本實(shí)用新型屬于免疫學(xué)檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白(HNL)同源二聚體的快速定量裝置。
背景技術(shù)：
：人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(humanneutrophillipocalin,HNL)也稱中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophilgelatinaseassociatedlipocalin，NGAL)，又稱脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2(Lipocalin-2)，是一種脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(J.Biol.Chem.1993,268:10425-10432；Scand.J.Clin.Lab.Invest.1994,54:365-376)。HNL以單體、同源二聚體及異源二聚體(單體與MMP9分子形成)等多種分子形式存在，不同分子形式HNL與不同的病理過程有關(guān)。如單體HNL可能與急性腎損傷有相對(duì)較高的相關(guān)性(Clin.Chim.Acta.2009,403:121-125；Lancet2005,365:1231-1238；Biomed.Res.Int.2015,2009,186:48-51；Am.J.Nephrol.2004,24:307-315；中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥2015,24:46-47)，異源二聚體HNL可能與腫瘤侵襲性有關(guān)。蔡林君等人研究發(fā)現(xiàn)同源二聚體HNL反映尿道感染情況(Clin.J.Am.Soc.Nephrol.2010)；此外，VengePer和XuS.Y.等人研究發(fā)現(xiàn)同源二聚體HNL對(duì)區(qū)分診斷急性細(xì)菌感染和病毒感染有很高的特異性和靈敏度(J.Immunol.Methods2015,424:85-90；J.Clin.Lab.Invest.1995，55:125-131)。相對(duì)其他分子形式HNL，同源二聚體對(duì)診斷急性細(xì)菌感染有較高的特異性和靈敏度，可能是因?yàn)閰⑴c急性細(xì)菌感染過程的中性粒細(xì)胞分泌的HNL主要是同源二聚體(Clin.Chim.Acta.2009,403:121-125)。目前已有多種HNL測(cè)定方法公開，如RIA(國(guó)際專利WO/1995/029404A1和中國(guó)ZL200980155194等)、ELISA(歐洲專利EP2225268和中國(guó)專利ZL200980155194等)、Western-blotting、膠乳免疫比濁法(中國(guó)專利ZL201410431182)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01510184818)、免疫層析試紙條技術(shù)(中國(guó)專利ZL201220323587、ZL201420423962、ZL201220392399、ZL201220497401、ZL201220323586和ZL201220497401)等。以上各種HNL定量方法有各自優(yōu)缺點(diǎn)和相應(yīng)用途，但除Western-blotting能區(qū)分不同分子形式HNL外，上述HNL定量方法均不能特異性定量同源二聚體HNL，從而影響該蛋白作為一些疾病如急性細(xì)菌感染的診斷能力。雖然，Western-blotting能區(qū)分不同分子形式HNL，但是由于該技術(shù)本身的缺陷限制了該方法的實(shí)際應(yīng)用。如操作復(fù)雜、測(cè)試周期長(zhǎng)、每次分析樣品數(shù)量有限以及準(zhǔn)確定量困難等。綜上，目前實(shí)驗(yàn)室研究和將來可能的臨床應(yīng)用急需建立快速、特異性定量同源二聚體HNL的裝置及相應(yīng)方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了實(shí)現(xiàn)人中性粒細(xì)胞載脂蛋白HNL同源二聚體分子的特異性定量，本實(shí)用新型設(shè)計(jì)并開發(fā)出了一種基于夾心ELISA技術(shù)的HNL同源二聚體的快速定量裝置。該裝置具有制備方法簡(jiǎn)單(只需一種抗NHL抗體)、使用快捷(孵育過程只有兩步)、檢測(cè)限低(0.1ng/mL，能滿足體液樣本中HNL的檢出)等優(yōu)異性能，在急性細(xì)菌感染等疾病早期診斷實(shí)驗(yàn)室研究和臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域有極大應(yīng)用潛力。為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本實(shí)用新型采取如下技術(shù)方案：一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白(HNL)同源二聚體的定量裝置，其特征在于：由儲(chǔ)存5倍樣品稀釋液的容器、儲(chǔ)存25倍洗液的容器、儲(chǔ)存HNL同源二聚體標(biāo)準(zhǔn)品母液的容器、抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板、儲(chǔ)存酶標(biāo)抗HNL抗體溶液的容器、U型底96孔板、封板膜、儲(chǔ)存酶底物溶液的容器及儲(chǔ)存終止液的容器組成，所述抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板和酶標(biāo)抗HNL抗體所使用的抗HNL抗體完全相同；所述抗HNL抗體為單克隆抗體，所述抗HNL單克隆抗體為商品化的抗HNL單克隆抗體(如Abcam公司的ab63929或P&MVengeDiagnosticsDevelopment公司的HNLmab697等)或通過常規(guī)方法以HNL單體或HNL同源二聚體免疫動(dòng)物制備的抗HNL單克隆抗體或基因工程方法制備的抗HNL單克隆抗體，所述抗HNL單克隆抗體所識(shí)別的抗原表位在單體HNL上只有一個(gè)；所述酶標(biāo)抗HNL抗體所標(biāo)記的酶可以為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等。所述定量裝置經(jīng)兩步法實(shí)現(xiàn)HNL同源二聚體的快速定量，所述兩步法是指裝置整個(gè)使用過程中孵育過程只需兩次，所述兩次孵育過程第一次是指將酶標(biāo)抗HNL抗體加入到抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板后快速加入預(yù)先準(zhǔn)備的標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液和經(jīng)稀釋后的樣品液孵育20～60min，所述兩次孵育過程第二次是指第一次孵育后將抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板經(jīng)洗液工作液清洗后再加入酶底物溶液孵育10～20min后加入終止液；所述預(yù)先準(zhǔn)備的標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液是指HNL同源二聚體標(biāo)準(zhǔn)品母液經(jīng)2倍法稀釋后制成，所述經(jīng)稀釋后的樣品液是指經(jīng)樣品稀釋液工作液稀釋后的體液樣本，所述體液樣本包括尿液、血清、血漿、腦脊液、唾液等。將5倍樣品稀釋液用去離子水稀釋5倍獲得樣品稀釋液工作液；將25倍洗液用去離子水稀釋25倍制成洗液工作液。本實(shí)用新型裝置組成、制備及使用方法如下：1)本實(shí)用新型裝置組成表1為本實(shí)用新型裝置組成，圖1和圖2為本裝置各組成部分的示意圖。表1：本實(shí)用新型裝置組成序號(hào)名稱數(shù)量1抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板1塊25倍樣品稀釋液1瓶(80mL)3HNL同源二聚體標(biāo)準(zhǔn)品母液1管(300μL)4酶標(biāo)抗HNL抗體溶液1管(5.5mL)525倍洗液1瓶35mL6酶底物溶液1套7終止液1瓶12mL8常規(guī)U型底96孔板1塊9封板膜1張2)制備方法a)抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板的制備(1)抗HNL抗體包被96孔酶標(biāo)板將抗HNL抗體用50mmol/LNa2CO3-NaHCO3，pH9.6的碳酸鈉緩沖液稀釋到1～5μg/mL制成抗體包被液；向96孔酶標(biāo)板每孔加入100μL抗體包被液，37℃孵育2h或室溫孵育4h或4℃過夜。(2)封閉酶標(biāo)板棄抗體包被液，然后向上述96孔酶標(biāo)板每孔中加入200～300μL封閉液(封閉液為含2％BSA(wt/vol)的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3，pH9.6的碳酸鈉緩沖液)；37℃孵育2h或室溫孵育4h或4℃過夜。(3)固定酶標(biāo)板棄封閉液，然后向96孔酶標(biāo)板每孔中加入200～300μL固定液(固定液為含50％(wt/vol)蔗糖、50％(wt/vol)海藻糖或25％(wt/vol)蔗糖和25％(wt/vol)海藻糖的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3，pH9.6的碳酸鈉緩沖液，室溫固定30min～2h。(4)密封酶標(biāo)板棄固定液，室溫晾干或25～30℃真空干燥；將酶標(biāo)板和袋裝干燥劑放入錫箔紙袋內(nèi)然后抽真空，4℃保存；通過以上方法制備的抗HNL抗體包被酶標(biāo)板經(jīng)過37℃加速試驗(yàn)，可以保存32天。根據(jù)阿羅尼烏斯公式(Arrheniusequation)，本方法制備的酶標(biāo)板在4℃條件下可以保存天數(shù)＝32×48天＝1536天。b)5倍樣品稀釋液的制備為含有1％BSA(wt/vol)、0.5％Tween-20(vol/vol)、0.25％十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(wt/vol)和0.1％NaN3(wt/vol)的磷酸根摩爾濃度為50mmol/L、pH7.4的PBS緩沖液。c)標(biāo)準(zhǔn)品母液的制備為含有0.1％BSA(wt/vol)、0.1％Tween-20(vol/vol)、0.05％十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(wt/vol)、0.02％NaN3(wt/vol)和12.8μg/L同源二聚體HNL的磷酸根摩爾濃度為10mmol/L、pH7.4的PBS緩沖液。d)酶標(biāo)抗HNL抗體溶液的制備酶標(biāo)抗HNL抗體是通過常規(guī)的方法(Abcam的ab102850、ab102890、ab102887等)將辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(ALP)等酶分子共價(jià)標(biāo)記在抗HNL抗體上。酶標(biāo)抗HNL抗體溶液為含有1％BSA(wt/vol)、0.1％NaN3(wt/vol)和0.2～2μg/mL酶標(biāo)抗HNL抗體的磷酸根摩爾濃度為50mmol/L、pH7.4的PBS緩沖液。e)25倍洗液的制備為含有2.5％Tween-20(vol/vol)的磷酸根摩爾濃度為250mmol/L、pH7.4的PBS緩沖液。f)酶底物溶液和終止液的制備對(duì)應(yīng)酶標(biāo)抗HNL抗體所標(biāo)記的酶采用不同的酶底物溶液和終止液。該體系是已經(jīng)公開的常規(guī)方法。如表2。表2：不同體系酶標(biāo)抗體、酶底物溶液及對(duì)應(yīng)終止液的組成3)使用方法裝置的具體使用步驟如下：(1)取出上述制備的溶液、抗體包被的96孔酶標(biāo)板等，放置于室溫環(huán)境；(2)將5倍樣品稀釋液和25倍洗液用蒸餾水分別稀釋5倍和25倍，制成樣品稀釋液工作液和洗液工作液；(3)將生物樣品(血清、血漿、尿液、唾液或腦脊液等)用樣品稀釋液工作液稀釋(血清和血漿通常稀釋50倍、尿液通常稀釋25倍、唾液和腦脊液通常5～10倍稀釋)，得到稀釋后的樣品液；(4)將同源二聚體HNL標(biāo)準(zhǔn)品母液用樣品稀釋液工作液進(jìn)行2倍梯度稀釋，制成標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液；(5)將上述100μL標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液和稀釋后的樣品液加至U型底96孔板；(6)將50μL酶標(biāo)抗HNL抗體溶液加至抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板；(7)用多道移液器取50μL步驟(5)制備的U型底96孔板每孔中的標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液和稀釋后的樣品液加至步驟(6)中的96孔酶標(biāo)板上；(8)用封板膜蓋住96孔酶標(biāo)板，將96孔酶標(biāo)板放置于酶標(biāo)板震蕩器上，150～180rpm,室溫孵育20～60min；(9)傾倒96孔酶標(biāo)板中的物質(zhì)，用洗液工作液對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行3～5次清洗；(10)向96孔酶標(biāo)板每孔中加入酶底物溶液100μL，避光條件下孵育10～20min；(11)向96孔酶標(biāo)板每孔中加入終止液100μL，輕輕混勻，30min內(nèi)利用常規(guī)的分光光度計(jì)測(cè)定450nm處的吸光值。(12)以標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液的濃度值為橫縱標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液450nm處的吸光值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品液的450nm處的吸光值計(jì)算出樣品中同源二聚體HNL的濃度。本實(shí)用新型根據(jù)夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)技術(shù)具有高通量、特異性強(qiáng)及普及率高等優(yōu)點(diǎn)，制造了一種基于ELISA的人中性粒細(xì)胞載脂蛋白同源二聚體(HNL)的快速定量裝置。由于采用了上述技術(shù)方案，本實(shí)用新型在以下兩方面與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。第一，本實(shí)用新型根據(jù)HNL同源二聚體是由兩個(gè)相同的單體HNL形成的特點(diǎn)，與單體HNL相比，HNL同源二聚體有兩套相同的抗原表位，每個(gè)HNL同源二聚體可以和兩個(gè)完全相同的抗體結(jié)合，而一個(gè)單體HNL只能和一個(gè)同樣抗體結(jié)合；另外，HNL異二聚體是一個(gè)HNL分子與MMP9分子共價(jià)結(jié)合，因此一個(gè)HNL異二聚體也只有一個(gè)相同的抗原表位只能與一個(gè)分子的同樣抗體結(jié)合。所以本實(shí)用新型采用相同的固相包被抗體和酶標(biāo)抗體構(gòu)建HNLELISA檢測(cè)裝置，該裝置特異性檢測(cè)出HNL同源二聚體，而對(duì)于HNL單體和異二聚體則不檢出(圖3)。本實(shí)用新型可用于以HNL同源二聚體為標(biāo)志物的疾病(如急性細(xì)菌感染)的檢測(cè)和監(jiān)控，因此具有巨大的實(shí)驗(yàn)室研究和臨床應(yīng)用價(jià)值。第二，考慮到常規(guī)ELISA操作步驟繁多，測(cè)試周期較長(zhǎng)，而臨床實(shí)際應(yīng)用時(shí)需要快速獲得目標(biāo)分子的濃度信息，因此本實(shí)用新型通過對(duì)固相抗體包被濃度、反應(yīng)試劑配方、酶標(biāo)抗體濃度、孵育時(shí)間等多種因素進(jìn)行優(yōu)化，從而建立了兩步法檢測(cè)HNL同源二聚體的夾心ELISA方法，整個(gè)使用過程中孵育只需兩步和清洗只需一步。從而使用本裝置具有制備簡(jiǎn)單、使用快捷等優(yōu)點(diǎn)，本裝置使用只需常規(guī)ELISA測(cè)試時(shí)間的1/4至1/3。這是本實(shí)用新型的另一個(gè)具創(chuàng)造性發(fā)明。附圖說明圖1：為本實(shí)用新型一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白(HNL)同源二聚體的定量裝置的抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板、常規(guī)U型底96孔板和封板膜示意圖。20代表抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板，由21(96孔板支架)和22(包被抗HNL抗體的孔)組成，一共12列，每列8孔，孔為平底，是夾心ELISA反應(yīng)的場(chǎng)所；30代表常規(guī)U型底96孔板，其中31為96孔板支架，32為U型孔，一共12列，每列8孔，孔為U型底，用于標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液和稀釋后的樣品液的準(zhǔn)備；40為封板膜，具有粘性，可與粘貼在20表面，用于防止20孵育時(shí)里邊液體的蒸發(fā)。圖2為本實(shí)用新型一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白(HNL)同源二聚體的定量裝置所需的各種溶液儲(chǔ)存溶液示意圖。51代表儲(chǔ)存5倍樣品稀釋液的容器，為透明的塑料瓶；52代表儲(chǔ)存25倍洗液的容器，為透明的塑料瓶；53代表儲(chǔ)存酶標(biāo)抗HNL抗體溶液的容器，為透明的塑料瓶；54代表儲(chǔ)存HNL同源二聚體標(biāo)準(zhǔn)品母液的容器，為透明的塑料瓶；55和56代表儲(chǔ)存酶底物溶液的容器，為不透明的塑料瓶，55和56容器的個(gè)數(shù)根據(jù)表2酶底物溶液的組成確定；57為儲(chǔ)存終止液的容器，為透明的塑料瓶。圖3為本實(shí)用新型一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白(HNL)同源二聚體的定量裝置能特異性快速定量HNL的原理圖。其中24代表用于抗體包被的96孔酶標(biāo)板的一個(gè)孔，25代表用于包被96孔酶標(biāo)板的抗HNL抗體，26代表酶標(biāo)抗HNL抗體，27代表HNL同源二聚體，28代表HNL單體，29代表HNL與MMP-9形成的異源二聚體；25和26所述的抗HNL抗體為同一抗體，且在HNL單體上只有一個(gè)對(duì)應(yīng)的表位；HNL單體28、HNL同源二聚體27和異源二聚體29都能與包被在24上的抗HNL抗體25結(jié)合，但由于28和29只有一個(gè)可與25特異性結(jié)合的表位，因此不能與26結(jié)合，而HNL同源二聚體27因?yàn)榫哂袃蓚€(gè)相同的表位，因此除了一個(gè)與25結(jié)合外，還可以與抗HNL酶標(biāo)抗體26特異性結(jié)合，從而26利用其上所標(biāo)記的酶催化酶底物溶液產(chǎn)生有色產(chǎn)物，進(jìn)而利用分光光度計(jì)獲取特定波長(zhǎng)下產(chǎn)物的吸光度值。圖4為本實(shí)用新型一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白(HNL)同源二聚體的定量裝置的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式下面將用實(shí)施例進(jìn)一步說明本實(shí)用新型。本實(shí)用新型實(shí)施例是用于本實(shí)用新型的進(jìn)一步解釋而不是對(duì)本實(shí)用新型的限定。根據(jù)本實(shí)用新型的構(gòu)思和實(shí)質(zhì)進(jìn)行的具體變動(dòng)和潤(rùn)飾均屬于本實(shí)用新型要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1：一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白同源二聚體的定量裝置的組成本實(shí)施例裝置包含如下試劑和材料(見表3)。表3：實(shí)施例1裝置的組成序號(hào)名稱數(shù)量1抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板1塊(96孔)25倍樣品稀釋液1瓶(80mL)3HNL同源二聚體標(biāo)準(zhǔn)品母液1管(300μL)4酶標(biāo)抗HNL抗體(HRP-抗HNL抗體)1管(5.5mL)525倍洗液1瓶35mL6-ATMB底物溶液A1瓶(6mL)6-BTMB底物溶液B1瓶(6mL)72mol/LH2SO4終止液1瓶(12mL)8常規(guī)U型底96孔板1塊(96孔)9封板膜1張10使用說明書1本實(shí)施例2：一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白同源二聚體的定量裝置的組成本實(shí)施例裝置包含如下試劑和材料(見表4)。表4：實(shí)施例2裝置的組成序號(hào)名稱數(shù)量1抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板1塊(96孔)25倍樣品稀釋液1瓶(80mL)3HNL同源二聚體標(biāo)準(zhǔn)品母液1管(300μL)4酶標(biāo)抗HNL抗體(ALP-抗HNL抗體)1管(5.5mL)525倍洗液1瓶(35mL)6-A堿性磷酸酶緩沖溶液1瓶(15mL)6-BNBT溶液1管(200μL)6-CBCIP溶液1管(100μL)73mol/LNaOH1瓶12mL8常規(guī)U型底96孔板1塊(96孔)9封板膜1張10使用說明書1本實(shí)施例3一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白同源二聚體的定量裝置的抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板的制備以實(shí)施例1所包含的抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板為例來說明抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板的制備步驟。具體步驟如下：(1)抗HNL抗體包被96孔酶標(biāo)板將抗HNL單克隆抗體(Abcam公司的ab23477)用50mmol/LNa2CO3-NaHCO3，pH9.6的碳酸鈉緩沖液稀釋到1μg/mL制成抗體包被液；向96孔酶標(biāo)板(Nuncflat-bottom96wellplate)每孔加100μL抗體包被液；4℃過夜。(2)封閉酶標(biāo)板棄抗體包被液；向96孔酶標(biāo)板每孔加300μL封閉液(封閉液為含2％BSA(wt/vol)的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3，pH9.6的碳酸鈉緩沖液)；37℃孵育2h。(3)固定酶標(biāo)板棄固定液；向96孔酶標(biāo)板每孔加300μL固定液(固定液為含50％(wt/vol)的蔗糖的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3,pH＝9.6的碳酸鈉緩沖液；室溫固定1h；(4)密封酶標(biāo)板棄固定液液，25℃真空干燥；將酶標(biāo)板和袋裝干燥劑放入錫箔是袋內(nèi)然后抽真空，4℃保存。實(shí)施例4：一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白同源二聚體的定量裝置的酶標(biāo)抗HNL抗體的制備本實(shí)施例以實(shí)施例1所包含的HRP-抗HNL抗體為例來說明酶標(biāo)抗HNL抗體的制備步驟。本實(shí)施例采用過碘酸鈉法將HRP與抗HNL單克隆抗體(Abcam公司的ab23477)共價(jià)連接制成酶標(biāo)抗HNL抗體。具體步驟如下：(1)配制各種緩沖液a.0.1mol/L高碘酸鈉(NaIO4)溶液:稱取241mgNaIO4溶于10mL蒸餾水中。b.1mmol/L、pH＝4.4的醋酸鈉(NaAc)緩沖液:取0.2mol/LNaAc(1.361克/50mL)3.7mL、0.2mol/L醋酸(HAc)溶液(0.601mL/50mL)6.3mL，加蒸餾水至2000mL。c.0.2mol/L、pH9.5碳酸鹽緩沖液：Na2CO30.32克、NaHCO30.586克，加蒸餾水至50mL。d.0.01mol/L、pH9.5碳酸鹽緩沖液：0.2mol/L、pH9.5碳酸鹽緩沖液用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01mol/L、pH9.5碳酸鹽緩沖液。e.4mg/mL硼氫化鈉(NaBH4)溶液：使用時(shí)稱取NaBH44mg溶于1mL蒸餾水中。f.0.1mol/L、pH7.4的PBS緩沖液：NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO4.12H2O3.58g、KH2PO40.24g、蒸餾水溶解定容至100毫升。g.酶標(biāo)抗體保存緩沖液：將0.1mol/L、pH7.4的PBS緩沖液用蒸餾水稀釋10倍得到0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液，加入0.2％BSA(wt/vol)、0.1％Tween-20(vol/vol)及0.02％NaN3(wt/vol)。(2)酶標(biāo)抗體制備a.稱取5mgHRP(Sigma公司，V900503)溶解于1mL蒸餾水中。b.加入0.2mL新配的0.1mol/LNaIO4溶液，室溫下避光攪拌20min。c.將上述溶液裝入透析袋中，用1mmol/L、pH＝4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜。d.加20μl的0.2mol/L、pH＝9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.5，立即加入1mL、5mg/mL抗HNL單克隆抗體(Abcam公司的ab23477)0.01M碳酸鹽緩沖液中,室溫避光輕輕攪拌2h。e.加0.1mL新配的4mg/mLNaBH4液，混勻，再置4℃、2h。f.將上述溶液液裝入透析袋中，用0.1mol/L的PBS溶液透析，4℃、過夜。g.將透析袋里的抗體稀釋在含酶標(biāo)抗體保存緩沖液。h.計(jì)算酶標(biāo)抗體濃度：HRP-抗HNL抗體量(mg/mL)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62。i.將HRP-抗HNL抗體配制成1mg/mL,分裝保存在-20～-80℃環(huán)境；使用時(shí)將HRP-抗HNL抗體用樣品稀釋液稀釋至0.5μg/mL。實(shí)施例5：一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白同源二聚體的定量裝置的使用現(xiàn)以實(shí)施例1裝置的使用為例說明本裝置的具體使用步驟。(1)取出上述制備的溶液、抗體包被的96孔酶標(biāo)板等，放置于室溫環(huán)境平衡；(2)將5倍樣品稀釋液和25倍洗液用蒸餾水分別稀釋5倍和25倍，制成樣品稀釋液工作液和洗液工作液。(3)將生物樣品如尿液用樣品稀釋液工作液稀釋25倍，得到稀釋后的樣品液。(4)將同源二聚體HNL標(biāo)準(zhǔn)品母液用樣品稀釋液工作液進(jìn)行2倍法梯度稀釋，制成標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液。(5)將上述梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液和稀釋后的樣品液各100μL至U型底96孔板。(6)將50μLHRP-抗HNL抗體加至96孔酶標(biāo)板。(7)用多道移液器取50μL步驟(5)制備的U型底96孔板中的標(biāo)準(zhǔn)品梯度、相應(yīng)對(duì)照溶液及樣品至步驟(6)中的96孔酶標(biāo)板上。(8)用封板膜蓋住96孔酶標(biāo)板，將酶標(biāo)板放置于酶標(biāo)板震蕩器上，180rpm,室溫孵育30min。(9)傾倒酶標(biāo)板中的物質(zhì)，用洗液工作液對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行3次清洗，最后一次清洗后將酶標(biāo)板倒扣在吸水濾紙上10s。(10)在清洗結(jié)束前，將TMB底物溶液A和TMB底物溶液B分別通過顛倒試劑瓶混勻，取等體積溶液A和溶液B混勻制成TMB底物工作液。(11)加入100μLTMB底物工作液至96孔酶標(biāo)板，蓋上封板膜和錫箔紙，孵育15min；(12)加入100μL、2mol/LH2SO4的終止液，輕輕混勻30S，30min內(nèi)利用常規(guī)的分光光度計(jì)以540nm波長(zhǎng)為參考、讀取450nm波長(zhǎng)下的吸光值。(13)以濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線趨勢(shì)線公式計(jì)算樣品中HNL濃度。表5為實(shí)施例5裝置測(cè)得的各濃度同源二聚體HNL標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的450nm波長(zhǎng)下的吸光度值，根據(jù)表5繪制參考標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖4所示)表5：不同濃度同源二聚體HNL標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液對(duì)應(yīng)的450nm波長(zhǎng)處的吸光度值同源二聚體HNL濃度(ng/mL)O.D.1O.D.2平均值00.0120.0090.01050.100.0380.0410.03950.200.0690.0690.0690.400.140.1320.1360.800.3180.3240.3211.600.6210.6030.6123.201.2651.2341.24956.402.3532.4012.377由表5可以得出本裝置定量同源二聚體的濃度可低至0.1ng/mL，結(jié)合圖4可以得出本裝置定量同源二聚體的線性范圍為0.1ng.mL～6.4ng/mL。本實(shí)施例裝置的批內(nèi)差異CV平均值為4.31％(范圍0.54％～7.40％,n＝12)，批間差異CV平均值為7.96％(范圍為1.69％～12.50％,n＝3)。通過向已知同源二聚體濃度(C0)的尿液中加入已知濃度(C1)的同源二聚體HNL、單體HNL及MMP9/HNL,利用本實(shí)施例獲得尿溶液中的同源二聚體HNL的測(cè)定值濃度(C2)；理論值濃度為C3。根據(jù)公式(1)回收率1(％)＝C3÷C2×100％和公式(2)回收率2(％)＝(C2-C0)÷C1×100％計(jì)算得到以上分子在尿樣中的回收率(表6)。表6：HNL同源二聚體、HNL單體及MMP9/HNL在尿液中的回收率表6數(shù)據(jù)顯示本裝置能特異性定量尿液樣本中的HN同源二聚體L，而對(duì)HNL單體和HNL異源二聚體則幾乎不檢出。由此可以得出本方法具有很高的特異性和靈敏度。當(dāng)前第1頁1 2 3