本發(fā)明屬于布魯氏菌新型分子標(biāo)記疫苗研究
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種布魯氏菌分子標(biāo)記缺失菌株及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：布魯氏菌病(Brucellosis，簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌(Brucella)引起的人畜共患傳染病。布魯氏菌屬有7個(gè)種，感染人的主要有牛、羊、豬、犬及海洋動(dòng)物5個(gè)種。布魯氏菌是革蘭氏陰性菌，主要引起人的波狀熱和慢性感染以及反芻動(dòng)物的不育和流產(chǎn)。我國(guó)目前對(duì)布魯氏菌病防控的有效措施是通過血清學(xué)檢測(cè)，篩選陰性動(dòng)物進(jìn)行疫苗免疫。然而現(xiàn)有的疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體與自然感染的動(dòng)物抗體無法區(qū)分，也就是說通過血清學(xué)檢測(cè)方法無法有效區(qū)分自然感染和疫苗免疫的動(dòng)物，嚴(yán)重妨礙了動(dòng)物布魯氏菌病的凈化，造成了目前人畜布魯氏菌病感染率逐年上升的嚴(yán)重后果。目前許多學(xué)者都在研究分子標(biāo)記疫苗，即通過基因缺失技術(shù)，將布魯氏菌已知的關(guān)鍵毒力基因進(jìn)行缺失，獲得新的具有標(biāo)記的弱毒疫苗株，用該弱毒疫苗株進(jìn)行免疫方可通過缺失基因的標(biāo)記性抗體進(jìn)行鑒別診斷達(dá)到防控布魯氏菌病的目的。然而學(xué)者們對(duì)于布魯氏菌分子標(biāo)記疫苗株的研究還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，多個(gè)分子標(biāo)記的布魯氏菌毒株都是在弱毒疫苗株的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造獲得的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種通過缺失布魯氏菌強(qiáng)毒株16M與毒力相關(guān)的UGPase基因獲得新的布魯氏菌分子標(biāo)記缺失菌株(B.melitensis△UGPase)及其構(gòu)建方法。本發(fā)明為解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：本發(fā)明的布魯氏菌分子標(biāo)記缺失菌株(B.melitensis△UGPase)，該布魯氏菌分子標(biāo)記缺失菌株于2016年5月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為CGMCCNo.11908，分類命名為羊布魯氏菌Brucellamelitensis。本發(fā)明的布魯氏菌分子標(biāo)記缺失菌株(B.melitensis△UGPase)，該菌株缺失了布魯氏菌強(qiáng)毒株16M與毒力相關(guān)的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase，缺失掉的UGPase基因的核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:4所示。本發(fā)明還提供了上述布魯氏菌分子標(biāo)記缺失菌株(B.melitensis△UGPase)的構(gòu)建方法，PCR擴(kuò)增布魯氏菌強(qiáng)毒株16M的UGPase基因上、下游同源臂序列，對(duì)獲得的兩個(gè)基因片段進(jìn)行融合，得到缺失突變盒UGPase-NC，雙酶切缺失突變盒UGPase-NC后與自殺載體質(zhì)粒pBKCMV-SacB連接，得到缺失突變載體pBKCMVSacB-UGPase-NC，根據(jù)同源重組的原理，將其電轉(zhuǎn)化入布魯氏菌強(qiáng)毒株16M感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，通過正、負(fù)向篩選同源重組雙交換子，篩選出布魯氏菌分子標(biāo)記缺失菌株B.melitensis△UGPase，用菌落PCR及DNA測(cè)序的方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，布魯氏菌UGPase基因缺失株改造成功。作為優(yōu)選的實(shí)施方式，PCR擴(kuò)增布魯氏菌強(qiáng)毒株16M的UGPase基因上、下游同源臂序列獲得兩個(gè)基因片段，其核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。作為優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的布魯氏菌分子標(biāo)記缺失菌株(B.melitensis△UGPase)的構(gòu)建方法具體包括以下步驟：步驟一、根據(jù)布魯氏菌強(qiáng)毒株16M的UGPase基因上下游片段、蔗糖篩選基因sacB基因片段、UGPase基因片段及pBK-CMV載體所含酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物：UGPaseF1：5'-GGATCCCTGGAGCCACTGCCCCCATTTG-3'UGPaseR1：5'-CTCGAGTCCTCTCCTCGATTTTCATTCA-3'UGPaseF2：5'-CTCGAGTAATCGGGCTATCCAATATCGC-3'UGPaseR2：5'-TCTAGACCACAGTGAATGCGGAAACCAG-3'sacBF：5'-GTCGACACTCAGTACATAATAAAGGAGACAT-3'sacBR：5'-GGATCCTGGGATTCACCTTTATGTTGATAAG-3'UGPase1：5'-ATGAGTTCTATTCGGAAAATCCGC-3'UGPase2：5'-TCAGGCTGGCTGGATCGTCT-3'；步驟二、以布魯氏菌強(qiáng)毒株16M的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增UGPase基因的上、下游同源臂序列，獲得兩個(gè)長(zhǎng)度分別為920bp和770bp的基因片段，其核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；步驟三、通過融合PCR將上述兩個(gè)基因片段融合在一起，得到缺失突變盒UGPase-NC，用BamHI和XhoI雙酶切缺失突變盒UGPase-NC后與含有蔗糖篩選基因sacB的自殺載體質(zhì)粒pBKCMV-SacB連接，得到缺失突變載體pBKCMVSacB-UGPase-NC；步驟四、將缺失突變載體pBKCMVSacB-UGPase-NC電轉(zhuǎn)化入布魯氏菌強(qiáng)毒株16M感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行篩選培養(yǎng)；步驟五、通過正、負(fù)向篩選同源重組雙交換子，篩選出布魯氏菌分子標(biāo)記缺失菌株B.melitensis△UGPase。作為優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的布魯氏菌分子標(biāo)記缺失菌株(B.melitensis△UGPase)的構(gòu)建方法還包括以下步驟：根據(jù)布魯氏菌UGPase基因上下游同源臂的引物序列即引物UGPaseF1、引物UGPaseR1、引物UGPaseF2和引物UGPaseR2，利用PCR方法對(duì)布魯氏菌UGPase基因缺失株進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示：布魯氏菌UGPase基因缺失株得到的片段長(zhǎng)度為1690bp，其核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:3所示，而野生型布魯氏菌強(qiáng)毒株16M的基因片段長(zhǎng)度為2584bp，說明UGPase基因已經(jīng)缺失掉，布魯氏菌UGPase基因缺失株構(gòu)建成功。作為優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的布魯氏菌分子標(biāo)記缺失菌株B.melitensis△UGPase的構(gòu)建方法還包括以下步驟：采用布魯氏菌UGPase基因上下游引物即引物UGPase1和引物UGPase2對(duì)布魯氏菌UGPase基因缺失株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示：布魯氏菌UGPase基因缺失株的基因片段無特異性條帶，而野生型布魯氏菌強(qiáng)毒株16M的基因片段在894bp處有特異性條帶，測(cè)序結(jié)果顯示該特異性條帶與布魯氏菌UGPase基因序列100％同源。作為優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的布魯氏菌分子標(biāo)記缺失菌株(B.melitensis△UGPase)的構(gòu)建方法中，步驟四所述的電轉(zhuǎn)化的具體過程為：首先將100ng的缺失突變載體pBKCMVSacB-UGPase-NC的DNA與30ul布魯氏菌強(qiáng)毒株16M感受態(tài)細(xì)胞充分混勻，預(yù)冷15min，然后于1500V、6ms電擊條件下進(jìn)行電擊，電擊后加入1mlSOC培養(yǎng)基重懸細(xì)菌，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，37℃復(fù)蘇24h，復(fù)蘇的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有50ug/ml卡那霉素的TSA平板。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明利用基因缺失技術(shù)，通過缺失布魯氏菌強(qiáng)毒株16M與毒力相關(guān)的基因—尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGPase)，成功構(gòu)建出了一種布魯氏菌UGPase基因缺失株。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，本發(fā)明的布魯氏菌分子標(biāo)記缺失菌株B.melitensis△UGPase在細(xì)胞水平和小鼠體內(nèi)都明顯出現(xiàn)毒力減弱的現(xiàn)象，可作為新型布魯氏菌病疫苗候選菌株用于控制布魯氏菌病的流行和傳播，為布魯氏菌的基因功能研究以及新型布魯氏菌疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明的布魯氏菌UGPase基因缺失株具有良好的安全性和免疫原性，制備出的疫苗免疫后的動(dòng)物能夠與自然感染的動(dòng)物區(qū)分開，打破布魯氏菌病新型疫苗研制的瓶頸，為布魯氏菌病防治提供新的依據(jù)，對(duì)動(dòng)物布魯氏菌病的防控具有重要意義。本發(fā)明彌補(bǔ)了現(xiàn)有布魯氏菌病疫苗的缺陷，可作為一種新型布魯氏菌分子標(biāo)記疫苗候選菌株，也是目前防控動(dòng)物布魯氏菌病急需的產(chǎn)品。附圖說明圖1為布魯氏菌UGPase基因的上、下游同源臂的基因擴(kuò)增結(jié)果。圖中：F1和F2均為上游同源臂PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，R1和R2均為下游同源臂PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2為布魯氏菌UGPase基因的上游同源臂酶切結(jié)果。圖中：1、3、5、7均為上游同源臂質(zhì)粒，2、4、6、8均為上游同源臂酶切片段。圖3為布魯氏菌UGPase基因的下游同源臂酶切結(jié)果。圖中：1、3、5均為下游同源臂質(zhì)粒，2、4、6均為下游同源臂酶切片段。圖4為單交換子驗(yàn)證電泳結(jié)果。圖中：1為野生型布魯氏菌強(qiáng)毒株16M(2584bp)，2、3均為布魯氏菌UGPase基因缺失株(1690bp)。圖5為布魯氏菌UGPase基因缺失株的PCR鑒定結(jié)果。圖中：1為野生型布魯氏菌強(qiáng)毒株16M(2584bp)，2為布魯氏菌UGPase基因缺失株(1690bp)，3-8均為布魯氏菌UGPase基因缺失株。圖6為布魯氏菌野生株、缺失株和疫苗株感染細(xì)胞后的計(jì)數(shù)結(jié)果。圖7為布魯氏菌野生株、缺失株、疫苗株感染小鼠后的脾臟菌落數(shù)。具體實(shí)施方式目前學(xué)者們對(duì)于布魯氏菌分子標(biāo)記疫苗株的研究還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，多個(gè)分子標(biāo)記的布魯氏菌毒株都是在弱毒疫苗株的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造獲得的，而本發(fā)明的布魯氏菌分子標(biāo)記缺失菌株B.melitensis△UGPase是通過對(duì)布魯氏菌強(qiáng)毒株16M進(jìn)行改造獲得的，并缺失了與毒力相關(guān)的UGPase基因，這項(xiàng)研究在國(guó)際國(guó)內(nèi)均尚屬首例。下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)施例1布魯氏菌UGPase基因缺失株(B.melitensis△UGPase)的構(gòu)建1、引物設(shè)計(jì)根據(jù)布魯氏菌強(qiáng)毒株16M(B.melitensis16M)的UGPase基因上下游片段、蔗糖篩選基因sacB基因片段、UGPase基因片段和pBK-CMV載體所含酶切位點(diǎn)，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增布魯氏菌UGPase基因的上、下游同源臂序列。所設(shè)計(jì)的引物如表1所示。表1引物名稱引物序列(5'-3')UGPaseF1GGATCCCTGGAGCCACTGCCCCCATTTGUGPaseR1CTCGAGTCCTCTCCTCGATTTTCATTCAUGPaseF2CTCGAGTAATCGGGCTATCCAATATCGCUGPaseR2TCTAGACCACAGTGAATGCGGAAACCAGsacBFGTCGACACTCAGTACATAATAAAGGAGACATsacBRGGATCCTGGGATTCACCTTTATGTTGATAAGUGPase1ATGAGTTCTATTCGGAAAATCCGCUGPase2TCAGGCTGGCTGGATCGTCT表1中，UGPaseF1表示布魯氏菌UGPase基因上游同源臂的上游引物，UGPaseR1表示布魯氏菌UGPase基因上游同源臂的下游引物；UGPaseF2表示布魯氏菌UGPase基因下游同源臂的上游引物，UGPaseR2表示布魯氏菌UGPase基因下游同源臂的下游引物；sacB是蔗糖篩選基因，sacBF表示蔗糖篩選基因上游引物，sacBR表示蔗糖篩選基因下游引物；UGPase1表示布魯氏菌UGPase基因上游引物，UGPase2表示布魯氏菌UGPase基因下游引物。2、PCR擴(kuò)增布魯氏菌UGPase基因的上、下游同源臂序列以布魯氏菌強(qiáng)毒株16M的基因組DNA為模板，對(duì)UGPase基因的上、下游同源臂進(jìn)行擴(kuò)增與克隆，獲得兩個(gè)基因片段，長(zhǎng)度分別為920bp(其核苷酸序列見序列表中的序列1)和770bp(其核苷酸序列見序列表中的序列2)，如圖1所示。3、缺失突變載體pBKCMVSacB-UGPase-NC的構(gòu)建通過融合PCR將上述獲得的兩個(gè)基因片段融合在一起，得到缺失突變盒UGPase-NC，用BamHI和XhoI雙酶切缺失突變盒UGPase-NC，酶切結(jié)果如圖2和圖3所示，然后與構(gòu)建好的含有蔗糖篩選基因sacB的自殺載體質(zhì)粒pBKCMV-SacB連接，得到缺失突變載體pBKCMVSacB-UGPase-NC。4、電轉(zhuǎn)化(1)制備電擊用布魯氏菌強(qiáng)毒株16M感受態(tài)細(xì)胞。(2)將制備的缺失突變載體pBKCMVSacB-UGPase-NC電轉(zhuǎn)化入布魯氏菌強(qiáng)毒株16M感受態(tài)細(xì)胞中：首先將100ng的缺失突變載體pBKCMVSacB-UGPase-NC的DNA與30ul布魯氏菌強(qiáng)毒株16M感受態(tài)細(xì)胞充分混勻，預(yù)冷15min，然后于1500V、6ms電擊條件下進(jìn)行電擊，電擊后立即加入1mlSOC培養(yǎng)基重懸細(xì)菌，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，37℃復(fù)蘇24h，復(fù)蘇的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有50ug/ml卡那霉素的TSA平板。5、布魯氏菌UGPase基因缺失株的篩選與鑒定將構(gòu)建的缺失突變載體pBKCMVSacB-UGPase-NC電轉(zhuǎn)化入布魯氏菌強(qiáng)毒株16M感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行篩選培養(yǎng)，通過正向篩選(卡那霉素篩選)和負(fù)向篩選(sacB基因-蔗糖篩選)，最終篩選出布魯氏菌UGPase基因缺失株(B.melitensis△UGPase)。根據(jù)布魯氏菌UGPase基因上下游同源臂的引物序列(引物UGPaseF1、引物UGPaseR1、引物UGPaseF2、引物UGPaseR2)，利用PCR方法對(duì)布魯氏菌UGPase基因缺失株進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖4所示：布魯氏菌UGPase基因缺失株得到的片段長(zhǎng)度為1690bp(其核苷酸序列見序列表中的序列3)，而野生型布魯氏菌強(qiáng)毒株16M的基因片段長(zhǎng)度為2584bp，說明UGPase基因已經(jīng)缺失掉，布魯氏菌UGPase基因缺失株(B.melitensis△UGPase)構(gòu)建成功，缺失掉的UGPase基因的核苷酸序列如序列表中的序列4所示。構(gòu)建成功的布魯氏菌分子標(biāo)記缺失菌株B.melitensis△UGPase于2016年5月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為CGMCCNo.11908。采用布魯氏菌UGPase基因上下游引物(引物UGPase1、引物UGPase2)對(duì)布魯氏菌UGPase基因缺失株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖5所示：布魯氏菌UGPase基因缺失株的基因片段無特異性條帶，而野生型布魯氏菌強(qiáng)毒株16M的基因片段在894bp處有特異性條帶，測(cè)序結(jié)果顯示該特異性條帶與布魯氏菌UGPase基因序列100％同源。實(shí)施例2布魯氏菌UGPase基因缺失株(B.melitensis△UGPase)胞內(nèi)生存相關(guān)表型的分析1、細(xì)胞粘附侵襲實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，將野生型布魯氏菌強(qiáng)毒株16M(B.melitensis16M)、布魯氏菌UGPase基因缺失株(B.melitensis△UGPase)和布魯氏菌疫苗株M5(B.melitensisM5)以200:l的MOI(multiplicityofinfection)侵染細(xì)胞，然后在5％CO2、37℃環(huán)境中共孵育5min、10min、15min、30min、45min、60min后，PBS漂洗3遍，洗去培養(yǎng)液中未粘附的細(xì)菌，然后在含有100mg/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)基中再孵育60min殺死胞外菌，PBS漂洗3遍，用0.1％(V/V)的Tritonx-100裂解細(xì)胞，釋放出胞內(nèi)菌，將裂解液倍比稀釋(具體的稀釋倍數(shù)是：101、102、103、104、105、106)后涂于TSA平板，計(jì)算CFU，比較野生型布魯氏菌強(qiáng)毒株16M與布魯氏菌UGPase基因缺失株粘附和入侵小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的能力。結(jié)果如圖6所示：培養(yǎng)30min后，野生型布魯氏菌強(qiáng)毒株16M與布魯氏菌UGPase基因缺失株對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的粘附和入侵能力幾乎接近，培養(yǎng)45min后，細(xì)菌入侵細(xì)胞達(dá)到飽和。2、小鼠攻毒試驗(yàn)以腹腔注射的方式給小鼠注射野生型布魯氏菌強(qiáng)毒株16M、布魯氏菌UGPase基因缺失株和布魯氏菌疫苗株M5，然后對(duì)脾臟中感染野生型布魯氏菌強(qiáng)毒株16M、布魯氏菌UGPase基因缺失株和布魯氏菌疫苗株M5的數(shù)量進(jìn)行比較分析。結(jié)果如圖7所示：感染21天后，野生型布魯氏菌強(qiáng)毒株16M感染小鼠脾臟的菌落數(shù)明顯高于布魯氏菌UGPase基因缺失株和布魯氏菌疫苗株M5。本發(fā)明通過對(duì)布魯氏菌強(qiáng)毒株16M進(jìn)行改造，并缺失了與毒力相關(guān)的UGPase基因構(gòu)建出一種布魯氏菌UGPase基因缺失株，通過細(xì)胞粘附侵襲實(shí)驗(yàn)和小鼠攻毒試驗(yàn)驗(yàn)證了本發(fā)明的布魯氏菌分子標(biāo)記缺失菌株B.melitensis△UGPase毒力減弱，為布魯氏菌的基因功能研究以及新型布魯氏菌疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3