本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種布魯氏菌融合蛋白。

背景技術(shù)：

布魯氏菌病(brucellosis)又稱地中海弛張熱，是由布魯氏菌引起的人畜共患性全身傳染病。能引起人和多種動(dòng)物的急性和慢急性疾病，被感染的人和動(dòng)物表現(xiàn)為流產(chǎn)及不孕不育等癥狀。布魯氏菌病在國(guó)內(nèi)，羊?yàn)橹饕獋魅驹?，牧民或獸醫(yī)接羔為主要傳播途徑。

體外診斷核心原料的開發(fā)是開發(fā)相應(yīng)診斷試劑的前提，只有開發(fā)出具有高活性、高性能的抗原抗體，體外診斷試劑產(chǎn)品才能成為現(xiàn)實(shí)。因此，針對(duì)布魯氏菌抗體和抗原開發(fā)出能夠用以生產(chǎn)診斷試劑的原料迫在眉睫，從某種程度上說，原料的開發(fā)也必將成為降低布魯氏菌病蔓延的首要解決問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種布魯氏菌融合蛋白，所述融合蛋白包括布魯氏菌抗原和布魯氏菌單鏈抗體。

進(jìn)一步地，本發(fā)明所述布魯氏菌抗原為含有主要抗原決定簇的bp26抗原，所述布魯氏菌單鏈抗體為scfv。

本發(fā)明還提供了一種布魯氏菌融合蛋白的制備方法，其制備步驟如下：

(1)查找布魯氏菌中含有主要抗原決定簇的bp26抗原

從ncbi(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)中查找到布魯氏菌含有主要抗原決定簇的bp26抗原。

(2)優(yōu)化布魯氏菌bp26抗原基因的密碼子，合成核酸序列并進(jìn)行表達(dá)

在大腸桿菌中表達(dá)蛋白時(shí)，不同密碼子使用的頻率有較大區(qū)別，為了使融合蛋白的表達(dá)量達(dá)到最大，需將布魯氏菌bp26抗原基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，然后合成優(yōu)化后的核酸序列并進(jìn)行表達(dá)。

(3)構(gòu)建針對(duì)布魯氏菌bp26抗原的單鏈抗體，調(diào)取單鏈抗體scfv的基因

將純化之后的bp26抗原蛋白免疫小鼠獲得高活性的單克隆抗體，再調(diào)取單鏈抗體scfv的基因。

(4)重組優(yōu)化的布魯氏菌bp26抗原基因和針對(duì)布魯氏菌bp26抗原的單鏈抗體scfv基因，并進(jìn)行表達(dá)

將優(yōu)化后的布魯氏菌bp26抗原基因(11-250aa)和針對(duì)布魯氏菌bp26抗原的單鏈抗體scfv基因(能夠針對(duì)結(jié)合bp26抗原蛋白的3-10aa部分)通過遞歸pcr技術(shù)連接起來，測(cè)序分析序列正確后，把融合蛋白的基因片段插入到表達(dá)載體上進(jìn)行表達(dá)。

(5)純化及復(fù)性布魯氏菌融合蛋白。

本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，它具有周期短，費(fèi)用低，表達(dá)量大等特點(diǎn)。

為了使得融合蛋白更好地保持活性位點(diǎn)，本發(fā)明選擇比較溫和的培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件，其表達(dá)時(shí)的誘導(dǎo)溫度為20℃、25℃、28℃、37℃，進(jìn)一步優(yōu)選的誘導(dǎo)溫度為25℃、37℃，更進(jìn)一步優(yōu)選的誘導(dǎo)溫度為25℃。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為250rpm，誘導(dǎo)的iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)濃度為0.1mm。這樣使得融合蛋白有了更加緩慢的表達(dá)，有充分的時(shí)間進(jìn)行空間構(gòu)象的形成。

本發(fā)明可以采用超聲的方式破碎細(xì)菌。在破碎菌體的時(shí)候，為了避免劇烈條件，將破碎條件定為200w，每次超聲6s，間隔3s超聲一次，共180次。

本發(fā)明融合蛋白的純化方式有離子交換層析，凝膠過濾層析和親和層析等方法，進(jìn)一步優(yōu)選為親和層析。

本發(fā)明在融合蛋白中加入了6xhis標(biāo)簽，使親和層析純化方式能夠達(dá)到較高的純度。

本發(fā)明的融合蛋白利用基因工程重組技術(shù)，在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)布魯氏菌抗原和單鏈抗體的融合蛋白方法，具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的布魯氏菌融合蛋白可做為布魯氏菌免疫診斷試劑盒的一部分。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

(1)首次開發(fā)針對(duì)布魯氏菌主要抗原bp26的單鏈抗體scfv。

本發(fā)明在開發(fā)單克隆抗體的基礎(chǔ)上又進(jìn)行重組抗體技術(shù)開發(fā)單鏈抗體，單鏈抗體具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)具有完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)，不含抗體恒定區(qū)；2)分子量小，減少了抗體的非特異性結(jié)合，降低了診斷產(chǎn)品的假陽性風(fēng)險(xiǎn)；3)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于基因工程改造；4)易于在細(xì)胞中表達(dá)，可以在真核或者原核細(xì)胞中表達(dá)，可大量生產(chǎn)，成本較低。

(2)國(guó)內(nèi)外首次開發(fā)布魯氏菌主要抗原表位及針對(duì)bp26抗原的scfv融合蛋白。

由于感染布魯氏菌初期不產(chǎn)生抗體，致使在此段時(shí)間我們檢測(cè)不到相應(yīng)的布魯氏菌抗體，從而導(dǎo)致漏檢，為了解決此問題必須在檢測(cè)布魯氏菌抗體的同時(shí)增加對(duì)抗原的檢測(cè)，開發(fā)針對(duì)布魯氏菌bp26抗原的抗體成為關(guān)鍵。

(3)制備了同時(shí)結(jié)合布魯氏菌抗體和抗原的高活性、高靈敏度和高特異性的融合蛋白。

在主要抗原表位和針對(duì)布魯氏菌bp26抗原的抗體開發(fā)出后，利用基因工程技術(shù)將篩選出的高效抗原表位(布魯氏菌bp26抗原的11-250aa)和針對(duì)布魯氏菌bp26抗原的單鏈抗體scfv(3-10aa)融合，制備成具有同時(shí)結(jié)合布魯氏菌抗體和抗原的高活性、高靈敏度和高特異性的融合蛋白，該融合蛋白具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)在快診試劑條中只需要使用一種原料即可，這樣可以避免多種原料間的交叉反應(yīng)；2)在原料的生產(chǎn)上，只需要穩(wěn)定一種原料的生產(chǎn)工藝即可，這樣可以減少生產(chǎn)成本的投入，縮短原料生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)批間差；3)節(jié)省了開發(fā)布魯氏菌診斷試劑的成本。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但并不將本發(fā)明局限于這些具體實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明涵蓋了權(quán)利要求書范圍內(nèi)所可能包括的所有備選方案、改進(jìn)方案和等效方案。

實(shí)施例1布魯氏菌bp26抗原基因的密碼子優(yōu)化及表達(dá)載體構(gòu)建

從ncbi查找bp26抗原基因genbank：aab38523.1，蛋白質(zhì)序列如下：

mntrasnflaasfstimlvgafslpafaqenqmttqpariavtgegmmtaspdmailnlsvlrqaktareamtanneamtkvldamkkagiedrdlqtgginiqpiyvypddknnlkeptitgysvstsltvrvrelanvgkildesvtlgvnqggdlnlvndnpsavinearkravanaiakaktladaagvglgrvveiselsrppmpmpiargqfrtmlaaapdnsvpiaagensynvsvnvvfeik

經(jīng)過密碼子優(yōu)化后序列如下：

atgaatacccgtgccagcaactttctggccgccagcttcagcaccatcatgctggtgggtgcctttagtctgccggcctttgcccaggagaatcagatgaccacccagcctgcacgcattgccgtgacaggtgaaggtatgatgaccgccagtccggatatggccattctgaacctgagcgtgctgcgccaagcaaaaaccgcccgcgaggccatgaccgccaacaacgaagccatgaccaaagtgctggacgccatgaaaaaagccggcatcgaagaccgtgatctgcagaccggcggcattaacatccagccgatctatgtgtatccggatgacaaaaataacctgaaggaaccgaccattaccggctatagcgtgagcaccagcctgaccgttcgcgtgcgcgaactggccaacgttggcaagattctggatgagagcgttaccctgggtgtgaaccaaggcggcgacctgaatctggtgaatgataacccgagcgccgtgattaacgaagcccgcaaacgcgcagtggccaatgccattgccaaggccaaaaccctggccgatgccgcaggtgtgggtttaggccgcgtggtggaaattagcgaactgagtcgcccgccgatgccgatgcctattgcccgtggtcagtttcgcaccatgctggcagcagcacctgataatagcgtgcctatcgcagccggcgaaaacagctacaatgttagcgtgaatgtggtttttgaaattaaa

設(shè)計(jì)引物如下：

p1u：gcatatgaatacccgtgccagcaactttctggccgccagcttcagcaccatcatgctggtggg

p1d：tggtcatctgattctcctgggcaaaggccggcagactaaaggcacccaccagcatgatg

p2u：agaatcagatgaccacccagcctgcacgcattgccgtgacaggtgaaggtatgatgac

p2d：ggcgcagcacgctcaggttcagaatggccatatccggactggcggtcatcataccttca

p3u：tgagcgtgctgcgccaagcaaaaaccgcccgcgaggccatgaccgccaacaacgaagcc

p3d：tcttcgatgccggcttttttcatggcgtccagcactttggtcatggcttcgttgttggc

p4u：agccggcatcgaagaccgtgatctgcagaccggcggcattaacatccagccgatctatg

p4d：ggtaatggtcggttccttcaggttatttttgtcatccggatacacatagatcggctgga

p5u：gaaccgaccattaccggctatagcgtgagcaccagcctgaccgttcgcgtgcgcgaact

p5d：cacccagggtaacgctctcatccagaatcttgccaacgttggccagttcgcgcacgcga

p6u：gcgttaccctgggtgtgaaccaaggcggcgacctgaatctggtgaatgataacccgagc

p6d：atggcattggccactgcgcgtttgcgggcttcgttaatcacggcgctcgggttatcatt

p7u：agtggccaatgccattgccaaggccaaaaccctggccgatgccgcaggtgtgggtttag

p7d：ggcatcggcgggcgactcagttcgctaatttccaccacgcggcctaaacccacacctg

p8u：tcgcccgccgatgccgatgcctattgcccgtggtcagtttcgcaccatgctggcagca

p8d：tagctgttttcgccggctgcgataggcacgctattatcaggtgctgctgccagcatggt

p9d：gctcgagtttaatttcaaaaaccacattcacgctaacattgtagctgttttcgccggctg

實(shí)驗(yàn)方法如下：

將引物p1u,p1d,p2u,p2d,p3u,p3d混合，進(jìn)行pcr反應(yīng)，所得產(chǎn)物命名為w1；將引物p4u,p4d,p5u,p5d,p6u,p6d混合，進(jìn)行pcr反應(yīng)，所得產(chǎn)物命名為w2；將引物p7u,p7d,p8u,p8d,p9d混合，進(jìn)行pcr反應(yīng)，所得產(chǎn)物命名為w3；然后將上述三個(gè)產(chǎn)物w1,w2,w3混合做為模板，用引物p1u,p9d進(jìn)行pcr反應(yīng)即得到優(yōu)化后布魯氏菌的bp26基因。上述四個(gè)pcr(toyobo公司產(chǎn)品，貨號(hào)：02510d1)反應(yīng)條件如下：94℃，2分鐘x1個(gè)循環(huán)；(98℃，15秒，55℃，30秒，68℃，15秒)x30個(gè)循環(huán)；72℃，7分鐘x1個(gè)循環(huán)。測(cè)序證明序列正確后，將此pcr產(chǎn)物用ndei和xhoi限制性內(nèi)切酶(購(gòu)自neb公司)進(jìn)行雙酶切之后，插入到用相同兩個(gè)酶切處理的pet30a(novagen產(chǎn)品,貨號(hào)69909-3)載體中。

實(shí)施例2構(gòu)建針對(duì)布魯氏菌核心蛋白布魯氏菌bp26抗原的單鏈抗體

(1)單克隆抗體(只針對(duì)結(jié)合bp26抗原蛋白3-10aa的抗體)細(xì)胞株的獲得

a.將構(gòu)建成功的pet30a-bp26載體轉(zhuǎn)化至bl21表達(dá)菌種表達(dá)純化后獲得bp26抗原蛋白

b.用獲得的bp26抗原蛋白免疫小鼠

c.用單克隆抗體技術(shù)篩選到只針對(duì)結(jié)合bp26抗原蛋白3-10aa的抗體細(xì)胞株

(2)細(xì)胞rna的提取

用trizolls(invitrogen產(chǎn)品,貨號(hào)10296-010)試劑，按照說明書操作步驟提取細(xì)胞總rna。

cdna第一鏈的合成

取1μgrna做逆轉(zhuǎn)錄模板，oligo(d)t1μl做逆轉(zhuǎn)錄引物，加depc水至總體積12μl，混勻。70℃變性5min，迅速冰浴冷卻。依次加入5×緩沖液4μl，rnase抑制劑1μl，dntp(10mmeach)2μl，混勻。37℃孵育5min，加入amv逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，37℃反轉(zhuǎn)錄60min，70℃、10min終止反應(yīng)，冰上冷卻。

(3)以逆轉(zhuǎn)錄cdna為模板，按照以下引物，用rt-pcr擴(kuò)增重鏈輕鏈基因。

mhvu1:gatgtgaagcttcaggagtc

mhvu2:caggtgcagctgaaggagtc

mhvu3:caggtgcagctgaagcagtc

mhvu4:caggttactctgaaagagtc

mhvu5:aaggtccagctgcaacaatc

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mhvd2:tgaggagactgtgagagtggt

mhvd3:tgaggagacggtgactgaggt

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mkvd1:ccgtttcagctccagcttg

mkvd2:ccgttttatttccagcttggt

mkvd3:ccgttttatttccaactttg

用引物mhvu1—mhvu10分別與mhvd1—mhvd4組合；mkvu1—mkvu9分別與mkvd1—mkvd4組合做pcr反應(yīng)。

pcr反應(yīng)體系25μl，其中cdna0.5μl，上游引物0.25μl下游引物0.25μl，taq酶0.2μldntp2μl10×buffer2.5μl。

pcr(toyobo公司產(chǎn)品，貨號(hào)：02510d1)，pcr條件為：94℃，2分鐘x1個(gè)循環(huán)；(98℃，5秒，55℃，30秒，68℃，15秒)x30個(gè)循環(huán)；72℃，7分鐘x1個(gè)循環(huán)。

經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后確定重鏈和輕鏈基因，然后通過遞歸pcr將重鏈和輕鏈基因連接起來，此重組基因?yàn)閞scfv。

實(shí)施例3含有布魯氏菌bp26抗原基因(11-250aa)和針對(duì)布魯氏菌bp26抗原的單鏈抗體基因(3-10aa)融合，并進(jìn)行表達(dá)

(1)通過遞歸pcr將有布魯氏菌bp26抗原基因(11-250aa)和針對(duì)布魯氏菌bp26抗原的單鏈抗體基因(3-10aa)連接在一起，用ndei和xhoi限制性內(nèi)切酶(購(gòu)自neb公司)進(jìn)行雙酶切之后，插入到用相同兩個(gè)酶切處理的pet30a(novagen產(chǎn)品，貨號(hào)69909-3)載體中。

(2)將上述融合蛋白基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21中，涂布于含100ug/ml硫酸卡那霉素(上海生工生物工程服務(wù)有限公司，貨號(hào)：kb0286)的lb平板上，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，用含有相同濃度的硫酸卡那霉素的300mllb培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)至od600達(dá)0.6左右，用濃度為0.1mm的iptg(生工，貨號(hào)：ib0168)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)條件為：37℃，轉(zhuǎn)速250rpm，5h。誘導(dǎo)之后，將培養(yǎng)液4℃5000rpm離心20min收集菌體。

實(shí)施例4含有布魯氏菌融合蛋白的純化及復(fù)性

將菌體用50ml包涵體抽提液(20mmtris-hcl，0.5mureaph7.5，0.5mnacl,2％tritonx-100)重懸，然后超聲破碎，條件為每次超聲3s，間隔6s，共180次，12000rpm，4℃離心收集包涵體沉淀。用上樣緩沖液bindingbuffer(50mmtris，8murea，0.5mnacl，20mm咪唑ph8.0)50ml破碎包涵體，上柱純化，用洗脫緩沖液elutionbuffer(50mmtris，8murea，0.5mnacl，300mm咪唑ph8.0)洗脫目的蛋白。將純化后的融合蛋白用透析緩沖液(1mm氧化型谷胱甘肽gssh，2mm還原型谷胱甘肽gsh，2mmedta，20mmtris,ph8.5)透析,每隔48h換一次透析液。取出透析后的蛋白液，經(jīng)據(jù)乙醇-20000進(jìn)行濃縮，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>