本發(fā)明涉及癌癥診斷檢測用的試劑盒領(lǐng)域，具體為一種用于肝纖維化診斷試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

隨著人們生活水平的提高，酒精肝和脂肪肝等“富貴病”發(fā)病率逐年提高，患病人數(shù)甚至已經(jīng)超過乙肝患者。脂肪肝是一種由各種原因引起肝脂肪積蓄過多的的一種病理狀態(tài)。約10%的單純性脂肪肝會進展至脂肪性肝炎階段，其中將有20%-40%可發(fā)展成為肝纖維化和肝硬化，最終導(dǎo)致肝癌。中國醫(yī)師協(xié)會發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，截至2010年底，我國目前有脂肪肝病人群至少有2億人，未來由脂肪肝病人轉(zhuǎn)化為肝纖維化和肝硬化的人數(shù)約在400-800萬。酒精性肝病形勢也十分嚴峻，不容忽視。截止2011年，保守估計我國酒精肝患者人數(shù)應(yīng)在5000萬左右，如不及時治療，60%的酒精肝患者最終將轉(zhuǎn)化為肝硬化甚至肝癌。目前我國肝纖維化人群應(yīng)在1000萬左右，有超過700萬的肝硬化患者，而且患病人數(shù)不斷增多。

大部分的慢性肝臟損傷都會引起肝纖維化和肝硬化，治療終末期肝硬化的唯一有效手段就是肝移植，但是，即使是在發(fā)達國家，由于的供肝的不足和受者對手術(shù)不能耐受，肝移植技術(shù)無法完全解決肝硬化問題。近年來肝纖維化日益受到人們的重視，已成為肝病研究領(lǐng)域的熱點?，F(xiàn)認為肝纖維化尚有逆轉(zhuǎn)至正常肝的可能，而肝硬變則否，認為阻止或延緩肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展就能治愈大部分慢性肝病患者，給予有效治療還可防止發(fā)展為肝硬化、肝癌。因此早期發(fā)現(xiàn)及治療非常重要。

與大多數(shù)疾病的診療一樣，早診斷、早治療是治療肝纖維化的重要條件，有助于減輕、逆轉(zhuǎn)甚至治愈肝纖維化。準確判斷肝纖維化程度是了解慢性肝病預(yù)后、評價抗纖維化療效和決定治療終點的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但由于肝纖維化沒有特殊的臨床表現(xiàn)，它的診斷目前主要還是依據(jù)肝臟組織病理學(xué)、影像學(xué)（B超、CT等）和血清學(xué)檢查。其中，肝活檢組織病理學(xué)檢查至今仍是診斷肝纖維化，特別是肝纖維化分期的“金標準”。 但因其屬損傷性檢查，患者多不愿接受。血清肝纖維化標志物測定是無創(chuàng)傷性的，是肝纖維化患者的新希望。

目前，市場上還沒有針對肝纖維化的快速高效診斷試劑盒問世，嚴重影響到肝纖維化早期發(fā)現(xiàn)及治療。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對以上述現(xiàn)有肝纖維化診斷存在的不足，提供一種靈敏度高、準確性強，且使用方便高效的用于肝纖維化診斷試劑盒。

本發(fā)明另一目的是提供一種用于肝纖維化診斷試劑盒的檢測方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：用于肝纖維化診斷試劑盒，包括捕獲抗體，所述捕獲抗體是人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4制得的單克隆抗體。

所述用于肝纖維化診斷試劑盒，還包括檢測抗體，所述檢測抗體為人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4制得的多克隆抗體。

所述捕獲抗體為將人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到相應(yīng)的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應(yīng)單克隆抗體。

所述捕獲抗體的制備方法包括如下步驟：

（1）抗原的制備：把人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用；

（2）捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應(yīng)的單克隆抗體為捕獲抗體。

所述檢測抗體為將人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到相應(yīng)的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應(yīng)多克隆抗體。

所述檢測抗體的制備方法包括的步驟如下：

（1）抗原的制備：把人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用；

（2）檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應(yīng)的多克隆抗體為檢測抗體。

所述捕獲抗體預(yù)先包被于微量滴定板的孔內(nèi)，可以簡化步驟，提高檢測效率。

用于肝纖維化診斷試劑盒的制備方法，其包括以下步驟：

（1）抗原的制備：將人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標準品用；

（2）捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；

（3）檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應(yīng)的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；

（4）捕獲抗體包被：

①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH9.6) 將濃度為 1μg/ml 的捕獲抗體包被 微量滴定板的孔；②. 封蓋微量滴定板并在 4℃ 下孵育過夜；③. 棄去包被液（碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體），并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入 200 μl PBST（磷酸鹽吐溫緩沖液），在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃環(huán)境中備用；

（5）封閉和加樣：每孔添加 200μl 封閉緩沖液（1.2％BSA/PBS），封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。

用于肝纖維化診斷試劑盒的檢測方法，其包括以下步驟：

（1） 抗原的制備：將人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到所需的抗原；

（2）捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；

（3）檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應(yīng)的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；

（4）捕獲抗體包被：

①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH9.6) 將濃度為 1μg/ml 的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；

②.封蓋微量滴定板并在 4℃ 下孵育過夜；

③.棄去包被液（碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體），并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入 200 μl PBST（磷酸鹽吐溫緩沖液），在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃環(huán)境中備用；

（5）封閉

①.在微量滴定板的每個孔添加 200μl 封閉緩沖液（1.2％BSA/PBS），封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點；

②.封蓋微量滴定板并在37℃孵育1小時；

（6）加樣

①.將 100 μl的樣品添加到每個孔，在 37℃孵育60分鐘;要得到準確的定量結(jié)果，通常做法是比較未知樣品與標準曲線的信號。每個酶標板都必須測定標準品（兩重測定或三重測定）和空白樣，以確保準確性；

②.棄去樣品，并洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入 200μl PBST（磷酸鹽吐溫緩沖液）；

③.將 100 μl 濃度為 0.5μg/ml的檢測抗體添加到每個孔；

④.封蓋微量滴定板并在37℃孵育1小時；

⑤.用 PBST 洗滌微量滴定板四次；

⑥.添加 100 μl 標記二抗；

⑦.封蓋微量滴定板并在37℃孵育1小時；

⑧.用 PBST 洗滌微量滴定板四次；

(7)檢測

①.將 TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺） 溶液添加到每個孔，孵育 15-30 分鐘，添加等體積的終止液，然后在450 nm 處讀取光密度；

②.由系列稀釋液得到的數(shù)據(jù)繪制標準曲線，濃度標在 X 軸（對數(shù)標度）上，而吸光度標在 Y軸（線性標度）上。通過內(nèi)插法在此標準曲線上得出樣品濃度。

本發(fā)明從眾多的腫瘤標記物中，篩選出新腫瘤標記物人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4(MFAP4)組成肝纖維化快速診斷試劑盒。人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4定位于細胞外基質(zhì)纖維,包括彈性蛋白和膠原蛋白。人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4通過二硫鍵形成二聚體存在于多種組織中，其N末端含有RGD整合素結(jié)合序列，能活化平滑肌細胞。我們的研究表明人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4是肝纖維化的理想標記物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：具有靈敏度高準確性強的特點，其靈敏度及準確性均達到70%以上。

附圖說明

圖1是本發(fā)明用于肝纖維化診斷試劑盒的原理圖；

圖2是本發(fā)明用于肝纖維化診斷試劑盒的檢測抗體最佳工作濃度的選擇對比圖；

圖3是本發(fā)明用于肝纖維化診斷試劑盒的對臨床血清標本的診斷及鑒別診斷對比說明圖；

圖4是本發(fā)明用于肝纖維化診斷試劑盒特異性的檢測對比圖；

圖5是本發(fā)明用于肝纖維化診斷試劑盒敏感性的檢測對比圖；

圖6是本發(fā)明用于肝纖維化診斷試劑盒在肝纖維化治療前后血中檢測到人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4的變化對比圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明用于肝纖維化診斷試劑盒進行詳細的描述說明。

用于肝纖維化診斷試劑盒，包括捕獲抗體，捕獲抗體封閉緩沖液、標準品、標記抗體、洗滌液及顯色液，所述標記抗體選用HRP標記二抗，所述捕獲抗體是人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4制得的單克隆抗體； 其靈敏度及準確性均達到70%。

所述捕獲抗體為將人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到相應(yīng)的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應(yīng)單克隆抗體。

所述捕獲抗體的制備方法包括如下步驟：

（1）抗原的制備：通過分子克隆的方法把人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用；所述抗原的制備也可以使用現(xiàn)有常規(guī)方法制備，在此不再累贅；

（2）捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應(yīng)的單克隆抗體為捕獲抗體；所述哺乳動物是小鼠及兔子，優(yōu)選小鼠；所述捕獲抗體的制備也可以使用現(xiàn)有常規(guī)方法制備，在此不再累贅。

所述檢測抗體包括人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4制得的多克隆抗體。

所述捕檢測抗體為將人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到相應(yīng)的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應(yīng)多克隆抗體。所述檢測抗體的制備方法包括如下步驟：

（1）抗原的制備：通過分子克隆的方法把人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用；

（2）檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應(yīng)的多克隆抗體為檢測抗體。所述哺乳動物是小鼠及兔子，優(yōu)選兔子。

其中，所述捕獲抗體可以預(yù)先包被于 PVC 材質(zhì)的微量滴定板的孔內(nèi)，可以簡化步驟，提高檢測效率。

用于肝纖維化診斷試劑盒的制備方法，其包括以下步驟：

（1） 抗原的制備：通過分子克隆的方法將人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標準品用；

（2）捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；

（3）檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應(yīng)的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；

（4）捕獲抗體包被：

①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH9.6) 將濃度為 1μg/ml 的捕獲抗體包被于微量滴定板的孔；

②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在 4℃下孵育過夜；

③.棄去包被液（碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體），并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入 200 μl PBST（磷酸鹽吐溫緩沖液），在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃環(huán)境中備用；所述洗滌液為PBS（磷酸鹽緩沖液）中加入一定量的Tween 20，所述Tween 20的質(zhì)量百分比濃度為0.05%；

（5）封閉

①.在微量滴定板的每孔添加 200μl 封閉緩沖液（為含1.2％BSA（牛血清白蛋白）的PBS（磷酸鹽緩沖液）），用于封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點；

②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37℃孵育1小時。

用于肝纖維化診斷試劑盒的檢測方法，其包括以下步驟：

（1） 抗原的制備：通過分子克隆的方法將人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標準品用；

（2）捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；

（3）檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應(yīng)的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；

（4）捕獲抗體包被：

①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH9.6) 將濃度為 1μg/ml 的捕獲抗體包被 微量滴定板的孔；

②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在 4℃下孵育過夜；

③.棄去包被液（碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體），并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入 200 μl PBST（磷酸鹽吐溫緩沖液，可以是含0.05%吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液），在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃環(huán)境中備用；所述洗滌液為PBS（磷酸鹽緩沖液）中加入一定量的Tween 20，所述Tween 20的質(zhì)量百分比濃度為0.05%；

（5）封閉

①.在微量滴定板的每個孔添加 200μl 封閉緩沖液（1.2％BSA/PBS），封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點；

②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37℃孵育1小時；

（6）加樣

①.將 100 μl 適當稀釋（稀釋20倍）的樣品添加到每個孔，在 37℃ 下孵育 60 分鐘;要得到準確的定量結(jié)果，通常做法是比較未知樣品與標準曲線的信號。每個酶標板都必須測定標準品（兩重測定或三重測定）和空白樣，以確保準確性；

②.棄去樣品，并洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入 200μl PBST（磷酸鹽吐溫緩沖液）；

③.將 100 μl濃度為 0.5μg/ml的檢測抗體添加到每個孔；

④.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37℃孵育 1小時；

⑤.用 PBST 洗滌微量滴定板四次；

⑥.添加 100 μl 標記二抗，其在使用前便已在PBS中稀釋10000倍（1：10000）。所述標記二抗可以為HRP標記羊抗兔。

⑦.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37℃孵育 1小時。

⑧.用 PBST 洗滌微量滴定板四次。

(7)檢測

①.將 TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺） 溶液添加到每個孔，孵育 15-30 分鐘，添加等體積的終止液 (2 M H₂SO₄)，然后用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm 處讀取光密度。

②.由系列稀釋液得到的數(shù)據(jù)繪制標準曲線，濃度標在 X 軸（對數(shù)標度）上，而吸光度標在 Y軸（線性標度）上。通過內(nèi)插法在此標準曲線上得出樣品濃度。

本發(fā)明用于肝纖維化診斷試劑盒把人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4升高作為診斷早中期肝纖維化的標準,檢測原理如圖1所示；人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4下降作為肝纖維化治療效果評估的標準。可以用于臨床上通過檢測血中腫瘤標記物水平的高低對肝纖維化的治療效果進行動態(tài)評估。另外還可以用于臨床上對肝纖維化的復(fù)發(fā)及預(yù)后判斷的應(yīng)用。

試驗效果說明

雙抗體夾心 ELISA最佳實驗條件的選擇

包被鼠抗人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4單抗最佳工作濃度的選擇 ：根據(jù)方陣法確定包被濃度為1ug/mL時，單克隆抗體的OD值為1.07，所以其最佳包被濃度為1ug/mL。如圖2所示， 兔抗人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4多抗最佳工作濃度的選擇：隨著單抗稀釋倍數(shù)的增加，待測肝纖維化病例血清和正常人血清 OD值有遞減的趨勢，當抗體濃度為 1：200時，陽性對照 (陽性對照 OD值減去空白對照 OD值 )與正常對照 (正常對照 OD值減去空白對照 OD值 )A450nm之比 (簡稱 P／N值 )較高，故選擇兔抗人抗體最佳工作濃度為 1：200。血清摸索的最佳工作濃度為 1：25。封閉液摸索最佳工作溶度為 1.2％BSA。

臨床血清標本檢測

共檢測了106份血清標本，以醫(yī)院經(jīng)病理確診為肝纖維化患者血清為陽性對照組（45例（其中早期肝纖維化20例，晚期肝纖維化25例）），非肝纖維化患者包括肝炎、正常人群血清為陰性對照組（61例（正常40例，肝炎21例）） ，PBST為空白對照，通過上述雙抗夾心 ELISA法進行定性及定量檢測臨床血清標本。如圖2所示，以 P／N值 >2為雙抗夾心ELISA陽性判定標準，以病理診斷為標準對臨床血清標本進行檢測；圖3說明肝纖維化患者血清中人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4的水平顯著高于正常人（P<0.01）。早期肝纖維化結(jié)果檢測靈敏性（SN）為 55％（11/20），晚期肝纖維化檢測靈敏性（SN）為 68％（17/25）；正常人檢測特異性（SP）為 75％（30/40），肝炎患者檢測特異性（SP）為 57％（12/21）。見圖4-5。

臨床對肝纖維化的治療效果進行動態(tài)評估

為確定本試劑盒能否用于對肝纖維化的治療效果進行動態(tài)評估，我們收集了23份肝纖維化患者治療前后的血清。23個患者的檢測結(jié)果參見圖6，結(jié)果顯示肝纖維化患者治療前后的血清中人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4的水平有顯著差異（P<0.05）。有效治療后血清中人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4的水平會大大下降，提示本試劑盒能用于對肝纖維化的治療效果進行動態(tài)評估。