本發(fā)明涉及分子印跡技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用分子印跡試紙條快速檢測三聚氰胺的方法。

背景技術(shù)：

三聚氰胺（MEL）是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，簡稱三胺，分子量為126.13。是一種無色單斜棱晶體，無味，在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度都很低。三聚氰胺是一種用途廣泛的有機(jī)化工產(chǎn)品，作為生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂（MF）的原料是其最主要的用途，含三聚氰胺的化學(xué)化工產(chǎn)品具有不易燃，耐水、耐熱、耐電弧、耐老化、耐化學(xué)腐蝕的優(yōu)點(diǎn)。

三聚氰胺及其衍生物本身并不是蛋白質(zhì)，對(duì)人體健康不僅不能提供營養(yǎng)反而對(duì)身體健康造成負(fù)面影響。但因其含氮量較高，達(dá)到66%，常被非法加入牛奶、餅干等日常食物中，如2008年9月，我國爆發(fā)的嬰幼兒奶粉中非法添加三聚氰胺污染事件。

牛奶中添加三聚氰胺之后，只能在檢測中造成蛋白質(zhì)含量增高的假象，長期重復(fù)大量攝入三聚氰胺可能導(dǎo)致膀胱結(jié)石、腎結(jié)石等。食品與藥品監(jiān)管局（FDA）設(shè)定三聚氰胺的每人每日耐受攝入量（TDI）為0.63 mg/kg體重。對(duì)嬰幼兒奶粉中三聚氰胺的安全閡值要求更為嚴(yán)格，設(shè)定每日耐受攝入量為成年人的十分之一，體重以7.0 kg計(jì)算，則嬰幼兒配方奶粉中的安全值為0.0441 mg。因此，牛奶中三聚氰胺的檢測具有重要的意義。而傳統(tǒng)評(píng)價(jià)牛奶質(zhì)量的凱氏定氮法只能測定氮的總量，但并不能有效區(qū)分氮的來源和種類。常規(guī)的痕量三聚氰胺分析方法主要包括高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測法(GC-MS)、高效液相色譜-質(zhì)譜法 （HPLC-MS）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），這些方法或多或少都存在儀器操作較為復(fù)雜、繁瑣、時(shí)間較長等缺點(diǎn)，難以滿足野外或大批量現(xiàn)場快速篩選檢測的要求。在三聚氰胺檢測方法中，迫切需要一種具有更高靈敏度和檢出限的快速檢測方法，而分子印跡技術(shù)具有的高選擇性和高靈敏度的特點(diǎn)，如能與快速檢測試紙結(jié)合從而建立對(duì)三聚氰胺更為簡便快捷且靈敏度符合日常分析要求的方法是具有非常良好的前景及實(shí)際應(yīng)用意義的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有的三聚氰胺的檢測方法存在前處理復(fù)雜、時(shí)間長、成本高等現(xiàn)狀，提供一種三聚氰胺的快速檢測方法，該方法簡單、快速、成本低。本發(fā)明可用于牛奶樣品中三聚氰胺的快速分析檢測。

具體步驟為：

(1) 三聚氰胺分子印跡聚合物的制備

稱取0.0020 ~ 0.0032 g N,N-亞甲基雙丙烯酰胺，加入20 mL 濃度為3×10^-4 mol/L的三聚氰胺（MEL）溶液和2 ~ 7mL 分析純?chǔ)?甲基丙烯酸，超聲10分鐘，靜置過夜后，加入0.01 ~ 0.03g過硫酸銨引發(fā)，反應(yīng)2 ~ 7分鐘，即制得三聚氰胺分子印跡聚合物（MIP），在冰箱中儲(chǔ)存，備用。

(2) 高碘酸氧化法制備葡萄糖氧化酶標(biāo)記三聚氰胺(GOD-MEL)

稱取4 ~ 6 mg葡萄糖氧化酶（GOD）溶于1 mL二次水，加入0.2 mL濃度為0.1 mol/L的NaIO₄溶液，室溫下避光攪拌20分鐘；將上述溶液裝入透析袋（MW4000）中，對(duì)1 mmol/L pH = 4.4的HAC-NaAC緩沖液透析，4 ℃過夜，加入20 mL濃度為0.2 mol/L pH = 9.5碳酸鹽緩沖液，使GOD的pH升高至9.0 ~ 9.5；取另一個(gè)10 mL比色管，加入8 ~ 12 mg三聚氰胺和1 mL濃度為0.01 mol/L、pH = 9.5的碳酸鹽緩沖液，與上述GOD混合，室溫避光攪拌2小時(shí)；往混合液中加入0.1 mL濃度為4 mg/mL 的NaBH₄混勻，4 ℃放置2小時(shí)；將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)濃度為0.15 mol/L 、pH = 7.4的PBS緩沖液透析，4 ℃過夜；透析完成后，將標(biāo)記物分裝入1 mL比色管中，4 ℃避光保存。

(3) 試紙條的制作

剪取4 × 1 cm（長×寬）的塑料基底，在黑色基底區(qū)域刻出0.5 × 0.5 cm的孔穴區(qū)域，將硝酸纖維素膜（NC膜）貼在該孔穴區(qū)域背面，將步驟（1）制得的三聚氰胺分子印跡聚合物滴加在NC膜表面，分布均勻后室溫條件下晾干，接著，往MIP上滴加15 ~ 25 mL質(zhì)量百分比濃度為25%的乙醇，洗脫2 ~ 4分鐘，用二次水淋洗，以除去三聚氰胺分子印跡聚合物中的三聚氰胺和部分吸附物，晾干，從而制備得到保留有特異性識(shí)別孔穴的三聚氰胺分子印跡試紙條，避光保存。

(4) 檢測方法

取步驟（3）制得的三聚氰胺分子印跡試紙條一支，將15 ~ 25 μL標(biāo)記好的GOD-MEL溶液滴加到已經(jīng)除去模板分子的分子印跡試紙條上，孵化反應(yīng)5分鐘，用二次水淋洗，洗掉未孵化上去的GOD-MEL和其他的雜質(zhì)，競爭過程是在不同濃度MEL的樣品中進(jìn)行的，滴加15 ~25μL待測樣品溶液至孵化后的試紙條上，反應(yīng)3分鐘，用二次水沖洗；將競爭后的試紙條滴加15 ~ 25 μL的染料底液（包含濃度為3×10^-4 mol/L的熒光桃紅、濃度為0.02 g/mL的葡萄糖、濃度為0.1 mol/L的HAc-NaAc緩沖液），進(jìn)行顯色反應(yīng)。調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的最大激發(fā)波長為515 nm、激發(fā)光(EX)狹縫寬度為1.5 nm、發(fā)射光(EM)狹縫寬度為3.0 nm，將顯色反應(yīng)后的試紙條置于熒光光度計(jì)中進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測，實(shí)現(xiàn)定量分析。另外，對(duì)于大批量樣品的在線監(jiān)測可借助半定量分析完成，即用肉眼對(duì)顏色進(jìn)行簡單判斷（目視比色法）或者用紫外燈進(jìn)行拍照對(duì)比。

(5) 工作曲線的繪制

取步驟（3）制備好的三聚氰胺分子印跡試紙條，按步驟（4）對(duì)不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行熒光檢測，記錄熒光強(qiáng)度，繪制工作曲線。通過對(duì)工作曲線的對(duì)數(shù)回歸分析可知，試紙條的熒光強(qiáng)度差與1×10^-8 mol/L ~ 1×10^-4 mol/L三聚氰胺濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為ΔI_F = 61.19lgC + 572.83，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9944。

(6) 牛奶樣品中三聚氰胺含量的測定

移取300 ~ 600 μL市售牛奶樣品，用0.1 mol/L pH = 5的醋酸醋酸鈉緩沖溶液定容至10 mL，作為待測樣品。取步驟（3）制得的三聚氰胺分子印跡試紙條一支，將20 μL標(biāo)記好的GOD-MEL溶液滴加到已經(jīng)除去模板分子的分子印跡試紙條上，孵化反應(yīng)5分鐘，用二次水淋洗，洗掉未孵化上去的GOD-MEL和其他的雜質(zhì)。滴加20 μL待測樣品溶液至孵化后的試紙條上，反應(yīng)3分鐘，用二次水沖洗即可。將競爭后的試紙條滴加20 μL的染料底液（包含濃度為3×10^-4 mol/L的熒光桃紅、濃度為0.02 g/mL的葡萄糖、濃度為0.1 mol/L的HAc-NaAc緩沖液），進(jìn)行顯色反應(yīng)。將顯色反應(yīng)后的試紙條置于熒光光度計(jì)中進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測，根據(jù)工作曲線計(jì)算樣品中三聚氰胺的濃度。

本發(fā)明利用化學(xué)法聚合得到三聚氰胺的分子印跡聚合物，制備成對(duì)三聚氰胺具有特異性識(shí)別能力的分子印跡試紙條，試紙條反應(yīng)區(qū)表面的孔穴能夠同時(shí)識(shí)別三聚氰胺及具有相同結(jié)構(gòu)的葡萄糖氧化酶標(biāo)記的三聚氰胺。將洗脫模板分子的試紙條在高濃度的葡萄糖氧化酶標(biāo)記的三聚氰胺中孵化后，印跡孔穴被葡萄糖氧化酶標(biāo)記的三聚氰胺占據(jù)。隨后競爭反應(yīng)是在樣品中的三聚氰胺和印跡膜上的葡萄糖氧化酶標(biāo)記的三聚氰胺之間進(jìn)行，三聚氰胺能夠競爭取代葡萄糖氧化酶標(biāo)記的三聚氰胺而重新占據(jù)孔穴。隨著樣品中三聚氰胺分子濃度的增加，印跡膜上被競爭取代的葡萄糖氧化酶標(biāo)記的三聚氰胺就越多，即殘留在印跡膜上的葡萄糖氧化酶就越少。而印跡膜表面的葡萄糖氧化酶能夠與底液中的葡萄糖發(fā)生酶解反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫進(jìn)一步氧化分解底液中的熒光桃紅使其褪色，因此，通過熒光分光光度計(jì)檢測試紙條的熒光強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)樣品中三聚氰胺的快速定性、定量或半定量分析檢測。

本發(fā)明的有益效果是：

1. 本發(fā)明利用分子印跡試紙條及熒光分光光度法來檢測三聚氰胺，克服了現(xiàn)有的三聚氰胺檢測方法前處理復(fù)雜、時(shí)間長、成本高等現(xiàn)狀，該方法具有簡單、快速、成本低、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，可用于牛奶制品中三聚氰胺的在線痕量檢測，實(shí)現(xiàn)對(duì)奶制品的食品安全生產(chǎn)監(jiān)管的目的。

2. 本發(fā)明待檢樣品溶液避免了復(fù)雜樣品的前處理過程。

3. 本發(fā)明檢測方法靈敏度高，在1.0×10^-9 mol/L ~ 1.0×10^-4 mol/L濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度差與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的負(fù)對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系，檢測方法的有效回收率為91.2 % ~ 112.05 %，最低檢出限為9.0 × 10^-10 mol/L（3δ_b/K，δ_b為11次空白樣品檢測的標(biāo)準(zhǔn)偏差；K為工作曲線的斜率）。

附圖說明

圖1為本發(fā)明工作曲線標(biāo)準(zhǔn)熒光比色卡。

圖中：工作曲線紫外照片從左往右依次為空白組、1.0×10^-9mol/L、1.0×10^-8mol/L、1.0×10^-7mol/L、1.0×10^-6mol/L、1.0×10^-5mol/L、1.0×10^-4mol/L。

圖2為本發(fā)明三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液含量與熒光顯色強(qiáng)度的關(guān)系圖。

圖中：三聚氰胺濃度a ~ g分別為：1.0×10^-4mol/L、1.0×10^-5mol/L、1.0×10^-6mol/L、1.0×10^-7mol/L、1.0×10^-8mol/L、1.0×10^-9mol/L、空白組。

圖3為本發(fā)明三聚氰胺濃度的校準(zhǔn)曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但不限制本發(fā)明的使用范圍和應(yīng)用范圍。

實(shí)施例1：

（1）三聚氰胺分子印跡聚合物的制備

稱取0.0020 g N,N-亞甲基雙丙烯酰胺，加入20 mL 濃度為3×10^-4 mol/L的三聚氰胺（MEL）溶液和2mL α-甲基丙烯酸，超聲10分鐘，靜置過夜后，加入0.013g過硫酸銨引發(fā)，反應(yīng)2分鐘，即制得三聚氰胺分子印跡聚合物（MIP），在冰箱中儲(chǔ)存，備用。

（2）高碘酸氧化法制備葡萄糖氧化酶標(biāo)記三聚氰胺(GOD-MEL)

稱取4 mg葡萄糖氧化酶（GOD）溶于1 mL二次水，加入0.2 mL濃度為0.1 mol/L的 NaIO₄溶液，室溫下避光攪拌20分鐘；將上述溶液裝入透析袋（MW4000）中，對(duì)1 mmol/L pH = 4.4的HAC-NaAC緩沖液透析，4 ℃過夜，加入20 mL 0.2 mol/L pH = 9.5碳酸鹽緩沖液，使GOD的pH升高至9.0；取另一個(gè)10 mL比色管，加入8 mg三聚氰胺和1 mL 0.01 mol/L pH = 9.5的碳酸鹽緩沖液，與上述GOD混合，室溫避光攪拌2小時(shí)；往混合液中加入0.1 mL濃度為4 mg/mL的NaBH₄混勻，4 ℃放置2小時(shí)；將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15 mol/L pH = 7.4的PBS緩沖液透析，4 ℃過夜；透析完成后，將標(biāo)記物分裝入1 mL比色管中，4 ℃避光保存。

（3）試紙條的制作

剪取4 × 1 cm（長×寬）的塑料基底，在黑色基底區(qū)域刻出0.5 × 0.5 cm的孔穴區(qū)域，將硝酸纖維素膜（NC膜）貼在該孔穴區(qū)域背面，將步驟（1）制得的三聚氰胺分子印跡聚合物滴加在NC膜表面，分布均勻后室溫條件下晾干，接著，往MIP上滴加15 mL質(zhì)量百分比濃度為25%的乙醇，洗脫2分鐘，用二次水淋洗，以除去三聚氰胺分子印跡聚合物中的三聚氰胺和部分吸附物，晾干，從而制備得到保留有特異性識(shí)別孔穴的三聚氰胺分子印跡試紙條，避光保存。

（4）待測樣品溶液的制備：精密移取1.0 mL待檢牛奶樣品于10 mL具塞比色管中，用0.1 mol/L pH = 5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液定容，作為樣品組；平行移取1.0 mL同批次牛奶樣品至10 mL具塞比色管中，加入0.5 mL 1.0×10^-4 mol/L三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.1 mol/L pH = 5的醋酸鈉緩沖溶液定容作為加標(biāo)組，每組平行測定三次。

（5）取步驟（3）制得的三聚氰胺分子印跡試紙條，在其反應(yīng)區(qū)內(nèi)滴加20 μL GOD-MEL，孵化反應(yīng)5分鐘，用10 mL二次水淋洗，洗掉未孵化上去的GOD-MEL和其他的雜質(zhì)。

（6）將20 μL步驟（4）樣品組的待測樣品滴加到步驟（5）孵化后的試紙條上，反應(yīng)3分鐘，用二次水沖洗。

（7）將競爭后的試紙條滴加20 μL的染料底液（包含濃度為3 × 10^-4mol/L熒光桃紅、濃度為0.02g/mL葡萄糖、濃度為0.1 mol/L的HAc-NaAc緩沖液），進(jìn)行顯色反應(yīng)3分鐘。

（8）取熒光比色皿，將顯色反應(yīng)后的試紙條置于RF5301熒光光度計(jì)中進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測，該體系采用最大激發(fā)波長為515 nm，EX和EM的狹縫寬度分別為1.5 nm、3.0 nm，進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測，且半定量分析時(shí)可用肉眼對(duì)顏色進(jìn)行簡單判斷以及用紫外燈進(jìn)行拍照，與熒光標(biāo)準(zhǔn)比色卡進(jìn)行比對(duì)。

（9）加標(biāo)樣品組測定方法同上，采集熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例2：

（1）三聚氰胺分子印跡聚合物的制備

稱取0.003 g N,N-亞甲基雙丙烯酰胺，加入20 mL 濃度為3×10^-4 mol/L的三聚氰胺（MEL）溶液和5mL α-甲基丙烯酸，超聲10分鐘，靜置過夜后，加入0.02g過硫酸銨引發(fā)，反應(yīng)5分鐘，即制得三聚氰胺分子印跡聚合物（MIP），在冰箱中儲(chǔ)存，備用。

（2）高碘酸氧化法制備葡萄糖氧化酶標(biāo)記三聚氰胺(GOD-MEL)

稱取5 mg葡萄糖氧化酶（GOD）溶于1 mL二次水，加入0.2 mL濃度為0.1 mol/L的 NaIO₄溶液，室溫下避光攪拌20分鐘；將上述溶液裝入透析袋（MW4000）中，對(duì)1 mmol/L pH = 4.4的HAC-NaAC緩沖液透析，4 ℃過夜，加入20 mL 0.2 mol/L pH = 9.5碳酸鹽緩沖液，使GOD的pH升高至9.5；取另一個(gè)10 mL比色管，加入10 mg三聚氰胺和1 mL 0.01 mol/L pH = 9.5的碳酸鹽緩沖液，與上述GOD混合，室溫避光攪拌2小時(shí)；往混合液中加入0.1 mL濃度為4 mg/mL的NaBH₄混勻，4 ℃放置2小時(shí)；將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15 mol/L pH = 7.4的PBS緩沖液透析，4 ℃過夜；透析完成后，將標(biāo)記物分裝入1 mL比色管中，4 ℃避光保存。

（3）試紙條的制作

剪取4 × 1 cm（長×寬）的塑料基底，在黑色基底區(qū)域刻出0.5 × 0.5 cm的孔穴區(qū)域，將硝酸纖維素膜（NC膜）貼在該孔穴區(qū)域背面，將步驟（1）制得的三聚氰胺分子印跡聚合物滴加在NC膜表面，分布均勻后室溫條件下晾干，接著，往MIP上滴加20 mL質(zhì)量百分比濃度為25%的乙醇，洗脫3分鐘，用二次水淋洗，以除去三聚氰胺分子印跡聚合物中的三聚氰胺和部分吸附物，晾干，從而制備得到保留有特異性識(shí)別孔穴的三聚氰胺分子印跡試紙條，避光保存。

（4）準(zhǔn)確移取1.0 mL待檢牛奶樣品于10 mL具塞比色管中，用0.1 mol/L pH=5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液定容，作為樣品組。平行移取1.0 mL同批次牛奶樣品至10 mL具塞比色管中，加入1.0 mL 1.0×10^-6 mol/L三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.1 mol/L pH=5的醋酸鈉緩沖溶液定容作為加標(biāo)組，每組平行測定三次。

（5）取步驟（3）制備的三聚氰胺分子印跡試紙條，在其反應(yīng)區(qū)內(nèi)滴加20 μL GOD-MEL，孵化反應(yīng)5分鐘，用10 mL二次水淋洗，洗掉未孵化上去的GOD-MEL和其他的雜質(zhì)。

（6）將20 μL步驟（4）樣品組的待測樣品滴加到步驟（5）孵化后的試紙條上，反應(yīng)3分鐘，用二次水沖洗。

（7）將競爭后的試紙條滴加20 μL的染料底液（包含3 × 10^-4 mol/L熒光桃紅、0.02 g/mL葡萄糖、0.1 mol/L的HAc-NaAc緩沖液），進(jìn)行顯色反應(yīng)3分鐘。

（8）取熒光比色皿，將顯色反應(yīng)后的試紙條置于RF5301熒光光度計(jì)中檢測其熒光強(qiáng)度，設(shè)置最大激發(fā)波長為515 nm，EX和EM的狹縫寬度分別為1.5 nm、3.0 nm進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測。另外，對(duì)于半定量分析，可用肉眼對(duì)顏色進(jìn)行簡單判斷以及用紫外燈進(jìn)行拍照，與熒光標(biāo)準(zhǔn)比色卡進(jìn)行比對(duì)即可完成。

（9）加標(biāo)樣品組測定方法同上，采集熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例3：

（1）三聚氰胺分子印跡聚合物的制備

稱取0.0032 g N,N-亞甲基雙丙烯酰胺，加入20 mL 濃度為3×10^-4 mol/L的三聚氰胺（MEL）溶液和7mL α-甲基丙烯酸，超聲10分鐘，靜置過夜后，加入0.03g過硫酸銨引發(fā)，反應(yīng)7分鐘，即制得三聚氰胺分子印跡聚合物（MIP），在冰箱中儲(chǔ)存，備用。

（2）高碘酸氧化法制備葡萄糖氧化酶標(biāo)記三聚氰胺(GOD-MEL)

稱取6 mg葡萄糖氧化酶（GOD）溶于1 mL二次水，加入0.2 mL濃度為0.1 mol/L的 NaIO₄溶液，室溫下避光攪拌20分鐘；將上述溶液裝入透析袋（MW4000）中，對(duì)1 mmol/L pH = 4.4的HAC-NaAC緩沖液透析，4 ℃過夜，加入20 mL 0.2 mol/L pH = 9.5碳酸鹽緩沖液，使GOD的pH升高至9.5；取另一個(gè)10 mL比色管，加入12 mg三聚氰胺和1 mL 0.01 mol/L pH = 9.5的碳酸鹽緩沖液，與上述GOD混合，室溫避光攪拌2小時(shí)；往混合液中加入0.1 mL濃度為4 mg/mL 的NaBH₄混勻，4 ℃放置2小時(shí)；將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15 mol/L pH = 7.4的PBS緩沖液透析，4 ℃過夜；透析完成后，將標(biāo)記物分裝入1 mL比色管中，4 ℃避光保存。

（3）試紙條的制作

剪取4 × 1 cm（長×寬）的塑料基底，在黑色基底區(qū)域刻出0.5 × 0.5 cm的孔穴區(qū)域，將硝酸纖維素膜（NC膜）貼在該孔穴區(qū)域背面，將步驟（1）制得的三聚氰胺分子印跡聚合物滴加在NC膜表面，分布均勻后室溫條件下晾干，接著，往MIP上滴加25 mL質(zhì)量百分比濃度為25%的乙醇，洗脫4分鐘，用二次水淋洗，以除去三聚氰胺分子印跡聚合物中的三聚氰胺和部分吸附物，晾干，從而制備得到保留有特異性識(shí)別孔穴的三聚氰胺分子印跡試紙條，避光保存。

（4）待測樣品溶液的制備：精密移取1.0 mL待檢牛奶樣品于10 mL具塞比色管中，用0.1mol/L pH=5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液定容，作為樣品組。平行移取1.0 mL同批次牛奶樣品至10 mL具塞比色管中，加入0.4 mL 1.0×10^-6 mol/L三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.1 mol/L pH=5的醋酸鈉緩沖溶液定容作為加標(biāo)組，每組平行測定三次。

（5）取步驟（3）制得的三聚氰胺分子印跡試紙條，在其反應(yīng)區(qū)內(nèi)滴加20 μL葡萄糖氧化酶標(biāo)記三聚氰胺溶液，孵化反應(yīng)5分鐘，用10 mL二次水淋洗，洗掉未孵化上去的GOD-MEL和其他的雜質(zhì)。

（6）將20 μL步驟（4）樣品組的待測樣品滴加到步驟（5）孵化后的試紙條上，反應(yīng)3分鐘，用二次水沖洗。

（7）將競爭后的試紙條滴加20 μL的染料底液（包含3 × 10^-4 mol/L熒光桃紅、0.02g/mL葡萄糖、0.1 mol/L的HAc-NaAc緩沖液），進(jìn)行顯色反應(yīng)3分鐘。

（8）取熒光比色皿，將顯色反應(yīng)后的試紙條置于RF5301熒光光度計(jì)中進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測，該體系采用最大激發(fā)波長為515 nm，EX和EM的狹縫寬度分別為1.5 nm、3.0 nm進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測，且半定量分析時(shí)可用肉眼對(duì)顏色進(jìn)行簡單判斷以及用紫外燈進(jìn)行拍照，與熒光標(biāo)準(zhǔn)比色卡進(jìn)行比對(duì)。

（9）加標(biāo)樣品組測定方法同上，采集熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)上述檢測方法及計(jì)算公式，三批牛奶樣品中未檢出添加三聚氰胺，加標(biāo)回收率在91.2％ ~ 112.05％范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3％ ~ 2.7％。三聚氰胺的測定方法回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表1。