劑盒的測試方法，包括如下步驟：
(1)使用前，需使用試劑盒內校準品(采用全自動儀器)進行曲線校正，并用質控品進行質量控制；測試結果在質控范圍內方可進行樣本的檢測。
(2)加6份HA標準品、質控品、待測標本至對應試管底部；
(3)加6份試劑R1至每一試管中；
(4)加6份試劑R2至每一試管中；
(5)加6份磁分離試劑至每一試管中；
(6)用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30s后，置37℃水浴30分鐘；
(7)試管連架放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘。緩慢的倒轉分離器倒出上清液，把倒轉的試管連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
(8)清洗濃縮液用純化水稀釋7倍后，加26.7份稀釋后的清洗液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s。加樣時應避免加樣力度過大而導致磁珠濺出。混勻要徹底；
(9)重復步驟(6)、(7)、(6)一遍；
(10)加40份底物溶液至試管中混勻3秒，迅速用準備好的發(fā)光檢測儀進行檢測；
(11)如遇到高值HOOK樣本，建議臨床醫(yī)師根據(jù)其余測試指標選擇合適的稀釋倍數(shù)用稀釋液對樣品進行稀釋。
本發(fā)明透明質酸(HA)測試試劑盒的臨床試驗：
1、檢測數(shù)據(jù)
標本采自1000例正常體檢、供血者。樣本體檢結果均無肝、腦、腎、消化道疾病，半年內無輸血和大手術史，婦女不在妊娠期和哺乳期。將測值進行統(tǒng)計學分析，得出正常血清參考范圍：3～120ng/ml。
本數(shù)據(jù)僅供參考，不同地區(qū)、不同個體以及采用不同方法進行檢測，所測得的HA水平也會有所不同，建議各實驗室建立自己的正常值范圍。不可僅憑本方法得出的HA值作出診斷，僅作為中間數(shù)據(jù)參考作用，應結合臨床其他資料分析結果，包括病人的具體情況和治療狀況。通過其他方法得到的樣品中的HA濃度值與本試劑盒測定結果不具有直接的可比性。超出試劑盒測定范圍的樣本，系統(tǒng)將無法給出確切的數(shù)值。如欲測定其確切的結果，建議稀釋后再進行測定。本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，不能單獨作為確診或排除病例的依據(jù)，為達到診斷目的，此檢測結果要與臨床檢查、病史和其它的檢查結合使用。本品可用于血清樣本的測定，用于其他體液樣本中HA濃度測定的可靠性未得到充分確認。
2、本發(fā)明試劑盒性能指標
分析靈敏度定義為：對20次零標準品的測定，取其2倍的平均偏差，其在標準曲線上所對應的濃度即為分析靈敏度；分析靈敏度：0.03ng/ml；精密性：批內變異CV％≦10.0％；批間變異CV％≦15.0％；線性系數(shù)：r≥0.9900；線性范圍：0.03-100ng/ml：受3種主要類似交叉反應物的干擾情況如表8所示。
表8與主要類似物的交叉反應情況：
最后應說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明各實施例技術方案的精神和范圍。