一種基于膠乳的三聚氰胺快速檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了包被有三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液及其制備方法，包含包被有三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液的試劑盒，以及使用包被有三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液檢測(cè)樣品中三聚氰胺的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種基于膠乳的三聚氰胺快速檢測(cè)方法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和食品安全的交叉學(xué)科領(lǐng)域，更具體涉及一種基于聚苯乙烯膠乳微球檢測(cè)三聚氰胺的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在食品行業(yè)中，通過(guò)凱式定氮法(GB/T5009.5-2010 ;第一法)測(cè)定氮原子含量從而間接計(jì)算蛋白質(zhì)含量。近年來(lái)，一些不法商販將化工原料三聚氰胺添加到食品或飼料中，以求提高通過(guò)凱式定氮法測(cè)定的表觀蛋白含量。三聚氰胺可導(dǎo)致人體泌尿系統(tǒng)產(chǎn)生結(jié)石，如膀胱結(jié)石和腎結(jié)石等疾病，因此被嚴(yán)格禁止添加到食品中。
[0003]目前三聚氰胺的檢測(cè)方法有高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用法等，這些方法雖然檢測(cè)靈敏度高，但前處理步驟操作時(shí)間長(zhǎng)，儀器價(jià)格昂貴，且需取樣并送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，不適合樣品中三聚氰胺的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。目前可用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，相較之下應(yīng)用起來(lái)較靈活，但檢測(cè)成本依然很貴，對(duì)技術(shù)操作人員操作也有一定的技術(shù)要求，而膠體金卡雖然操作十分簡(jiǎn)便、但只能是定性分析，不能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定量分析。
[0004]免疫比濁法(J.M.Singer et al.，Am.J.Med.21，888-92; 1956)主要用于微生物和病毒感染等的檢測(cè)和臨床診斷。在免疫比濁法中，將抗體包被在微球表面。當(dāng)包含特定抗原的樣品與乳膠懸液混合時(shí)，導(dǎo)致可見(jiàn)的凝集，增加了樣品的渾濁度。通過(guò)測(cè)量樣品與抗體包被乳膠懸液反應(yīng)后的吸光度，并與使用已知濃度的抗原繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而測(cè)定樣品中抗原的濃度。
[0005]免疫比濁法中使用的微球包括多種類(lèi)型，例如玻璃、硅石、納米金屬、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺顆粒等?？赏ㄟ^(guò)被動(dòng)吸附或化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)，例如碳化二亞胺(EDC)法、溴化偶聯(lián)等方式將抗體連接到微球上。在膠乳微球表面包被抗體的方法通常需要首先活化膠乳微球表面的官能團(tuán)，使其能夠與抗體蛋白反應(yīng)。例如，通常使用EDC活化膠乳微球表面的羧基，使其與蛋白質(zhì)的氨基偶聯(lián)。
[0006]通常認(rèn)為通過(guò)使用碳化二亞胺(EDC)/N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)的活化法更有利于蛋白質(zhì)與微球之間的相互作用，因此是最為常用的偶聯(lián)方法。此外，還有使用EDC/NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)混合物的活化法。然而，這兩種方法中要先后使用兩種試劑，反應(yīng)系統(tǒng)和方法較為復(fù)雜，極易導(dǎo)致微球發(fā)生凝集，不利于抗體包被微球的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007]與此相比，單獨(dú)使用EDC的活化法(或稱(chēng)作一步EDC法)的步驟較為簡(jiǎn)單且產(chǎn)率較高。然而，一步EDC法多用于不包含羧基的配體(例如寡核苷酸，如DNA)與表面帶有羧基的微球之間的偶聯(lián)。如果待偶聯(lián)的配體也包含羧基基團(tuán)(例如蛋白質(zhì)，如抗體)，其可能被EDC活化，導(dǎo)致配體之間的聚合，從而無(wú)法獲得期望的產(chǎn)物。
[0008]因此，需要開(kāi)發(fā)一種避免微球或抗體之間相互凝集產(chǎn)生沉淀，從而適合穩(wěn)定生產(chǎn)抗體包被微球的生產(chǎn)工藝，從而獲得能夠利用免疫比濁法快速、準(zhǔn)確檢測(cè)樣品中的三聚氰胺。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]目前，EDC活化法中多使用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)作為活化緩沖劑，但本發(fā)明人經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用MES緩沖的EDC溶液無(wú)法制備包被三聚氰胺抗體的微球溶液。本發(fā)明人經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)表明，在膠乳體系中，加入活化液后極易使帶羧基的微球相互凝集產(chǎn)生沉淀，保持膠乳狀態(tài)則需要改進(jìn)活化緩沖液的成分。因此，本發(fā)明人對(duì)EDC活化法進(jìn)行了大量研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包含吐溫20的磷酸鹽緩沖液能夠提供有利于抗體與微球之間偶聯(lián)的最適環(huán)境，能夠避免微球相互凝集產(chǎn)生沉淀，適合穩(wěn)定生產(chǎn)抗體包被微球，從而完成了本發(fā)明。
[0010]在第一方面，本發(fā)明提供了一種包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液的制備方法，所述方法包括以下步驟:將表面帶有羧基的膠乳微球稀釋在活化緩沖液中，其中，所述活化緩沖液為包含0.5?1.0g/L吐溫20的10?40mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4-7.8。
[0011]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的制備方法使用一步EDC活化法活化所述膠乳微球表面的羧基。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“一步EDC活化法”是指在活化過(guò)程中不使用除碳化二亞胺外的其他活化劑的EDC活化法。所述“其他活化劑”包括諸如Sulfo-NHS、NHS的試劑。
[0012]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的制備方法包括以下步驟:
[0013]I)將表面帶有羧基的膠乳微球稀釋在活化緩沖液中，其中，所述活化緩沖液為包含0.5?L Og/L吐溫20的10?40mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4-7.8。
[0014]2)加入活化劑混合反應(yīng)，其中所述活化劑為碳化二亞胺；
[0015]3)加入三聚氰胺單克隆抗體，進(jìn)行包被反應(yīng)；
[0016]4)加入淬滅液終止反應(yīng)；
[0017]5)加入封閉液以封閉游離的羧基，從而獲得包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液。
[0018]在本發(fā)明中，所述膠乳微球可以是通常用于免疫檢測(cè)的任何膠乳微球，例如聚苯乙烯微球、聚丙烯酰胺微球等。已知有很多廠商提供各種不同型號(hào)的膠乳微球，例如Microparticles GmbH,PolyMicrospheres Inc.等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)具體需要選擇適合的表面帶有羧基的膠乳微球。
[0019]在本發(fā)明中，優(yōu)選使用聚苯乙烯膠乳微球。本發(fā)明所述膠乳微球的粒徑可以在100-200nm之間,優(yōu)選130_170nm。在本發(fā)明中，使用表面帶有羧基的膠乳微球,從而通過(guò)碳化二亞胺反應(yīng)與三聚氰胺單克隆抗體連接。所述膠乳微球的羧基含量為100-200 μ eq/g，優(yōu)選 160 ?170μ eq/g。
[0020]在本發(fā)明中，碳化二亞胺的加入量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)具體需要確定。例如，可以加入羧基數(shù)量15%-30%的碳化二亞胺。
[0021]本發(fā)明使用的三聚氰胺單克隆抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法制備，例如雜交瘤技術(shù)等；也可以通過(guò)商購(gòu)獲得，例如購(gòu)自北京博奧生物技術(shù)有限責(zé)任公司(型號(hào)bsm-2182M)等。
[0022]在本發(fā)明中，膠乳微球與三聚氰胺單克隆抗體之間的比例可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)具體需要確定。膠乳微球與三聚氰胺單克隆抗體之間的比例通常在5:1至10:1之間，優(yōu)選10:1。所加入的抗體過(guò)多或過(guò)少都易導(dǎo)致膠乳微球發(fā)生凝集。
[0023]本發(fā)明使用的淬滅液可以是通常用于終止碳化二亞胺連接反應(yīng)的任何試劑，例如60-80g/L甘氨酸,優(yōu)選75g/L甘氨酸。[0024]本發(fā)明使用的淬滅液可以是通常用于封閉膠乳微球游離的羧基的任何試劑，例如血清白蛋白，如180-220g/L牛血清白蛋白，優(yōu)選200g/L牛血清白蛋白。
[0025]由本發(fā)明所述方法制備的包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液可以現(xiàn)配現(xiàn)用。在使用時(shí)，通過(guò)離心去除上清，使用復(fù)溶液清洗膠乳微球，并定容至指定的濃度。所述復(fù)溶液可以包含8-15g/L甘氨酸、0.5-1.5g/L疊氮鈉、8_13g/L山梨醇、3_8g/L牛血清白蛋白和
1.5-2.5g/L EDTA.Na2, ρΗ7.8-8.2。
[0026]優(yōu)選地，所述復(fù)溶液包含11.26g/L甘氨酸、1.0g/L疊氮鈉、10.0g/L山梨醇、5.0g/L 牛血清白蛋白和 2.0g/L EDTA.Na2, ρΗ8.0。
[0027]也可以將按照本發(fā)明所述方法制備的包被三聚氰胺抗體的膠乳微球復(fù)溶在所述復(fù)溶液中，并在2?8° C下低溫保存。
[0028]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的制備方法包括以下步驟:
[0029]I)使用活化緩沖液將粒徑130_170nm，羧基含量為160?170 μ eq/g的聚苯乙烯膠乳微球稀釋1%的膠乳液，其中所述活化緩沖液包含0.5?lg/L吐溫20的10?40mM磷酸鹽緩沖液，ρΗ7.4-7.8 ；
[0030]2)加入羧基數(shù)量15%_30%的碳化二亞胺，混勻后反應(yīng)5min ；
[0031]3)以膠乳微球與三聚氰胺單克隆抗體為10:1的比例加入三聚氰胺單克隆抗體，并在37。C、300rpm反應(yīng)2-3小時(shí)；
[0032]4)加入75g/L甘氨酸，中止包被反應(yīng)；
[0033]5)加入200g/L牛血清白蛋白，在37° C、300rpm反應(yīng)30_60min，從而封閉游離的
竣基;
[0034]6)離心去除上清，使用復(fù)溶液清洗，其中所述復(fù)溶液包含11.26g/L甘氨酸、1.0g/L 疊氮鈉、10.0g/L 山梨醇、5.0g/L 牛血清白蛋白和 2.0g/L EDTA.Na2，ρΗ8.0-8.2 ；
[0035]7)重復(fù)步驟6)三次，隨后使用所述復(fù)溶液定容至膠乳濃度為0.1%，并在2-8° C下低溫保存。
[0036]與常用的MES緩沖活化液相比，本發(fā)明采用的活化緩沖液提供了三聚氰胺單克隆抗體與表面帶有羧基的膠乳微球進(jìn)行偶聯(lián)的最適離子濃度和ΡΗ，避免了在加入三聚氰胺抗體后發(fā)生不利的凝集現(xiàn)象。
[0037]本發(fā)明采用的復(fù)溶液提供了有利于包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液保持穩(wěn)定的最適離子濃度和pH。使用所述復(fù)溶液可以將包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液在常溫下保持I年以上，同時(shí)避免抗體脫落。
[0038]在第二方面，本發(fā)明提供了所述活化緩沖液用于制備包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液的用途。
[0039]在第三方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)樣品中三聚氰胺的試劑盒，所述試劑盒包含以下組分:
[0040]I) Rl試劑:包含PEG6000和吐溫20的磷酸鹽緩沖液，pH7.0-7.6 ；
[0041 ] 2) R2試劑:包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液；和
[0042]3)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品。
[0043]所述Rl試劑是通常用于免疫比濁法的緩沖劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要配制適合的緩沖劑。在本發(fā)明中，可使用包含PEG6000和吐溫20的磷酸鹽緩沖液，例如包含3%PEG6000和(λ 2%吐溫20的40mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0-7.6，優(yōu)選ρΗ7.4。在需要長(zhǎng)期保存的情況下，還可任選地添加0.1%疊氮鈉以用作防腐劑。
[0044]所述R2試劑是包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液。所述三聚氰胺抗體和膠乳微球如本發(fā)明第一方面所述。優(yōu)選地，所述R2試劑是根據(jù)本發(fā)明第一方面所述制備方法制備的包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液。所述膠乳微球溶液的濃度可以為1%(10倍濃縮液)或 0.1%。
[0045]所述試劑盒還可任選地包含使用所述試劑檢測(cè)樣品中三聚氰胺的說(shuō)明書(shū)。
[0046]與常規(guī)檢測(cè)三聚氰胺的方法相比，本發(fā)明所述的試劑盒操作簡(jiǎn)單、成本低、檢測(cè)速度快，且能定量進(jìn)行分析。
[0047]所述試劑盒可用于檢測(cè)樣品中三聚氰胺的濃度。因此，在第三方面，本發(fā)明提供了所述試劑盒用于檢測(cè)樣品中三聚氰胺濃度的應(yīng)用。所述樣品可以為食品，特別是乳制品，如鮮奶、奶粉、奶酪，奶油和酸奶。
[0048]第四方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)樣品中三聚氰胺濃度的免疫比濁方法，其包括以下步驟:
[0049]I)將所述樣品與包含PEG6000和吐溫20的磷酸鹽緩沖液(ρΗ7.0-7.6)，混合溫育；
[0050]2)加入包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液；
[0051]3)測(cè)量所得混合物在加入所述膠乳微球溶液后1s至5分鐘之間任意兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度差值A(chǔ)A54tl ；
[0052]4)根據(jù)使用三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中的三聚氰胺濃度。
[0053]使用三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法是本領(lǐng)域已知的。通常，將濃度已知的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品與適合的緩沖劑(例如，本發(fā)明所述的Rl試劑)混合溫育，隨后，加入包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液，混合后溫育5分鐘，并根據(jù)吸光度的變化繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0054]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0055]本發(fā)明所述三聚氰胺檢測(cè)試劑盒及其方法，通過(guò)加入Rl、R2兩種試劑，根據(jù)反應(yīng)前后吸光度變化而定量分析樣品三聚氰胺的濃度。
[0056]本發(fā)明所有試劑配制簡(jiǎn)單、操作容易，R2試劑中偶聯(lián)物不易脫落，穩(wěn)定性很強(qiáng)，試劑制作成本低，耗時(shí)短，能夠在較短時(shí)間內(nèi)大量生產(chǎn)。對(duì)檢測(cè)的技術(shù)人員的技術(shù)要求不高、檢測(cè)速度快、檢測(cè)全過(guò)程只需7分鐘，此外，不依賴(lài)專(zhuān)業(yè)儀器，可以真正實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)快速檢測(cè)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0057]圖1為顯示不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品在反應(yīng)過(guò)程中吸光度變化的反應(yīng)曲線圖，其中橫坐標(biāo)為反應(yīng)時(shí)間，縱坐標(biāo)為吸光度變化。
[0058]圖2為不同時(shí)間下測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)為反應(yīng)物濃度(ppb)，縱坐標(biāo)為吸
光度變化。
[0059]圖3為根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度差值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)為反應(yīng)物濃度(PPb)，縱坐標(biāo)為吸光度變化。
[0060]圖4為顯示穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的對(duì)比結(jié)果，其中，橫坐標(biāo)為反應(yīng)時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為吸光度變化。檢測(cè)濃度為27ppb，時(shí)間間隔為7天、在37度條件下保存。【具體實(shí)施方式】
[0061]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于這些【具體實(shí)施方式】。
[0062]實(shí)施例1:緩沖劑Rl的配制
[0063]40mM、PH7.4的PBS配制:①稱(chēng)取磷酸二氫鈉0.0624g，用超純水定容10ml ;②稱(chēng)取磷酸氫二鈉7.16g，用超純水定容500ml ;③稱(chēng)取氯化鈉0.14g，加入①試劑3.8ml和②試劑 16.2ml。
[0064]此為40mM，PH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)。
[0065]Rl的配制:
[0066]PEG6000 0.3g
[0067]疊氮鈉0.0lg
[0068]吐溫-2020ul
[0069]稱(chēng)量好各種化學(xué)品后，用40mM、PH7.4的PBS定容至1ml。
[0070]由于PEG6000在常溫下不溶解，因此將該試劑放置60度水浴鍋中加熱，并不斷攪動(dòng)混勻。溶解后的試劑為無(wú)色透明液體。
[0071]配好試劑后于2-8° C冰箱中保存，，保存期限為12個(gè)月。
[0072]實(shí)施例2:用于制備和保存包被三聚氰胺抗體的膠乳微球的試劑
[0073]活化緩沖液:
[0074]1mM的PBS (PH7.4)的準(zhǔn)備:將實(shí)施例1制備的40mM的PBS稀釋四倍，隨后，在所得1mM PBS中加入0.70g/L的吐溫-20。
[0075]復(fù)溶液:
[0076]甘氨酸11.3g/L
[0077]疊氮鈉1.0g/L
[0078]山梨醇10.0g/L
[0079]BSA 5.0g/L
[0080]EDTA.Na2 2.0g/L
[0081]先稱(chēng)量各種固體化合物，然后用超純水定容，為增加溶解速度，可置于37度溫箱中。最后，加氫氧化鈉溶液(20%)調(diào)PH8.00±0.08。配好的試劑為無(wú)色澄清透明的液體。配制好的復(fù)溶液可保存在2-8° C冰箱中，保存期限為12個(gè)月。
[0082]淬滅液:
[0083]甘氨酸75g/L
[0084]稱(chēng)取甘氨酸后，用超純水定容?；靹蚝螅撊芤簽闊o(wú)色透明液體。配好試劑后于2-8度冰箱中保存。保存期限為60天。
[0085]封閉液:
[0086]BSA 200g/L
[0087]稱(chēng)量BSA固體，用超純水定容，放置60度水浴鍋中，邊加熱邊搖動(dòng)瓶子，加速溶解。溶解后的BSA溶液為淡黃色的液體。配制好的封閉液可保存在2-8° C冰箱中，保存期限為60天。[0088]實(shí)施例3:包被三聚氰胺抗體的膠乳微球的制備工藝
[0089]反應(yīng)體系為10ul。
[0090]活化
[0091]取1.5ml離心管，加入活化緩沖液70ul，用移液器取1ul的聚苯乙烯膠乳微球(購(gòu)自美國(guó)PolyMicrospheres公司，粒徑大小130_170nm,羧基含量160-170 μ eq/g)到此離心管中，不斷吹打，使膠乳顆粒均勻的分散到活化緩沖液中，從而獲得白色乳濁液。
[0092]稱(chēng)量固體碳化二亞胺鹽酸鹽(EDCA ;購(gòu)自上海共價(jià)化學(xué)科技有限公司)溶于活化緩沖液中，濃度為0.001mg/ul。在上述膠乳顆粒緩沖液中加入1ul EDCA溶液，在常溫下活化5min?；罨玫哪z乳體系仍為白色乳濁液，但粘稠度有所下降。
[0093]偶聯(lián)
[0094]將活化好的膠乳體系加入三聚氰胺單克隆抗體(購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限責(zé)任公司，型號(hào)bsm-2182M)，加入量為1ul (10mg/ml )，添加時(shí)應(yīng)迅速用槍頭吹打，盡量在短時(shí)間內(nèi)快速混勻?；靹蚝蟮玫桨咨闈嵋?。將加有三聚氰胺抗體的膠乳體系置于37° C、300rpm的恒溫振湯器中反應(yīng)2小時(shí)。完成后體系仍為白色乳池液。
[0095]淬滅
[0096]此時(shí)三聚氰胺膠乳偶聯(lián)物已形成，在體系中加入淬滅液80ul，用槍頭吹打混勻，于37度、300rpm恒溫振蕩器中反應(yīng)30min。結(jié)束后體系應(yīng)無(wú)沉淀物。
[0097]封閉
[0098]加入封閉液17ul，用槍頭吹打混勻，放置于30度、300rpm恒溫振蕩箱中，封閉時(shí)間為45min。封閉結(jié)束后,該體系為白色乳濁液,且無(wú)沉淀物。
[0099]純化
[0100]將離心管放入冷凍高速離心機(jī)中，45000g、8min離心(注:在離心前應(yīng)將離心機(jī)預(yù)冷到10度，防止高速離心時(shí)產(chǎn)生較高溫度)，離心后，白色膠乳微球大部分都沉淀在離心管底部，上清液中含有極少量微球，但仍然看起來(lái)無(wú)色透明，倒掉上清液，或用槍頭將上清液取出，加入10ul復(fù)溶液，用槍頭吹打混勻，再置于超聲波清洗儀中將微球分散。超聲波清洗儀功率99%，時(shí)間lmin。重復(fù)此步驟三次。最后一次加入復(fù)溶液lml。
[0101]此時(shí)溶液為白色乳濁液，經(jīng)檢測(cè)體系中沒(méi)有無(wú)顆粒狀沉淀。此為R2試劑，吸光度約為0.2-0.9，如吸光度過(guò)高，可再次進(jìn)行稀釋。
[0102]保存
[0103]該試劑應(yīng)置于2-8° C冰箱中密封保存，保存期限為12個(gè)月。
[0104]實(shí)施例4:不同EDC活化方法對(duì)膠乳系統(tǒng)穩(wěn)定性的影響
[0105]在本實(shí)施例中，采用常規(guī)的EDC+NHS的活化方法進(jìn)行膠乳微球的活化，并與本發(fā)明的活化方法進(jìn)行比較。具體步驟如下:
[0106]首先，按照實(shí)施例3的描述使用EDC活化膠乳微球:
[0107]用移液器取1ul的聚苯乙烯膠乳微球(購(gòu)自美國(guó)PolyMicrospheres公司，粒徑大小130_170nm，羧基含量160-170 μ eq/g)到離心管中，不斷吹打，使膠乳顆粒均勻的分散到本發(fā)明的活化緩沖液中，至終濃度1%。
[0108]稱(chēng)量固體EDCA(購(gòu)自上海共價(jià)化學(xué)科技有限公司)溶于本發(fā)明的活化緩沖液中，濃度為0.001mg/ul。在上述膠乳顆粒緩沖液中加入1ul上述EDCA溶液，振蕩混勻，反應(yīng)5min，測(cè)吸光值I。
[0109]隨后，將所得膠乳微球平均分成兩份，其中一份不添加NHS，另一份加入NHS，用量約為EDC用量的2-3倍，混勻后，測(cè)量?jī)煞輼悠返奈庵?。
[0110]表1:不同活化方法對(duì)膠乳體系穩(wěn)定性的影響
[0111]
【權(quán)利要求】
1.一種包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液的制備方法，其包括: 1)將表面帶有羧基的膠乳微球稀釋在活化緩沖液中，其中，所述活化緩沖液為包含0.5?lg/L吐溫20的10?40mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4-7.8 ； 2)加入活化劑，混合反應(yīng)，其中所述活化劑為碳化二亞胺； 3)加入三聚氰胺單克隆抗體，進(jìn)行包被反應(yīng)； 4)加入淬滅液終止反應(yīng)；和 5)加入封閉液以封閉游離的羧基，從而獲得包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，使用一步EDC活化法活化所述膠乳微球表面的羧基。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述活化緩沖液為包含0.7g/L吐溫20的1mM磷酸鹽緩沖液，PH7.4。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述膠乳微球?yàn)榱綖?00-200nm，羧基含量為100-200 μ eq/g的聚苯乙烯膠乳微球。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法還包括以下步驟: 6)將步驟5獲得的膠乳微球溶液離心去除上清，使用復(fù)溶液清洗，其中所述復(fù)溶液包含8-15g/L甘氨酸、0.5-1.5g/L疊氮鈉、8-13g/L山梨醇、3_8g/L牛血清白蛋白和1.5-2.5g/L EDTA.Na2, ρΗ7.8-8.2 ；7)重復(fù)步驟6)三次，隨后將溶于所述復(fù)溶液的膠乳溶液在2-8°C下低溫保存。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述復(fù)溶液包含11.26g/L甘氨酸、1.0g/L疊氮鈉、10.0g/L 山梨醇、5.0g/L 牛血清白蛋白和 2.0g/L EDTA.Na2, ρΗ8.0。
7.通過(guò)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述方法制備的包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液。
8.用于檢測(cè)樣品中三聚氰胺的試劑盒，其包含: 1)Rl試劑:包含PEG6000和吐溫20的磷酸鹽緩沖液，ρΗ7.0-7.6 ； 2)R2試劑:權(quán)利要求7所述的包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液；和 3)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品。
9.一種用于檢測(cè)樣品中三聚氰胺濃度的方法，其包括以下步驟:1)將所述樣品與包含PEG6000和吐溫20的磷酸鹽緩沖液(pH7.0-7.6)，混合溫育； 2)加入權(quán)利要求7所述的包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液； 3)測(cè)量所得混合物在加入所述膠乳微球溶液后1s至5分鐘之間任意兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度差值ΛΑ540 ;和 4)根據(jù)使用三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中的三聚氰胺濃度。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述樣品選自鮮奶、奶粉、奶酪、奶油和酸奶。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK104034893SQ201310074726
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月8日
【發(fā)明者】王琳, 張小波, 鄭清林 申請(qǐng)人:北京普析通用儀器有限責(zé)任公司