本發(fā)明涉及一種用于直腸癌檢測(cè)的試劑盒。
背景技術(shù)：
：結(jié)直腸癌是世界上僅次于肺癌和乳腺癌的第三大常見腫瘤。在發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)處于較高水平.20世紀(jì)70年代以來(lái)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國(guó)居民生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)的改變以及人口老齡化的進(jìn)程加快，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率呈逐步上升趨勢(shì)，成為危害我國(guó)居民健康的主要惡性腫瘤之一，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成沉重的負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重地影響我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展。結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)腫瘤中可獲得較好防治效果的癌種，篩查方法安全，有效，臨床治療效果較佳。研究顯示，大便潛血試驗(yàn)在45-74歲人群中每2年開展篩查能降低結(jié)直腸癌15％死亡風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)外研究結(jié)果顯示在55-64歲人群中使用乙狀結(jié)腸鏡開展篩查，能降低人群33％的發(fā)病率及43％死亡率。但是由于結(jié)直腸癌在醫(yī)學(xué)上又分為右半結(jié)腸癌、左半結(jié)腸癌、直腸癌，這三種癌癥在表面上都屬于結(jié)直腸癌，但是其實(shí)質(zhì)上病程各不相同。右半結(jié)腸的主要臨床癥狀為食欲不振、惡心、嘔吐、貧血、疲勞、腹痛。右半結(jié)腸癌導(dǎo)致缺鐵性貧血，表現(xiàn)疲勞、乏力、氣短等癥狀。右半結(jié)腸因腸腔寬大，腫瘤生長(zhǎng)至一定體積才會(huì)出現(xiàn)腹部癥狀，這也是腫瘤確診時(shí)，分期較晚的主要原因之一。左半結(jié)腸腸腔較右半結(jié)腸腸腔窄，左半結(jié)腸癌更容易引起完全或部分性腸梗阻。腸阻塞導(dǎo)致大便習(xí)慣改變，出現(xiàn)便秘、便血、腹瀉、腹痛、腹部痙攣、腹脹等。帶有新鮮出血的大便表明腫瘤位于左半結(jié)腸末端或直腸。病期的確診常早于右半結(jié)腸癌。直腸癌的主要臨床癥狀為便血、排便習(xí)慣的改變及梗阻。癌腫部位較低、糞塊較硬者，易受糞塊摩擦引起出血，多為鮮紅或暗紅色，不與成形糞便混和或附于糞柱表面，誤診為“痔”出血。病灶刺激和腫塊潰瘍的繼發(fā)性感染，不斷引起排便反射，易被誤診為“腸炎”或“菌痢”。癌腫環(huán)狀生長(zhǎng)者，導(dǎo)致腸腔縮窄，早期表現(xiàn)為糞柱變形、變細(xì)，晚期表現(xiàn)為不全性梗阻。而且三種癌癥在治療上也是采用不同的方式和藥物，因此，在診斷早期就特異性的區(qū)分三種類型的癌癥的種類，對(duì)于醫(yī)生的治療能夠提供更加精確的指導(dǎo)。而現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)方法都不能達(dá)到這種要求，因此，開發(fā)一種能夠區(qū)分三種癌癥的手段變得尤為重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種能夠特異性區(qū)分右半結(jié)腸癌、左半結(jié)腸癌、直腸癌，并且能夠準(zhǔn)確檢測(cè)直腸癌的方法。本發(fā)明另外提供一種篩選用于檢測(cè)直腸癌的標(biāo)志物的篩選方法，所述標(biāo)志物是通過(guò)直腸癌患者與右半結(jié)腸癌、左半結(jié)腸癌和健康患者之間，通過(guò)基因組測(cè)序比對(duì)篩選，獲得差異表達(dá)的標(biāo)志物，通過(guò)優(yōu)化以及實(shí)際檢測(cè)而獲得的。所述標(biāo)志物為MUT蛋白，血液中的含量大于0.05ug/ml即能夠鑒定為直腸癌。本發(fā)明另外提供一種特異結(jié)合MUT蛋白的核酸適體及其試劑盒或者是特異性結(jié)合該蛋白的單克隆抗體及其試劑盒。本發(fā)明提供的核酸適體，是序列表的序列1-17所示的單鏈DNA。所述核酸適體與MUT蛋白具有較好的親和能力。還可將所述核酸適體進(jìn)行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。利用本發(fā)明的核酸適體，可以捕獲血液中的MUT蛋白，通過(guò)定量測(cè)定MUT蛋白的含量，既可以準(zhǔn)確的用于鑒定患者是否是直腸癌。利用本發(fā)明的核酸適體，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優(yōu)點(diǎn)，適宜于推廣使用。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、直腸癌標(biāo)志物的篩選及鑒定1.樣本采集采集了15例臨床鑒定為直腸癌患者、13例子臨床鑒定為右半結(jié)腸癌患者、10例左半結(jié)腸癌患者的外周血樣本5mL，抗凝，-80攝氏度保存。所述患者均來(lái)自天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，并且與患者簽訂了知情同意書，也符合倫理要求。2.RNA提取按照TrizolReagent試劑盒操作說(shuō)明提取大腸癌組織和正常對(duì)照組織的總RNA，DEPC處理水溶解，Nanodrop-1000核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定總RNA的濃度和純度，-80℃保存。通過(guò)檢測(cè)，RNA濃度總體整體在100ug-250ug/mL之間，能夠用于后續(xù)文庫(kù)的建立。3.測(cè)序文庫(kù)的建立用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA后，用片段化緩沖劑(Fragmentbuffer)將其打斷成短片段，以mRNA為模板用6堿基隨機(jī)引物(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)合成第1條cDNA鏈，再加入緩沖液、RNaseH、dNTPs和DNApolymeraseI合成第2條cDNA鏈，再用QiaQuickPCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫；在做末端修復(fù)和加poly(A)并連接測(cè)序接頭后，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立測(cè)序文庫(kù)。所述方法為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，在此不一一贅述。4.測(cè)序及標(biāo)志物的篩選獲得用IlluminaHiSeqTM2000進(jìn)行文庫(kù)的測(cè)序，由深圳華大基因科技有限公司測(cè)序。用組裝軟件Trinity對(duì)樣本的基因組序列轉(zhuǎn)錄組從頭組裝。差異基因的篩選首先用FCFold-change倍數(shù)變化和統(tǒng)計(jì)檢測(cè)P值初選,然后用FDRFalsediscoveryratio校驗(yàn)方法對(duì)P值進(jìn)行假陽(yáng)性檢驗(yàn).通過(guò)篩選獲得如下較大的差異基因。分別如下表1所示。從以上結(jié)果可以看出，MUT基因的超量表達(dá)與直腸癌患者直接相關(guān)，而TPP1基因的超量表達(dá)與右半結(jié)腸癌患者直接相關(guān)，KLK6的超量表達(dá)與左半結(jié)腸癌患者直接相關(guān)。并且在三種癌癥患者中：MUT蛋白血液中的含量大于0.05ug/ml即能夠鑒定為直腸癌；TPP1蛋白血液中的含量大于0.07ug/ml即能夠鑒定為右半結(jié)腸癌；KLK6蛋白血液中的含量大于0.08ug/ml即能夠鑒定為左半結(jié)腸癌。為了驗(yàn)證所述超量表達(dá)與癌癥直接相關(guān)，分別另外各取三種癌癥患者5例，以正?；颊邽閷?duì)照，隨機(jī)混合樣本，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MUT蛋白血液中的含量大于0.05ug/ml即全部鑒定為直腸癌；TPP1蛋白血液中的含量大于0.07ug/ml即全部鑒定為右半結(jié)腸癌；KLK6蛋白血液中的含量大于0.08ug/ml即全部鑒定為左半結(jié)腸癌，與臨床結(jié)果一致。這充分說(shuō)明所述標(biāo)記物可以用于快速檢測(cè)。實(shí)施例2MUT蛋白核酸適體的篩選和制備設(shè)計(jì)兩端包含大約20個(gè)核苷酸、中間包括36個(gè)核苷酸的隨機(jī)核酸文庫(kù)如下：5’-TCAAGCATGAATTGCAGAATGAC(N36)AGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA-3’；N36代表36個(gè)隨機(jī)核苷酸。(1)首先對(duì)原始隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)進(jìn)行全庫(kù)擴(kuò)增，以增加其拷貝數(shù)，便于篩選的進(jìn)行。以上游引物和生物素修飾的下游引物對(duì)原始隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用購(gòu)于上海生工公司PCR試劑盒。反應(yīng)體系如下：上游引物100pmol(5，-TCAAGCATGAATTGCAGAATGAC-3，)下游引物100pmol(5，-biotin-TGCTTACTGGCTACTCACTTGCT-3，)模板DNA10μg(5’-TCAAGCATGAATTGCAGAATGAC(N36)AGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA-3’)其中，所述下游引物是生物素修飾的下游引物。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘，熱循環(huán)共22次，熱循環(huán)條件為94℃變性1分鐘，56℃復(fù)性52秒，72℃延伸53秒，最后72℃延伸10分鐘。得到PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，將所述產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行膠回收并定量，根據(jù)DNA的量決定表面具有鏈霉親和素修飾的順磁性磁珠加入量，所述DNA與磁珠的摩爾比為1：2.5。將DNA與磁珠孵育35分鐘后，用PBS-T緩沖液清洗磁珠2遍，然后用200μL100mM的NaOH使dsDNA(雙鏈DNA)變性，磁力分離，去除磁珠，得到ssDNA溶液，將所述ssDNA溶液用酸中和后，得到用作篩選的ssDNA隨機(jī)文庫(kù)。按磁珠的使用說(shuō)明書將MUT蛋白(貨號(hào)：H00004594-P01，購(gòu)買自上海群己生物科技有限公司)以共價(jià)結(jié)合形式固定在甲苯磺?；揎椀拇胖樯?，得到共價(jià)結(jié)合MUT蛋白的甲苯磺?；揎椀拇胖椋运龉矁r(jià)結(jié)合MUT蛋白的甲苯磺?；揎椀拇胖闉榘心繕?biāo)進(jìn)行MUT蛋白核酸適配子的第1輪SELEX篩選：將所述共價(jià)結(jié)合MUT蛋白的甲苯磺?；揎椀拇胖榕c步驟(1)中所述用作篩選的ssDNA隨機(jī)文庫(kù)在37℃下孵育3小時(shí)，之后進(jìn)行磁力分離，并用PBS緩沖液清洗磁珠3遍，加入150μLPBS緩沖液，在95℃水浴鍋中靜置12分鐘，之后行磁力分離磁珠，獲得100μL含有ssDNA的PBS溶液，將所述含有ssDNA的PBS溶液為模板，以上游引物(5，-TCAAGCATGAATTGCAGAATGAC-3，)和生物素修飾的下游引物(5，-biotin-TGCTTACTGGCTACTCACTTGCT-3，)進(jìn)行PCR，并進(jìn)行電泳檢測(cè)，得到82bp的目標(biāo)條帶后切膠回收，再次進(jìn)行ssDNA的制備，所述ssDNA的制備方法同步驟(1)中對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行膠回收之后的操作方法，得到第1輪SELEX篩選出的ssDNA文庫(kù)；以所述第1輪SELEX篩選出的ssDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行第2輪SELEX篩選。之后每一輪SELEX篩選均按照所述步驟中第1輪SELEX篩選的方法進(jìn)行，不同的是隨著篩選的進(jìn)行，PCR中引物的用量和熱循環(huán)次數(shù)逐漸減少，具體的為：第1輪-第4輪引物用量l00pmol，熱循環(huán)28次；第5輪～第8輪引物用量80pmol，熱循環(huán)22次；第9輪～第12輪引物用量50pmol，熱循環(huán)17次。其中，每隔4輪SELEX篩選，要進(jìn)行1次反篩選，即使用未固定MUT蛋白的甲苯磺?；胖闉榘心繕?biāo)，與前一輪SELEX篩選得到的ssDNA文庫(kù)進(jìn)行孵育，2小時(shí)后磁力分離去除磁珠，這樣便可將與磁珠特異性結(jié)合的ssDNA除去，避免磁珠對(duì)篩選的影響。經(jīng)過(guò)12輪的SELEX的篩選，MUT蛋白與ssDNA的結(jié)合力不再升高，達(dá)到飽和狀態(tài)，所以在第12輪篩選之后，終止SELEX篩選。在得到第12輪SELEX篩選出的ssDNA之后，對(duì)所述第12輪SELEX篩選出的ssDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所有產(chǎn)物的條帶都顯示在82bp處，產(chǎn)物條帶明亮清晰。使用pEASY-Tl克隆試劑盒將第12輪SELEX篩選出的ssDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆至DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)熱激、孵育后，均勻的將其涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12小時(shí)，菌株生長(zhǎng)出，菌株菌落呈白色圓斑狀，清晰明顯，挑選其中的單個(gè)菌落，置于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培育8小時(shí)，然后進(jìn)行測(cè)序，最終得到本發(fā)明所述的一組MUT蛋白核酸適配子的核苷酸序列，所述核苷酸序列為核苷酸序列表中SEQIDNo.1-SEQIDNo.17所述核苷酸序列之一，所述核酸適配子與MUT蛋白具有高特異性和高親和力。實(shí)施例3蛋白結(jié)合適配子的性能測(cè)定基于氧化石墨烯氧化具有吸附單鏈DNA的特性，構(gòu)建了寡核苷酸適配子親和性驗(yàn)證方法。將固定濃度的MUT蛋白靶標(biāo)(1μΜ)分別與與其對(duì)應(yīng)一系列不同濃度(10，25，50，75，100，150，200uΜ)的候選寡核苷酸適配子進(jìn)行孵育，總體積為300uL，37℃避光孵育2h，并以BB緩沖液代替靶標(biāo)作為陰性對(duì)照組。孵育結(jié)合后加入最佳用量比的GO吸附未與靶標(biāo)結(jié)合的適配子，離心操作后采用F-7000熒光光度計(jì)測(cè)定上清液490nm激發(fā)下520nm發(fā)射的熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)設(shè)置三次平行重復(fù)，實(shí)驗(yàn)采用避光處理。以實(shí)驗(yàn)組相對(duì)陰性對(duì)照組的熒光強(qiáng)度作為縱坐標(biāo)，以適配子濃度作為橫坐標(biāo)，采用GraphPadPrism5.0軟件進(jìn)行非線性回歸擬合計(jì)算適配子的解離常數(shù)Kd值。結(jié)果如下：名稱解離常數(shù)Kd(單位nM)MUT-18.8MUT-29.5MUT-310.3MUT-413.5MUT-57.9MUT-68.4MUT-77.2MUT-813.0MUT-98.1MUT-107.7MUT-118.3MUT-127.8MUT-1312.5MUT-1411.0MUT-1510.7MUT-169.9MUT-178.5BB緩沖液空白對(duì)照無(wú)結(jié)合能力實(shí)施例3所述適配子特異性分析以及穩(wěn)定性分析分別采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，TPP1蛋白，KLK6蛋白，與17條適配子進(jìn)行特異性檢測(cè)，經(jīng)過(guò)結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些適配子都不與這些蛋白相結(jié)合，而只與MUT結(jié)合保持較高的特異性。將所述的適配子，取0.5ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置三周。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)三周的放置其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒有被降解。實(shí)施例4所述適配子疾病的診斷將17個(gè)適配子分別與右半結(jié)腸癌、左半結(jié)腸癌、直腸癌患者各10例進(jìn)行檢測(cè)。在酶標(biāo)板孔中加入10個(gè)血清樣品以及對(duì)照健康樣本包被，并加入通過(guò)生物素標(biāo)記的適配子17個(gè)，加入HRP標(biāo)記的鏈酶親和素，37℃孵育1.5小時(shí)；PBS洗三次后加入TMB進(jìn)行顯色5分鐘；2M硫酸終止反應(yīng)后酶標(biāo)儀讀數(shù)；進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果所示，與健康志愿者相比，左半結(jié)腸癌和右半結(jié)腸癌患者血清中MUT蛋白的0D450均沒有明顯變化，直腸癌患者血清中MUT蛋白的0D450均明顯升高(p＝0.0035)。結(jié)果證明17個(gè)適配子在直腸癌診斷中具有應(yīng)用前景。6個(gè)直腸癌患者中MUT蛋白的含量相對(duì)于正常人顯著增加，大約為正常人的10倍左右，可以直接區(qū)分出來(lái)直腸癌患者。以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表〈110〉郎秀玲〈120〉一種用于直腸癌檢測(cè)的試劑盒〈160〉17〈210〉1〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-1TCAAGCATGAATTGCAGAATGACCAATTATTCATATTATACAATACTCTCCATCCCACTAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA〈210〉2〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-2TCAAGCATGAATTGCAGAATGACCCTTATAATCACCTTCCCTCACATTACAAATACATAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA〈210〉3〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-3TCAAGCATGAATTGCAGAATGACTAAATACAGATCCTCAAACTCTACCTAAAATAACCTAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA〈210〉4〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-4TCAAGCATGAATTGCAGAATGACTTACAAACAAAACTCTATTTTTCACACCATACTCTTAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA〈210〉5〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-5TCAAGCATGAATTGCAGAATGACCTATACTTACACTAATACTTAACATTATATCAAATAAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA〈210〉6〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-6TCAAGCATGAATTGCAGAATGACTTCATCTCGCTAATCACAATTCTCCATTTCTTCTCCAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA〈210〉7〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-7TCAAGCATGAATTGCAGAATGACTCCAACCATTACCTTCCAAACATCCCCCTATACCTTAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA〈210〉8〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-8TCAAGCATGAATTGCAGAATGACCACCCCAACACCGCCTAATATTATATCCCTTCTTCAAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA〈210〉9〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-9TCAAGCATGAATTGCAGAATGACCTTATAATTCGACTAACTCTCAATACCATTTATACAAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA〈210〉10〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-10TCAAGCATGAATTGCAGAATGACACCTACCCAAATAATAATTATCCAATTCTACACATAAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA〈210〉11〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-11TCAAGCATGAATTGCAGAATGACTTCCTCCTTTATATCAAAACCACTTTATTACCCTTCAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA〈210〉12〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-12TCAAGCATGAATTGCAGAATGACTTCACTCATACTGTCATAATCTTTTCTCCCTCATTTAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA〈210〉13〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-13TCAAGCATGAATTGCAGAATGACCCCTTTATCAACACAACACTTCATTTTCCCAATATTAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA〈210〉14〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-14TCAAGCATGAATTGCAGAATGACCATTATCAATCGCCATACCATCCATAACCTCCATACAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA〈210〉15〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-15TCAAGCATGAATTGCAGAATGACTATCAACACTATATTCACTAATATTTCTTCCCTCCCAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA〈210〉16〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-16TCAAGCATGAATTGCAGAATGACATCACCAACACGAAACAATCTTTTTCCTTATCCCTCAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA〈210〉17〈211〉82〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉MUT-17TCAAGCATGAATTGCAGAATGACAAATCAACAACATCTACTTACCCACTTTCTTTTAATAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3