本發(fā)明屬于分析測(cè)試
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種快速測(cè)定金霉素預(yù)混劑中金霉素含量的方法。
背景技術(shù)：
：金霉素(Chlortetracycline,CTC)是屬于四環(huán)素類的一種廣譜抗生素，在醫(yī)療、畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)上有廣泛的用途。近年來(lái)，四環(huán)素類抗生素在抗腫瘤、抑制骨形成等方面的研究，拓寬了這類產(chǎn)品在醫(yī)藥方面的應(yīng)用范圍。金霉素預(yù)混劑是金霉素生產(chǎn)菌的全發(fā)酵液與適量碳酸鈣制成的金霉素鈣鹽，其中的藥物成分主要是金霉素，但是，也含有一些相關(guān)的發(fā)酵副產(chǎn)物，如四環(huán)素等。目前藥典中規(guī)定金霉素含量的檢測(cè)方法主要采用的是微生物法和高效液相色譜法。微生物法測(cè)定金霉素含量的方法、操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，且影響因素多、要求環(huán)境條件高，測(cè)試的準(zhǔn)確度難以保證，測(cè)試的重復(fù)性與再現(xiàn)性也相對(duì)較差?！吨袊?guó)藥典》公開(kāi)了采用HPLC法檢測(cè)鹽酸金霉素含量及相關(guān)物質(zhì)的具體操作，其中提供了兩種不同的色譜條件：堿性流動(dòng)相和酸性流動(dòng)相，堿性流動(dòng)相使用草酸銨、磷酸氫二銨及二甲基甲酰胺的混合溶液，用氨試液調(diào)pH為8.3，該方法雖然比微生物法方便、快捷，但是pH8.3的堿性流動(dòng)相條件，金霉素在堿性條件下極不穩(wěn)定，易氧化降解，而且流動(dòng)相含有鹽類，鹽類容易結(jié)晶吸出，造成儀器系統(tǒng)配件磨損，縮短儀器的壽命；酸性流動(dòng)相使用高氯酸、水和二甲亞砜混合溶液，高氯酸為強(qiáng)氧化性酸，易腐蝕儀器系統(tǒng)，縮短色譜柱及儀器的壽命。申請(qǐng)?zhí)朇N201510431875.1，名稱為《高效液相色譜法測(cè)定金霉素預(yù)混劑含量及相關(guān)物質(zhì)的方法》的專利改用水、磷酸、N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液作為流動(dòng)相，酸性較為溫和，但是該方法僅在一定程度上緩解了結(jié)晶鹽類磨損和強(qiáng)氧化性酸腐蝕的問(wèn)題，并未根本解決，這種含磷酸的流動(dòng)相長(zhǎng)期使用勢(shì)必也會(huì)腐蝕儀器系統(tǒng)，縮短儀器壽命。此外，高效液相色譜法的檢測(cè)費(fèi)用昂貴，樣品預(yù)處理繁瑣，不適用于大量檢測(cè)，因此對(duì)于金霉素預(yù)混劑生產(chǎn)而言，需要一種快速、易行、準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)微生物法和高效液相色譜法存在的不足，提供一種快速測(cè)定金霉素預(yù)混劑中金霉素含量的方法。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種快速測(cè)定金霉素預(yù)混劑中金霉素含量的方法，包括以下步驟：S1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1)鹽酸金霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取鹽酸金霉素的標(biāo)準(zhǔn)品并配制成一系列效價(jià)梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)效價(jià)設(shè)置多組標(biāo)準(zhǔn)溶液，取其中一組作為第一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，所述第一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組用于校正的參比溶液，第一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的處理方式如下：加入n摩爾量的鹽酸；其余各組作為第一標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組，所述第一標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組的處理方式如下：加入n摩爾量的鹽酸后進(jìn)行加熱處理；測(cè)定各個(gè)第一標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組的吸光度并取平均值，然后根據(jù)平均吸光度與第一標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組效價(jià)的對(duì)應(yīng)關(guān)系建立鹽酸金霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取鹽酸四環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)品并配制成一系列效價(jià)梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)效價(jià)設(shè)置多組標(biāo)準(zhǔn)溶液，取其中一組作為第二標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，所述第二標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組用于校正的參比溶液，第二標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的處理方式如下：加入體積VEDTA的EDTA混合液，靜置后，再加入n摩爾量的鹽酸；其余各組作為第二標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組，所述第二標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組的處理方式如下：加入體積VEDTA的EDTA混合液，靜置后，再加入n摩爾量的鹽酸，然后進(jìn)行同S11)中的加熱處理；測(cè)定各個(gè)第二標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組的吸光度并取平均值，然后根據(jù)平均吸光度與第二標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組效價(jià)的對(duì)應(yīng)關(guān)系建立鹽酸四環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)曲線；S2、金霉素預(yù)混劑樣品溶液的配制1)將金霉素預(yù)混劑樣品研磨后取M，經(jīng)溶解處理使樣品中的抗生素成分充分釋放后，過(guò)濾取濾液，濾液體積為V0，即得V0的金霉素預(yù)混劑樣品溶液；S3、金霉素預(yù)混劑樣品溶液總效價(jià)的檢測(cè)1)設(shè)置第一對(duì)照組和第一實(shí)驗(yàn)組，第一對(duì)照組和第一實(shí)驗(yàn)組各取V1的步驟S2所配制的金霉素預(yù)混劑樣品溶液，第一對(duì)照組的處理方式同第一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，第一實(shí)驗(yàn)組的處理方式同第一標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組，第一對(duì)照組和第一實(shí)驗(yàn)組均用水稀釋至相同體積V11；2)分光光度計(jì)檢測(cè)：以第一對(duì)照組為參比溶液，校正后，測(cè)得第一實(shí)驗(yàn)組的吸光度A；3)計(jì)算：對(duì)照步驟S1所得鹽酸金霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸光度A對(duì)應(yīng)于效價(jià)N1，則金霉素預(yù)混劑樣品溶液的總效價(jià)R1＝N1×V11/V1；金霉素預(yù)混劑樣品的總效價(jià)＝V0×R1/M；S4、金霉素預(yù)混劑樣品溶液中四環(huán)素效價(jià)的檢測(cè)1)設(shè)置第二對(duì)照組和第二實(shí)驗(yàn)組，第二對(duì)照組和第二實(shí)驗(yàn)組各取V2的步驟S2所配制的金霉素預(yù)混劑樣品溶液，第二對(duì)照組的處理方式同第二標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，第二實(shí)驗(yàn)組的處理方式同第二標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組，第二對(duì)照組和第二實(shí)驗(yàn)組均用水稀釋至相同體積V22；2)分光光度計(jì)檢測(cè)：以第二對(duì)照組為參比溶液，校正后，測(cè)得第二實(shí)驗(yàn)組的吸光度B；3)計(jì)算：對(duì)照步驟S1所得鹽酸四環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸光度B對(duì)應(yīng)于效價(jià)N2，則金霉素預(yù)混劑樣品溶液中的四環(huán)素效價(jià)R2＝N2×V22/V2；金霉素預(yù)混劑樣品中的四環(huán)素效價(jià)＝V0×R2/M；S5、金霉素預(yù)混劑樣品中的金霉素效價(jià)RCTC＝V0×R1/M-V0×R2/M；S6、取多個(gè)不同金霉素含量的金霉素預(yù)混劑樣品，經(jīng)過(guò)步驟S1至S5分別測(cè)得金霉素效價(jià)RCTC，同時(shí)利用高效液相色譜法分別測(cè)定金霉素含量，然后將所得金霉素效價(jià)RCTC與高效液相色譜法檢測(cè)的金霉素含量進(jìn)行線性擬合，得到回歸方程；S7、取待測(cè)金霉素預(yù)混劑樣品，經(jīng)過(guò)步驟S1至S5得到金霉素效價(jià)RCTC后，代入回歸方程即得該待測(cè)金霉素預(yù)混劑樣品中的金霉素含量。本發(fā)明的檢測(cè)原理為：金霉素預(yù)混劑樣品溶液中加入鹽酸，其中的金霉素和四環(huán)素在酸性條件下，經(jīng)加熱水浴處理后脫去一分子水而生成黃色的脫水金霉素和黃色的脫水四環(huán)素，其顏色深度(對(duì)應(yīng)于分光光度計(jì)中測(cè)得的吸光度)與效價(jià)成正比；本發(fā)明中所用的EDTA混合液由氫氧化鈉和乙二胺四乙酸二鈉溶于水中配制而成，因此EDTA混合液呈堿性，加入到金霉素預(yù)混劑樣品溶液中，金霉素在堿性條件下轉(zhuǎn)化為異金霉素，使金霉素失去在酸性條件下顯色的性質(zhì)，然后加鹽酸使四環(huán)素在酸性條件下加熱脫去1分子水而生成黃色的脫水四環(huán)素，其顏色深度(對(duì)應(yīng)于分光光度計(jì)中測(cè)得的吸光度)與效價(jià)成正比基于以上原理，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和金霉素預(yù)混劑樣品溶液作出加鹽酸和/或加EDTA混合液的處理，測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液建立吸光度和效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)測(cè)定金霉素預(yù)混劑樣品溶液的吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出金霉素預(yù)混劑樣品溶液中金霉素和四環(huán)素的總效價(jià)以及四環(huán)素自身的效價(jià)，進(jìn)而計(jì)算得到金霉素效價(jià)。最后將分光光度計(jì)所得金霉素效價(jià)與高效液相色譜法測(cè)得的金霉素含量進(jìn)行線性擬合，得到回歸方程，此后對(duì)于待測(cè)金霉素預(yù)混劑樣品，只需測(cè)得金霉素效價(jià)，即可代入方程得到金霉素含量。本發(fā)明的有益效果如下：(1)儀器設(shè)備投入少，只需要一臺(tái)分光光度計(jì)；(2)操作簡(jiǎn)便，避免了操作繁瑣，減輕勞動(dòng)強(qiáng)度；(3)試劑用量少，節(jié)約了檢測(cè)試劑成本，且所用試劑對(duì)人和環(huán)境無(wú)毒害，減輕了污水處理負(fù)擔(dān)；(4)樣品處理及測(cè)定程序簡(jiǎn)單，便于實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，可一次性檢測(cè)大量樣品；(5)對(duì)于金霉素預(yù)混劑檢測(cè)的準(zhǔn)確度與重現(xiàn)性不低于高效液相色譜法，適合于企業(yè)日常生產(chǎn)的連續(xù)檢測(cè)，準(zhǔn)確可靠且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。附圖說(shuō)明圖1為步驟S6中的線性擬合圖；圖2為鹽酸金霉素的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的技術(shù)目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出進(jìn)一步的說(shuō)明。一種快速測(cè)定金霉素預(yù)混劑中金霉素含量的方法，包括以下步驟：S1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1)鹽酸金霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精確吸取效價(jià)為1000u/mL的鹽酸金霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.20mL、1.40mL于七組50mL的容量瓶中，每組3只容量瓶，分別加入2mol/L的鹽酸溶液5mL，其中一只容量瓶加蒸餾水稀釋定容、搖勻，作為參比溶液，即第一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組；另兩只進(jìn)行100℃、5min的水浴處理，冷卻后加蒸餾水稀釋定容、搖勻，作為第一標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組，測(cè)試后取平均值；在分光光度計(jì)上選波長(zhǎng)440nm，用參比溶液校正，用1cm比色皿，以參比溶液作空白對(duì)照測(cè)得上述7組中第一標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組的吸光度并取平均值，以效價(jià)為縱坐標(biāo)，以平均吸光度為橫坐標(biāo)，建立鹽酸金霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精確吸取1000u/mL鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.20mL、1.40mL于七組50mL容量瓶中，每組3只容量瓶，分別加入EDTA混合液11mL，室溫靜置5min，然后分別加入2mol/L的鹽酸溶液5mL，其中一只容量瓶加蒸餾水稀釋定容、搖勻，作為參比溶液，即第二標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組；另兩只進(jìn)行100℃、5min的水浴處理，冷卻后加蒸餾水稀釋定容、搖勻，作為第二標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組，測(cè)試后取平均值；在分光光度計(jì)上選波長(zhǎng)440nm，用參比溶液校正，用1cm比色皿，以參比溶液作空白對(duì)照測(cè)得上述7組中第二標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組的吸光度并取平均值，以效價(jià)為縱坐標(biāo)，以平均吸光度為橫坐標(biāo)，建立鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線；所用EDTA混合液的配制方法如下(下同)：分別稱取分析純氫氧化鈉55克、乙二胺四乙酸二鈉4.55克于燒杯中，加200mL蒸餾水溶解后，稀釋至5000mL，保存于試劑瓶中，備用；S2、金霉素預(yù)混劑樣品溶液的配制1)將金霉素預(yù)混劑樣品利用粉樣器研磨成粉狀并取Mg于50mL容量瓶中，少量多次加入浸泡劑后并平搖，無(wú)氣泡產(chǎn)生后定容，然后超聲波水浴20min，通過(guò)浸泡劑和超聲波水浴處理充分促進(jìn)金霉素和四環(huán)素的溶解，取出冷卻至室溫，上述溶解處理的作用在于使樣品中的抗生素成分充分釋放，然后過(guò)濾取濾液，濾液體積為V0＝50mL，即得V0＝50mL的金霉素預(yù)混劑樣品溶液；所述浸泡劑由水、丙酮和5mol/L的鹽酸按照1000：500：80的體積比混合配制而成；所得金霉素預(yù)混劑樣品溶液中金霉素預(yù)混劑樣品的濃度為0.004～0.007g/mL；S3、金霉素預(yù)混劑樣品溶液總效價(jià)的檢測(cè)1)設(shè)置第一對(duì)照組和第一實(shí)驗(yàn)組，第一對(duì)照組和第一實(shí)驗(yàn)組各取V1＝0.5mL的步驟S2所配制的金霉素預(yù)混劑樣品溶液于兩只50mL容量瓶中，且各加入2mol/L鹽酸5mL，第一對(duì)照組加水稀釋定容、搖勻，第一實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行100℃、5min中的水浴處理后，冷卻，加水稀釋定容、搖勻，V11＝50mL；2)分光光度計(jì)檢測(cè)：以第一對(duì)照組為參比溶液，在波長(zhǎng)440nm處校正后，測(cè)得第一實(shí)驗(yàn)組的吸光度A；3)計(jì)算：對(duì)照步驟S1所得鹽酸金霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸光度A對(duì)應(yīng)于效價(jià)N1，則金霉素預(yù)混劑樣品溶液的總效價(jià)R1(u/mL)＝N1×V11/V1＝100N1；金霉素預(yù)混劑樣品的總效價(jià)(u/g)＝V0×R1/M＝50×R1/M；S4、金霉素預(yù)混劑樣品溶液四環(huán)素效價(jià)的檢測(cè)1)設(shè)置第二對(duì)照組和第二實(shí)驗(yàn)組，第二對(duì)照組和第二實(shí)驗(yàn)組各取V2＝1mL的步驟S2所配制的金霉素預(yù)混劑樣品溶液于兩只50mL容量瓶中，且各加入11mL的EDTA混合液，室溫靜置5min后，第二對(duì)照組和第二實(shí)驗(yàn)組再各加入2mol/L的鹽酸5mL，然后第二對(duì)照組加水稀釋并定容、搖勻；第二實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行100℃、5min中的水浴處理后，冷卻，加水稀釋定容、搖勻，V22＝50mL；2)分光光度計(jì)檢測(cè)：以第二對(duì)照組為參比溶液，在波長(zhǎng)440nm處校正后，測(cè)得第二實(shí)驗(yàn)組的吸光度B；3)計(jì)算：對(duì)照步驟S1所得鹽酸四環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸光度B對(duì)應(yīng)于效價(jià)N2，則金霉素預(yù)混劑樣品溶液中的四環(huán)素效價(jià)R2(u/mL)＝N2×V22/V2＝50N2；金霉素預(yù)混劑樣品中的四環(huán)素效價(jià)(u/g)＝V0×R2/M＝50×R2/M；S5、金霉素預(yù)混劑中的藥成分主要為金霉素和四環(huán)素，所以金霉素預(yù)混劑樣品中的金霉素效價(jià)RCTC＝V0×R1/M-V0×R2/M＝50×(R1-R2)/M；S6、取多組不同金霉素含量且不同重量的金霉素預(yù)混劑樣品(金霉素含量從13％、15％、20％、22％、25％不等)，經(jīng)過(guò)上述步驟S1至S5測(cè)得多組吸光度A和B，并計(jì)算得到對(duì)應(yīng)的R1、R2和RCTC，同時(shí)利用高效液相色譜法測(cè)得每組金霉素預(yù)混劑樣品的金霉素含量，然后將所得金霉素效價(jià)RCTC與高效液相色譜法檢測(cè)的金霉素含量進(jìn)行線性擬合，以分光光度計(jì)檢測(cè)的金霉素效價(jià)RCTC為橫坐標(biāo)，高效液相色譜法檢測(cè)的金霉素含量為縱坐標(biāo)，做直線回歸和相關(guān)性分析，繪制線性擬合圖如圖1所示，并得到回歸方程：金霉素含量＝-6.570+0.9851×RCTC，相關(guān)系數(shù)R-Sq＝99.8％。所述多組金霉素預(yù)混劑樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)如表1所示。S7、取待測(cè)金霉素預(yù)混劑樣品，經(jīng)過(guò)步驟S1至S5得到金霉素效價(jià)RCTC后，代入回歸方程即得待測(cè)金霉素預(yù)混劑樣品中的金霉素含量。表1多組金霉素預(yù)混劑樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)匯總注：樣品編號(hào)括號(hào)中的百分比指金霉素預(yù)混劑樣品中金霉素含量的質(zhì)量比；效價(jià)單位g/kg＝103u/g。本發(fā)明選擇在波長(zhǎng)440nm處校正，原因在于：經(jīng)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)(見(jiàn)圖2、表2)，鹽酸金霉素在440nm處有最大吸收峰，故取440nm進(jìn)行校正。具體的檢測(cè)方法如下：(1)配制1000u/mL鹽酸金霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，從中各吸取1mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于兩只50mL容量瓶中，分別加入5mL2mol/mL的鹽酸，其中一只加蒸餾水定容、搖勻，作為參比溶液，另一只于100℃水浴加熱5分鐘，取出冷卻至室溫，加水定容、搖勻；(2)采用752N型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，開(kāi)機(jī)預(yù)熱20分鐘，在不同波長(zhǎng)處測(cè)上述溶液的吸光度，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)得到的吸收譜圖如圖2所示，吸收數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如表2所示：表2鹽酸金霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外-可見(jiàn)吸收數(shù)據(jù)波長(zhǎng)(nm)240400410420430436438440442444446448450吸光度0.000.0050.1530.2300.2720.2860.2880.2900.2890.2880.2870.2800.277波長(zhǎng)(nm)452454456458460470480490500510520860--吸光度0.2730.2680.2590.25402460.1950.1400.0880.0650.0400.0230.000--最后所應(yīng)說(shuō)明的是：上述實(shí)施例僅用于說(shuō)明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同替換及不脫離本發(fā)明精神和范圍的修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3