本發(fā)明涉及生物小分子同型半胱氨酸的檢測方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種用于檢測同型半胱氨酸的酶循環(huán)方法。

背景技術(shù)：

同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)，或稱為高半胱氨酸，是氨基酸半胱氨酸的異種，其側(cè)鏈中含有巰基(-SH)。Hcy主要來源于飲食攝取的蛋氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中一個重要的中間產(chǎn)物，其本身并不參加蛋白質(zhì)的合成。1969年Mccully從遺傳性同型半胱氨酸尿癥死亡兒童尸檢中發(fā)現(xiàn),其體循環(huán)內(nèi)存在廣泛的動脈血栓形成及動脈粥樣硬化(AS)的病理表現(xiàn)，由此提出高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHCY)可導(dǎo)致動脈粥樣硬化性血管性疾病的假說。Hcy可以直接或間接導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，影響低密度脂蛋白的氧化，增強(qiáng)血小板功能，促進(jìn)血栓形成。

同型半胱氨酸的測定方法除了傳統(tǒng)的高效液相色譜法、酶免疫分析法、熒光偏振法等外，近幾年也出現(xiàn)了以甲硫氨酸和腺苷同型半胱氨酸為基礎(chǔ)的循環(huán)酶法(參見中國專利CN200480026009.4)，但由于關(guān)鍵原料的生產(chǎn)技術(shù)難以掌握且成本很高，難以形成市場應(yīng)用。

傳統(tǒng)的酶免疫分析法的基本分析原理是酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定，其步驟為：先使用酶將血樣中所有形式的Hcy轉(zhuǎn)變成s-腺苷-L-Hcy,然后加入酶標(biāo)的抗s-腺苷-L-Hcy的單克隆或多克隆抗體，采用競爭結(jié)合的原理，將不同水平的標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)抗體競爭結(jié)合，然后以顯色試劑和終止試劑分別進(jìn)行顯色和終止，制作出hcy濃度與發(fā)色強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品也按相同步驟處理，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可以查出其Hcy的濃度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服背景技術(shù)中的不足，本發(fā)明公開了區(qū)別于傳統(tǒng)測定方法和現(xiàn)有循環(huán)酶法的體液中同型半胱氨酸的測定方法，該方法是以四氫葉酸為基礎(chǔ)產(chǎn)生循環(huán)反應(yīng)，通過累積生成還原型輔酶I(NADH)放大檢測信號，在波長340nm進(jìn)行測定，NADH與參與反應(yīng)的同型半胱氨酸濃度成正比。該反應(yīng)中涉及關(guān)鍵酶包括：甲硫氨酸合成酶(EC 2.1.1.13)、氨基甲基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.1.2.10)、甘氨酸羥基甲基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.1.2.1)，用于同型半胱氨酸的循環(huán)檢測。本發(fā)明同時還公開了基于上述檢測方法的同型半胱氨酸檢測的試劑，該試劑能夠廣泛應(yīng)用于臨床中同型半胱氨酸的檢測。

為了實(shí)現(xiàn)所述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種用于檢測同型半胱氨酸的酶循環(huán)方法，包括兩個反應(yīng)物的循環(huán)反應(yīng)，分別是四氫葉酸循環(huán)反應(yīng)和5，10-甲基四氫葉酸循環(huán)反應(yīng)；

所述四氫葉酸循環(huán)反應(yīng)為5-甲基四氫葉酸與L-高半胱氨酸反應(yīng)生成四氫葉酸和L-甲硫氨酸后，再以四氫葉酸為反應(yīng)底物與甘氨酸和NAD⁺反應(yīng)生成5，10-甲基四氫葉酸和NADH；

所述5，10-甲基四氫葉酸循環(huán)反應(yīng)為將四氫葉酸循環(huán)反應(yīng)中生成的5，10-甲基四氫葉酸為反應(yīng)底物，與甘氨酸反應(yīng)生成四氫葉酸和絲氨酸；

通過檢測340nm波長處NADH的吸光度上升程度，測算出L-高半胱氨酸的濃度大小測定結(jié)果。

為了進(jìn)一步改進(jìn)技術(shù)方案，本發(fā)明所述四氫葉酸循環(huán)反應(yīng)中，5-甲基四氫葉酸與L-高半胱氨酸反應(yīng)生成四氫葉酸和L-甲硫氨酸的反應(yīng)步驟中，使用的酶為甲硫氨酸合成酶，所述反應(yīng)的反應(yīng)式為：5-甲基四氫葉酸+L-高半胱氨酸→四氫葉酸+L-甲硫氨酸。

為了進(jìn)一步改進(jìn)技術(shù)方案，本發(fā)明所述四氫葉酸循環(huán)反應(yīng)中，以四氫葉酸為反應(yīng)底物與甘氨酸和NAD⁺反應(yīng)生成5，10-甲基四氫葉酸和NADH的反應(yīng)步驟中，使用的酶為氨基甲基轉(zhuǎn)移酶；所述反應(yīng)的反應(yīng)式為：甘氨酸+四氫葉酸+NAD⁺→5，10-甲基四氫葉酸+NH₃+CO₂+NADH+H⁺。

為了進(jìn)一步改進(jìn)技術(shù)方案，本發(fā)明所述5，10-甲基四氫葉酸循環(huán)反應(yīng)中，5，10-甲基四氫葉酸與甘氨酸反應(yīng)生成四氫葉酸和絲氨酸的反應(yīng)步驟中，使用的酶為甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶；所述反應(yīng)的反應(yīng)式為：5，10-甲基四氫葉酸+甘氨酸+H₂O→四氫葉酸+絲氨酸。

一種用于檢測同型半胱氨酸的酶循環(huán)方法，其特征是：其測試步驟為：

S1:配制試劑盒：所述試劑盒試劑包含以下各組分：緩沖液：Tris，反應(yīng)底物5-甲基四氫葉酸鈣，反應(yīng)底物甘氨酸，反應(yīng)底物NAD⁺，酶激活離子MgCl₂，甲硫氨酸合成酶，氨基甲基轉(zhuǎn)移酶，甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶；

S2：取步驟S1中的緩沖液Tris，溶解于純化水中，并用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值；

S3：依次稱取步驟S1中的5-甲基四氫葉酸、甘氨酸、NAD⁺、MgCl₂，并加入步驟S2的溶液中，攪拌至完全溶解；

S4：取步驟S1中配制好的試劑甲硫氨酸合成酶、氨基甲基轉(zhuǎn)移酶和甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶并各自單獨(dú)溶解后，加入步驟S3所述的溶液中，攪拌混勻；

S5：測定步驟S4的混勻溶液的PH值，并調(diào)節(jié)pH值，加入純化水定容，然后過濾后置于2-8℃?zhèn)溆茫?/p>

S6：將步驟S5中過濾后的溶液置于水浴平衡后得反應(yīng)液，并配制濃度為0.05mM的L-HCY溶液作為檢測物；

S7：按反應(yīng)液：檢測物按比例，在生化分析儀上設(shè)定反應(yīng)參數(shù)，并記錄每一讀點(diǎn)的吸光度，用于計算吸光度變化率。

為了進(jìn)一步改進(jìn)技術(shù)方案，本發(fā)明所述步驟S1的試劑盒中各組分的濃度為：緩沖液Tris：20mM-50mM；反應(yīng)底物5-甲基四氫葉酸鈣：5mM-10mM；反應(yīng)底物甘氨酸：10mM-20mM；NAD⁺1mM-5mM；酶激活離子MgCl₂：2mM-10mM；甲硫氨酸合成酶：5-15kU/L；氨基甲基轉(zhuǎn)移酶：1-4kU/L；甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶：2-6kU/L。

為了進(jìn)一步改進(jìn)技術(shù)方案，本發(fā)明所述步驟S2和步驟S5中調(diào)節(jié)后的PH值為至8.00±0.05；所述步驟S5中加入純化水定容至500ml，將定容后溶液通過0.22μm膜過濾。

為了進(jìn)一步改進(jìn)技術(shù)方案，本發(fā)明所述步驟S6中水浴溫度為37℃，平衡時間為15-20min。

為了進(jìn)一步改進(jìn)技術(shù)方案，本發(fā)明所述步驟S7中反應(yīng)液：檢測物的比例為50:1。

為了進(jìn)一步改進(jìn)技術(shù)方案，本發(fā)明所述試劑Tris、5-甲基四氫葉酸鈣、甘氨酸、NAD⁺和MgCl₂，均為Sigma公司生產(chǎn)的試劑。

由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明所述檢測同型半胱氨酸的酶循環(huán)方法，包括兩個反應(yīng)物的循環(huán)反應(yīng)，主要是通過四氫葉酸和5,10-甲基四氫葉酸之間的雙循環(huán)反應(yīng)，在L-高半胱氨酸的啟動下使NADH(還原型輔酶I)不斷累積，即在340nm波長處吸光度不斷增加，使檢測信號不斷增強(qiáng)，簡接獲得參與反應(yīng)的L-高半胱氨酸的濃度。各反應(yīng)如下：

1)5-甲基四氫葉酸+L-高半胱氨酸→四氫葉酸+L-甲硫氨酸，該反應(yīng)過程中，使用甲硫氨酸合成酶作為反應(yīng)酶；

2)甘氨酸+四氫葉酸+NAD⁺→5，10-甲基四氫葉酸+NH₃+CO₂+NADH+H⁺，該反應(yīng)過程中，使用氨基甲基轉(zhuǎn)移酶作為反應(yīng)酶；

3)5，10-甲基四氫葉酸+甘氨酸+H₂O→四氫葉酸+絲氨酸，該反應(yīng)過程中，使用甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶作為反應(yīng)酶。

本發(fā)明所述的雙循環(huán)，第一個循環(huán)反應(yīng)：是上述反應(yīng)1)和反應(yīng)2)中的四氫葉酸循環(huán)反應(yīng)，四氫葉酸在反應(yīng)1)中為產(chǎn)物，在反應(yīng)2)中為底物；第二個循環(huán)反應(yīng)：是上述反應(yīng)2)和反應(yīng)3)中的5，10-甲基四氫葉酸循環(huán)，5，10-甲基四氫葉酸在反應(yīng)2中為產(chǎn)物，在反應(yīng)3中為底物；當(dāng)反應(yīng)啟動時，四氫葉酸和5，10-甲基四氫葉酸的濃度會維持在一定水平，不斷消耗和產(chǎn)生，而反應(yīng)2中的NADH(最終的指示物)濃度則會不斷累積，增加在波長340nm處的吸光度，并且與反應(yīng)1中的L-高半胱氨酸濃度相關(guān)，使測定L-高半胱氨酸靈敏度增加。

當(dāng)反應(yīng)為非循環(huán)反應(yīng)時，其靈敏度主要與初始的反應(yīng)物濃度相關(guān)，只能在一定范圍內(nèi)增加；當(dāng)反應(yīng)為單循環(huán)反應(yīng)時，其靈敏度主要與初始反應(yīng)物以及循環(huán)反應(yīng)物濃度相關(guān)，相對非循環(huán)反應(yīng)能夠大大提高靈敏度；當(dāng)反應(yīng)為雙循環(huán)反應(yīng)時，將反應(yīng)信號提高明顯，增強(qiáng)反應(yīng)靈敏度，其靈敏度主要與初始反應(yīng)物以及循環(huán)反應(yīng)物濃度相關(guān)，相對單循環(huán)反應(yīng)能夠大大提高靈敏度。

附圖說明

圖1為實(shí)施例一至實(shí)施例三的反應(yīng)曲線圖。

圖2為實(shí)施例一至實(shí)施例三在22-23范圍讀點(diǎn)的反應(yīng)曲線圖。

具體實(shí)施方式

通過下面的實(shí)施例可以詳細(xì)的解釋本發(fā)明，公開本發(fā)明的目的旨在保護(hù)本發(fā)明范圍內(nèi)的一切技術(shù)改進(jìn)。

實(shí)施例一

S1：配制試劑盒，所述試劑盒試劑包含以下各組分的物質(zhì)：濃度為20mM的Tris緩沖液；濃度為5mM的5-甲基四氫葉酸鈣；濃度為10mM的甘氨酸；濃度為1mM的NAD⁺；濃度為2mM的MgCl₂；濃度為5kU/L的甲硫氨酸合成酶；濃度為1kU/L的氨基甲基轉(zhuǎn)移酶；濃度為2kU/L的甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶。

S2：稱取1.211g步驟S1中的Tris緩沖液，溶解于300ml純化水中，并用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.00±0.05；

S3：稱取步驟S1中的5-甲基四氫葉酸鈣1.244g，甘氨酸0.375g，NAD⁺0.331g和MgCl₂0.203g加入到步驟S2的緩沖溶液內(nèi)，攪拌至完全溶解；

S4：稱取步驟S1中的甲硫氨酸合成酶2.5kU、氨基甲基轉(zhuǎn)移酶0.5kU、甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶1kU，并單獨(dú)溶解后，加入步驟S3的溶液中，攪拌至充分混勻；

S5：測定上述溶液pH值，并調(diào)節(jié)pH至8.00±0.05，使用500ml量筒加入純化水定容至500ml。將定容后溶液通過0.22μm膜過濾，置于2～8℃?zhèn)溆谩?/p>

S6:將步驟S5中過濾后的溶液置于置于37℃水浴中平衡15min后得反應(yīng)液，并配制濃度為0.05mM的L-高半胱氨酸溶液作為檢測物；

S7：按反應(yīng)液：檢測物按50：1的比例，在生化分析儀上設(shè)定反應(yīng)參數(shù)，并記錄每一讀點(diǎn)的吸光度，用于計算吸光度變化率。

實(shí)施例二

S1：配制試劑盒，所述試劑盒試劑包含以下各組分的物質(zhì)：濃度為35mM的Tris緩沖液；濃度為7.5mM的5-甲基四氫葉酸鈣；濃度為15mM的甘氨酸；濃度為3mM的NAD⁺；濃度為3.5mM的MgCl₂；濃度為7.5kU/L的甲硫氨酸合成酶；濃度為3kU/L的氨基甲基轉(zhuǎn)移酶；濃度為4kU/L的甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶。

S2：稱取2.120g步驟S1中的Tris緩沖液，溶解于300ml純化水中，并用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.00±0.05；

S3：稱取步驟S1中的5-甲基四氫葉酸鈣1.866g，甘氨酸0.563g，NAD⁺0.994g和MgCl₂0.356g加入到步驟S2的緩沖溶液內(nèi)，攪拌至完全溶解；

S4：稱取步驟S1中的甲硫氨酸合成酶3.75kU、氨基甲基轉(zhuǎn)移酶1.5kU、甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2kU，并單獨(dú)溶解后，加入步驟S3的溶液中，攪拌至充分混勻；

S5：測定上述溶液pH值，并調(diào)節(jié)pH至8.00±0.05，使用500ml量筒加入純化水定容至500ml。將定容后溶液通過0.22μm膜過濾，置于2-8℃?zhèn)溆谩?/p>

S6:將步驟S5中過濾后的溶液置于置于37℃水浴中平衡15min后得反應(yīng)液，并配制濃度為0.05mM的L-高半胱氨酸溶液作為檢測物；

S7：按反應(yīng)液：檢測物按50：1的比例，在生化分析儀上設(shè)定反應(yīng)參數(shù)，并記錄每一讀點(diǎn)的吸光度，用于計算吸光度變化率。

實(shí)施例三

S1：配制試劑盒，所述試劑盒試劑包含以下各組分的物質(zhì)：濃度為50mM的Tris緩沖液；濃度為10mM的5-甲基四氫葉酸鈣；濃度為20mM的甘氨酸；濃度為5mM的NAD⁺；濃度為5mM的MgCl₂；濃度為10kU/L的甲硫氨酸合成酶；濃度為5kU/L的氨基甲基轉(zhuǎn)移酶；濃度為6kU/L的甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶。

S2：稱取3.029g步驟S1中的Tris緩沖液，溶解于300ml純化水中，并用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.00±0.05；

S3：稱取步驟S1中的5-甲基四氫葉酸鈣2.488g，甘氨酸0.751g，NAD⁺1.656g和MgCl₂0.508g加入到步驟S2的緩沖溶液內(nèi)，攪拌至完全溶解；

S4：稱取步驟S1中的甲硫氨酸合成酶5kU、氨基甲基轉(zhuǎn)移酶2.5kU、甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶3kU，并單獨(dú)溶解后，加入步驟S3的溶液中，攪拌至充分混勻；

S5：測定上述溶液pH值，并調(diào)節(jié)pH至8.00±0.05，使用500ml量筒加入純化水定容至500ml。將定容后溶液通過0.22μm膜過濾，置于2-8℃?zhèn)溆谩?/p>

S6:將步驟S5中過濾后的溶液置于置于37℃水浴中平衡15min后得反應(yīng)液，并配制濃度為0.05mM的L-高半胱氨酸溶液作為檢測物；

S7：按反應(yīng)液：檢測物按50：1的比例，在生化分析儀上設(shè)定反應(yīng)參數(shù)，并記錄每一讀點(diǎn)的吸光度，用于計算吸光度變化率。

實(shí)施例一至三的測定結(jié)果如下表所示：

通過反應(yīng)結(jié)果顯示，三個實(shí)施例均呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，在實(shí)施例一中顯示的各反應(yīng)物的濃度范圍內(nèi)，該反應(yīng)原理可以實(shí)施，并當(dāng)反應(yīng)物濃度增高時，反應(yīng)變化率(ΔA/min)也會增加，但當(dāng)濃度增加到配方上限時，ΔA/min過高，在測定高濃度樣本時會使吸光度超過儀器可讀上限。實(shí)施例三結(jié)果顯示，反應(yīng)后期變化較大，當(dāng)測試高濃度樣本時可能會是吸光度達(dá)到生化儀檢測閾值，各反應(yīng)物濃度超過實(shí)施例3給出的值可能導(dǎo)致吸光度超出儀器檢測閾值。從而測試結(jié)果不準(zhǔn)。因此在表1所給定的濃度范圍內(nèi)，線性和反應(yīng)靈敏度均能符合要求。

本發(fā)明未詳述部分為現(xiàn)有技術(shù)。