本發(fā)明涉及一種羊布魯氏菌病參考血清庫，屬于生物制品
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景布魯氏菌病(布病)是由布魯氏菌或稱布魯氏菌(Brucella)引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的人獸共患病，嚴(yán)重地威脅著人和多種動物的生命健康。本病不但對動物的繁殖和生產(chǎn)性能具有嚴(yán)重危害，更重要的是，人感染布魯氏菌后，往往難以治愈，從而造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此在布魯氏菌流行的國家，消除布病一直是公共衛(wèi)生計劃中最重要的目標(biāo)之一。布病在世界存在已有久遠(yuǎn)的歷史，人類對該病的研究認(rèn)識逐步加深，對布病的診斷方法在不斷完善，準(zhǔn)確率不斷提高?？傮w上，布魯氏菌診斷方法主要包括抗原診斷法和抗體診斷法，一般實驗室，主要通過檢測動物體內(nèi)的布魯氏菌抗體來判斷動物是否感染布魯氏菌。布魯氏菌血清學(xué)方法不僅包括傳統(tǒng)的凝集試驗(如：虎紅抗原平板凝集試驗、試管抗原凝集試驗、乳環(huán)凝集試驗)，還包括敏感性高、特異性強的ELISA方法、熒光偏振試驗(FPA)、膠體金試紙條等新的檢測技術(shù)。凝集試驗是布魯氏菌病診斷的一種常用的方法，包括血清凝集實驗、乳環(huán)沉淀試驗和抗人免疫球蛋白試驗，其中經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗(STAT)、平板凝集試驗(PAT)，以上方法在發(fā)達國家已經(jīng)基本停止使用，取而代之的是緩沖布魯氏菌抗原凝集試驗如虎紅平板凝集試驗(RBPT)?；⒓t平板凝集抗原是用抗原性良好的布魯氏菌菌株經(jīng)培養(yǎng)，滅活，離心收集菌體后用虎紅染料染色后懸浮于乳酸緩沖液中制成，該方法靈敏度高，價格便宜，操作方便，檢測快速，適于動物群體布魯氏菌病的普查。在國際貿(mào)易中是牛、羊、豬布魯氏菌病檢測的指定試驗，在我國也用于人布魯氏菌病監(jiān)測的初篩。在布魯氏菌病血清學(xué)檢驗中一致認(rèn)為補體結(jié)合試驗(CFT)在特異性上優(yōu)于其他方法，常被用來對試管凝集試驗和虎紅平板凝集試驗檢測為陽性或可疑的病例進行定性檢測。補體結(jié)合試驗一直被認(rèn)為是最有效的布病診斷方法，至今尚沒有一種診斷方法能取代補體結(jié)合試驗在血清學(xué)診斷中的地位。但補體結(jié)合試驗所需要的溶血素的制備困難，試驗操作繁瑣，難以在臨床上普遍使用，而且由于豬體內(nèi)的補體會干擾豚鼠補體的作用，導(dǎo)致敏感性下降。ELISA是一種與CFT效果相當(dāng)?shù)脑\斷方法，該方法操作方便，靈敏度高，特異性較好，一次可以完成大量樣品的檢測，既可以作為篩選試驗應(yīng)用于動物群體檢疫，還可以作為確診試驗。ELISA不僅可以應(yīng)用于血清抗體的檢測，還可應(yīng)用于乳樣中抗體的檢測。牛的布魯氏菌病ELISA檢測方法已是國際貿(mào)易中指定的檢測方法之一，其他種布魯氏菌的ELISA檢測方法也是研究的熱點。目前，常用于羊布魯氏菌病檢測的血清學(xué)方法主要包括：試管凝集試驗(STAT)、虎紅平板凝集試驗(RBPT)、補體結(jié)合試驗(CFT)、布魯氏菌競爭ELISA(cELISA)抗體檢測試劑盒。除此之外，熒光偏振(FPA)診斷方法也逐步被應(yīng)用于羊布病的診斷，該方法是一種利用免疫學(xué)和生物物理學(xué)原理開發(fā)的新型快速診斷方法，其基本原理是用熒光素標(biāo)記抗原或者抗體，當(dāng)抗原與特定抗體結(jié)合后，形成抗原/抗體復(fù)合物，分子量增大，使發(fā)射光激發(fā)熒光素分子后偏振角度減小，通過計算偏振程度的大小，判斷血清是否為布魯氏菌陽性血清。不同血清學(xué)診斷方法各有其優(yōu)缺點，如何客觀評價各種血清學(xué)診斷方法的特異性和敏感性評價，離不開具有一定規(guī)模、具有代表性的、背景清楚的血清樣本庫。本發(fā)明專利為羊布魯氏菌參考血清庫，為評價各種針對羊的布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法奠定了基礎(chǔ)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是通過收集或制備具有一定規(guī)模、一定代表性的、背景清楚的羊魯氏菌不同感染狀態(tài)(自然感染、疫苗免疫、健康)的山羊和綿羊的血清，經(jīng)分裝凍干和各種血清學(xué)檢測，建成羊布魯氏菌參考血清庫，為布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法的科學(xué)評價提供參考血清。本發(fā)明的技術(shù)方案1.羊布魯氏菌參考血清庫，其特征在于含有自然感染的羊(包括綿羊和山羊)布魯氏菌陽性血清30份以上；疫苗免疫的羊布魯氏菌陽性血清30份以上(包括綿羊和山羊)；布魯氏菌陰性血清30份以上；羊抗大腸桿菌O157血清、羊抗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9血清、羊抗柏林沙門氏菌血清、羊粗糙型布魯氏菌陽性血清各2份以上；本血清庫可為各類羊布病血清學(xué)診斷方法的評價提供參考物質(zhì)，其中：(1)血清庫中各份血清均精確分裝，并凍干保存。每份血清的凍干樣本數(shù)大于10，滿足不同時間使用的可重復(fù)性；(2)血清庫中的布魯氏菌陽性血清、布魯氏菌陰性血清是指用虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗以及補體結(jié)合試驗等方法共同確認(rèn)的血清；(3)大腸桿菌O157、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9、柏林沙門氏菌、粗糙型布魯氏菌陽性血清是易與布魯氏菌抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)，血清庫中的羊抗大腸桿菌O157血清、羊抗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9血清、羊抗柏林沙門氏菌血清、羊抗粗糙型布魯氏菌陽性血清是用相應(yīng)細(xì)菌培養(yǎng)物人工免疫綿羊制備而成，用以評價各種血清學(xué)診斷方法的特異性，屬于質(zhì)控陰性血清的一部分。2.權(quán)利要求1所述的羊布魯氏菌參考血清庫的應(yīng)用，其特征在于使用該血清庫中的參考血清能對各種羊布病血清學(xué)診斷方法的特異性和敏感性進行科學(xué)評價。本發(fā)明具體實施方式收集不同背景來源(自然感染、疫苗免疫、健康群體)的山羊和綿羊血清，經(jīng)過虎紅平板凝集試驗(RBPT)初步檢測，再經(jīng)試管凝集試驗(SAT)進行效價測定，以及補體結(jié)合試驗(CFT)確診，小量分裝凍干后，分別作為羊布魯氏菌陽性參考血清、羊布魯氏菌疫苗免疫陽性參考血清、羊布魯氏菌陰性參考血清。制備易干擾布病血清學(xué)診斷的其它革蘭氏陰性菌的高免血清，主要包括羊抗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9陽性血清、羊抗大腸桿菌O157陽性血清、羊抗柏林沙門氏菌陽性血清、羊抗粗糙型布魯氏菌陽性血清。上述血清小量分裝凍干后，作為羊布魯氏菌特異性陰性參考血清(質(zhì)控陰性血清)。將上述背景清楚、精確分裝凍干的血清作為羊布魯氏菌參考血清庫，用于對羊布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法進行特性和敏感性評價。本血清庫為各種羊布病血清學(xué)診斷方法評價提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。1.篩選臨床上布病陽性的羊作為陽性血清樣本來源。采用虎紅平板凝集試驗分別對山東地區(qū)有流產(chǎn)史的山羊場和內(nèi)蒙地區(qū)有流產(chǎn)史的綿羊場進行布病抗體檢測，對檢測到的陽性血清，分別用試管凝集試驗進行效價測定，同時用補體結(jié)合試驗進行確診。對確診為布病陽性的羊，采集更多血清，并試管凝集試驗重新測定效價。將各血清0.5ml/支分裝凍干。2.跟蹤監(jiān)測免疫羊群抗體水平，采集血清作為免疫陽性血清樣本來源。采用布病疫苗(S2株)對試驗綿羊和山羊進行口服免疫，25億CFU/頭份。免疫完成后采用虎紅平板凝集試驗每周監(jiān)測抗體水平，在抗體水平價高階段收集部分羊的血清，按照臨床陽性血清樣本制備方法進行效價測定和補體結(jié)合試驗確診。將各血清0.5ml/支分裝凍干。3.監(jiān)測健康羊群布病抗體水平，采集抗體陰性羊的血清作為陰性血清樣本來源。對未發(fā)生流產(chǎn)的羊場進行監(jiān)測，選擇虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗和補體結(jié)合試驗均檢測為陰性的羊，制備陰性參考血清。將各血清0.5ml/支分裝凍干。4.制備小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O、大腸桿菌O157、柏林沙門氏菌、粗糙型布魯氏菌等易與光滑型布魯氏菌抗血清產(chǎn)生干擾的革蘭氏陰性菌滅活抗原，免疫試驗綿羊，制備相應(yīng)的抗血清，作為特異性羊布魯氏菌陰性血清樣本來源。將各血清0.5ml/支分裝凍干。5.建立上述各種血清的背景檔案。本發(fā)明涉及生物材料資源信息小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia.enterocolitica)O9W22703株(徐云明等.區(qū)別檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌與布魯氏菌LAMP引物的設(shè)計與分析,中國實驗診斷學(xué)，2013年1月第17卷第1期，p19-22)來自吉林大學(xué)人獸共患病研究所；大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)O157(CVCC1489)、沙門氏菌都柏林血清型(Salmonellasp.serotypedublin)C79-86株(CVCC79351)和粗糙生物型布魯氏菌(BrucellamelitensisBiotyperoughness)M111株(CVCC19)均來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(請見中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國獸醫(yī)菌種目錄(第二版)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002年，p33、p75、p109)。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及一種羊布魯氏菌參考血清庫，本發(fā)明的意義在于：(1)在國際上率先建成了具有一定規(guī)模的羊布魯氏菌參考血清庫；(2)為布病診斷方法的科學(xué)評價提供了殘酷物質(zhì)；(3)為開發(fā)針對牛的各類布病診斷方法提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。實施例以下實施例為進一步說明本發(fā)明，不對本發(fā)明構(gòu)成限制。實施例1——臨床陽性參考血清的制備1.采集臨床山羊和綿羊血清各400余份，用虎紅平板凝集試驗進行初步測定。取待檢血清0.03ml與等量的布魯氏菌虎紅平板凝集試驗抗原(批號：200901)，作平板凝集，于4分鐘內(nèi)觀察反應(yīng)結(jié)果。結(jié)果虎紅試驗檢測到的陽性血清共144份，其中山羊63份，綿羊81份。2.對144份虎紅檢測為陽性的樣本進一步用試管凝集試驗測定布魯氏菌抗體效價，保留抗體效價在1﹕100以上的血清樣本，進一步進行補體結(jié)合試驗。具體操作如下：將試管凝集抗原(201501批)用0.5％苯酚生理鹽水(簡稱：石鹽水)作1:20稀釋；將待檢血清分別作1:25、1:50、1:100、1:200稀釋。具體方法是：第一個管先加入2.4mL石鹽水，以后每管都加入0.5mL石鹽水，向第一個試管加入0.1mL血清混勻后取0.5mL加到第二個試管中作1:1稀釋。以后各管類推。第一個試管應(yīng)棄去1.5ml稀釋血清；將20倍稀釋的布魯氏菌試管凝集試驗抗原0.5mL分別加入各個血清試管內(nèi)，搖勻，放37℃24h觀察結(jié)果。最后血清的稀釋度為1:50、1:100、1:200、1:400，同時按表1設(shè)立比濁管。試驗設(shè)陽性血清(201501批)、陰性血清(201501批)和抗原對照(見表1)。表1試管凝集試驗比濁管配制及透明程度表示管號稀釋菌液(mL)生理鹽水(mL)透明程度10.001.00++++20.250.75+++30.500.50++40.750.25+51.000.00-結(jié)果判定：在對照成立的前提下判定結(jié)果。待檢血清效價在1:100(++)以上者為陽性；1:50(++)為可疑，以下為陰性。結(jié)果144份陽性血清中，共監(jiān)測出119份試管凝集試驗效價高于1：100的血清樣本。其中山羊51份，綿羊68份。3.將虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗檢測均為陽性的113份血清，均用生理鹽水作1:10稀釋，于56℃滅能30min后，按表2進行補體結(jié)合試驗操作。最后一次水浴加溫20min后，按表3配制標(biāo)準(zhǔn)溶血管，并進行結(jié)果判定。結(jié)果119份陽性血清中，補體結(jié)合試驗共檢測112份陽性血清，其中山羊49份，綿羊63份。表2補體結(jié)合試驗各試劑加樣量及操作程序表3標(biāo)準(zhǔn)溶血管配制及判定標(biāo)準(zhǔn)實施例2——疫苗免疫血清的制備跟蹤監(jiān)測免疫羊群抗體水平，采集血清作為免疫陽性血清樣本來源。采用布病疫苗(S2株)對試驗綿羊和山羊進行口服免疫，25億CFU/頭份。免疫完成后采用虎紅平板凝集試驗每周監(jiān)測抗體水平，在抗體水平價高階段收集部分羊的血清，按照臨床陽性血清樣本制備方法進行效價測定和補體結(jié)合試驗確診。將各血清0.5ml/支分裝凍干。實施例3——144份血清采用三種不同檢測方法測定的結(jié)果。對144份(其中山羊63份，綿羊81份)經(jīng)虎紅初篩為陽性的血清，進一步進行試管凝集試驗和補體結(jié)合試驗檢測，篩選三種方法均檢測為陽性的血清作為各陽性血清樣本，進行凍干。三種不同方法對144份血清的檢測結(jié)果如下(表4)：表4臨床采集的羊布病陽性血清采用三種不同檢測方法測定的結(jié)果注：1.RBT：虎紅平板凝集試驗，取待檢血清0.03ml與等量的布魯氏菌虎紅平板凝集試驗抗原(批號：201501)，作平板凝集，于4分鐘內(nèi)觀察反應(yīng)結(jié)果。++++：出現(xiàn)大的凝集片或顆粒，液體完全透明；+++：有明顯的凝集顆粒，液體幾乎完全透明；++：有較明顯的凝集顆粒，液體稍透明；+：稍能見到凝集，液體混濁；—：無凝集，液體均勻混濁。2.SAT：試管凝集試驗，取待檢血清經(jīng)0.5％苯酚生理鹽水分別:25、1:50、1:100、1:200稀釋，與布魯氏菌試管凝集試驗抗原(批號：201501)，進行反應(yīng)，37℃作用22～24小時，判定結(jié)果。4+：菌體完全凝集和沉淀，液體100％清亮；3+：菌體幾乎完全凝集和沉淀，液體75％清亮；2+：有顯著的凝集和沉淀，液體50％清亮；1+：有清楚可見的凝集和沉淀，液體25％清亮；—：無凝集和沉淀，液體菌液混濁。3.CFT：補體結(jié)合試驗；P：陽性；N：陰性。4.布病陽性血清對照：2015-1批，裝量：1ml，有效期至2025年3月26日，來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所布病實驗室。5.布病陰性血清對照：2015-1批，裝量：1ml，有效期至2025年5月9日，來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所布病實驗室。6.“S”表示來自綿羊的血清樣本；“G”表示來自山羊的血清樣本；“/”表示未檢測。實施例4——易與布魯氏菌抗血清產(chǎn)生交叉的布魯氏菌陰性參考血清(質(zhì)控陰性血清)的制備和質(zhì)量檢驗1.大腸桿菌O157滅活抗原、都柏林沙門氏菌滅活抗原、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9和粗糙型布魯氏菌M111滅活抗原的制備(1)大腸桿菌O157滅活抗原的制備將復(fù)蘇的大腸桿菌O157單個菌落接種到裝有100ml普通肉湯(培養(yǎng)基)的三角燒瓶中，37℃搖振培養(yǎng)12-18h。10000r/min離心10min收集菌體。用10mlPBS重懸菌體，加入50μl福爾馬林溶液，使甲醛含量為0.2％，置37℃滅活24h，中途搖晃3-4次。(2)都柏林沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9采用的培養(yǎng)基，抗原滅活方法與大腸桿菌O157一致；粗糙型布魯氏菌M111采用的培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，抗原滅活方法與大腸桿菌O157一致。(3)抗原的滅活檢驗：100μl涂布LB固體培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)18h，觀察有無細(xì)菌生長，如果仍有細(xì)菌生長表示滅活不完全，需要繼續(xù)搖振滅活。若如細(xì)菌生長，表示滅活完全。2.免疫抗原制備(1)取少量大腸埃希氏菌CVCC1489株的O157滅活抗原用無菌生理鹽水稀釋至麥?zhǔn)媳葷峁芟嗤瑵岫龋瑓⒄整準(zhǔn)媳葷峁苷f明，此時細(xì)菌濃度約為8×108CFU/ml，根據(jù)稀釋比例，計算滅活菌液原始濃度。據(jù)此，將制備的原始抗原調(diào)整至1×1010CFU/ml，作為免疫用抗原，2～8℃保存?zhèn)溆谩?2)同上法將少量柏林沙門氏菌CVCC79351株滅活抗原稀釋至麥?zhǔn)媳葷峁芟嗤瑵岫?，參照麥?zhǔn)媳葷峁苷f明，此時細(xì)菌濃度約為1×109CFU/ml，根據(jù)稀釋比例，計算滅活菌液原始濃度。據(jù)此，將制備的原始抗原調(diào)整至4×1010CFU/ml，作為免疫用抗原，2～8℃保存?zhèn)溆谩?3)同上法將少量小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌W22703株O9滅活抗原稀釋至麥?zhǔn)媳葷峁芟嗤瑵岫?，參照麥?zhǔn)媳葷峁苷f明，此時細(xì)菌濃度約為8×108CFU/ml，根據(jù)稀釋比例，計算滅活菌液原始濃度。據(jù)此，將制備的原始抗原調(diào)整至4×1010CFU/ml，作為免疫用抗原，2～8℃保存?zhèn)溆谩?4)同上法將少量粗糙型布魯氏菌M111株的滅活抗原稀釋至麥?zhǔn)媳葷峁芟嗤瑵岫?，參照麥?zhǔn)媳葷峁苷f明，此時細(xì)菌濃度約為3×109CFU/ml，根據(jù)稀釋比例，計算滅活菌液原始濃度。據(jù)此，將制備的原始抗原調(diào)整至1×1010CFU/ml，作為免疫用抗原，2～8℃保存?zhèn)溆谩?.免疫免疫一般只需進行兩次。初免：用2ml滅活抗原(1×1010CFU/ml)頸部皮下免疫布病陰性羊。加強免疫：初免3個月后，雙倍劑量頸部皮下加強免疫1次。加強免疫后2周采血，用試管凝集試驗測定凝集效價應(yīng)不低于1:200。若效價達不到標(biāo)準(zhǔn)，繼續(xù)加強免疫1～2次，15日后再試血，直至效價合格。3.血清制備二免14日后采血測定試管凝集效價，若效價滿足要求，則頸靜脈采血，分離血清，用0.45μm濾器過濾除菌，加入proclin300至終濃度為0.05％，無菌分裝凍干。4.檢驗對制備完成的布魯氏菌特異性質(zhì)控陰性血清按如下項目進行檢驗：(1)性狀觀察各凍干制品色澤，加入1ml蒸餾水觀察其溶解性。(2)無菌檢驗按《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會，中華人民共和國獸藥典，二〇一〇年版三部，中國農(nóng)業(yè)出版社，2011，以下稱《中國獸藥典》)附錄進行檢驗。(3)特異性檢驗1)對布魯氏菌的特異性將各質(zhì)控陰性血清分別作為待檢血清，用布魯氏菌cELISA抗體檢測試劑盒進行檢測，計算PI，均應(yīng)低于30％。2)對相應(yīng)病原的特異性4份質(zhì)控陰性血清(SN1～SN4)各作1:100稀釋，分別相應(yīng)的滅活抗原(濃度為2×109CFU/ml)進行試管凝集試驗，應(yīng)判為陽性。實施例5.——布魯氏菌特異性陰性質(zhì)控血清質(zhì)量檢驗結(jié)果參照實施例4制備各布魯氏菌特異性陰性質(zhì)控血樣，其中SN1、SN2、SN3和SN4號分別表示免疫大腸桿菌O157滅活抗原、都柏林沙門氏菌滅活抗原、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9和粗糙型布魯氏菌滅活抗原制備的抗血清。陰性質(zhì)控血清，分裝凍干后。抽取血清樣本進行檢驗，結(jié)果如下：1.性狀均為淡黃色疏松團塊，加入1ml蒸餾水后能迅速溶解。2.無菌檢驗隨機各抽取5瓶陰性血清，用1ml無菌蒸餾水復(fù)溶后，全部轉(zhuǎn)移到50ml的硫乙醇酸鹽(T.G)小瓶中，混勻后至37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3日后，從T.G小瓶中吸取0.2ml培養(yǎng)物分別接種T.G小管和G.A斜面各2支，1支置25℃培養(yǎng)，另一支置37℃培養(yǎng)；另取0.2ml接種一支G.P小管，置25℃培養(yǎng)，以上試管均培養(yǎng)5日。記錄檢驗結(jié)果(見表5)。表5羊布病參考血清庫中特異性陰性質(zhì)控血清無菌檢驗結(jié)果“－”表示無菌生長；“+”表示有菌生長。3.特異性檢驗(1)對布魯氏菌特異性采用競爭ELISA方法進行。將各質(zhì)控陰性參考血清用布魯氏菌cELISA抗體檢測試劑盒進行檢測，根據(jù)OD450值計算PI，低于30％為布魯氏菌陰性血清。檢測結(jié)果見表6。表6布魯氏菌質(zhì)控陰性血清特異性檢驗結(jié)果(2)對相應(yīng)病原的特異性從質(zhì)控陰性血清SN1、SN2、SN3、SN4中各隨機抽取3瓶血清，分別用1m無菌蒸餾水復(fù)溶，將各復(fù)溶血清用相應(yīng)試管凝集試驗抗原，進行試管凝集試驗和結(jié)果判定，檢驗結(jié)果見表7。表7布魯氏菌特異性陰性質(zhì)控血清試管凝集效價檢驗結(jié)果結(jié)果說明：4+：菌體完全凝集和沉淀，液體100％清亮；3+：菌體幾乎完全凝集和沉淀，液體75％清亮；2+：有顯著的凝集和沉淀，液體50％清亮；1+：有清楚可見的凝集和沉淀，液體25％清亮；—：無凝集和沉淀，液體菌液混濁。2++:凝集強度介于3+與2+之間，但更接近2+；2+-:凝集強度介于2+與1+之間，但更接近2+。當(dāng)前第1頁1 2 3