本實(shí)用新型屬于免疫技術(shù)及衛(wèi)生檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于納米光纖生物傳感器檢測(cè)有毒物質(zhì)的裝置。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展越來(lái)越迅速，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。眾所周知，飼料是養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，在養(yǎng)殖生產(chǎn)成本中所占比例較大，確保飼料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和具有有毒有害物質(zhì)的檢測(cè)方法是保證養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。在養(yǎng)殖業(yè)繁榮發(fā)展的背后，我們發(fā)現(xiàn)市場(chǎng)上的動(dòng)物源性產(chǎn)品存在的安全隱患越來(lái)越多，對(duì)社會(huì)造成了很大的負(fù)面影響。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的主要原因是養(yǎng)殖業(yè)所使用的飼料中有毒有害物質(zhì)嚴(yán)重超標(biāo)，這種存在于飼料中的有毒有害物質(zhì)被飼養(yǎng)動(dòng)物食用后，可能在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為毒性更大的物質(zhì)并且被蓄積，通過(guò)食物鏈到達(dá)人體體內(nèi)后，對(duì)人體的健康造成了極大的危害。通過(guò)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，飼料中最常見(jiàn)、危害最大的有毒有害物質(zhì)有三聚氰胺、伏馬毒素B₁、T-2毒素、黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素及玉米赤霉烯酮，其中，三聚氰胺在體內(nèi)可形成較大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，造成結(jié)石；赭曲霉素A對(duì)人體有強(qiáng)烈的腎臟毒性、肝臟毒性、致癌性和致畸性等；T-2毒素能抑制人體重要器官蛋白質(zhì)和DNA的合成；玉米赤霉烯酮對(duì)人體具有生殖發(fā)育毒性，免疫毒性和致癌性等；伏馬毒素B₁對(duì)肝、腎、肺及神經(jīng)系統(tǒng)具有較大毒性；黃曲霉毒素B₁對(duì)人體的肝臟具有破壞作用，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肝癌甚至死亡；嘔吐毒素對(duì)人體具有致畸性，神經(jīng)毒素和胚胎毒性等；上述7種有毒物質(zhì)在糧谷、飼料中的含量很低時(shí)就會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒性。

量子點(diǎn)是多電子體系，發(fā)光效率遠(yuǎn)高于單個(gè)分子，可以經(jīng)受多次激發(fā)，且標(biāo)記后對(duì)生物大分子的生理活性影響很小，因此為研究生物大分子之間的長(zhǎng)期作用提供了可能。量子點(diǎn)可以經(jīng)受反復(fù)多次激發(fā)，而不像有機(jī)熒光分子那樣容易發(fā)生熒光漂白或熒光碎滅。因此結(jié)合量子點(diǎn)研究上述物質(zhì)的檢測(cè)方法對(duì)于提高動(dòng)物源性食品質(zhì)量，改善人類健康，促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

本專利采用的是不同粒徑的量子點(diǎn)對(duì)糧谷和飼料中的7種有毒有害物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，這七種量子點(diǎn)在370nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，會(huì)在不同的發(fā)射波長(zhǎng)下呈現(xiàn)不同顏色的熒光，從而可以避免待檢測(cè)物的相互干擾。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本實(shí)用新型的目的是提供一種基于納米光纖生物傳感器檢測(cè)有毒物質(zhì)的裝置。

一種基于納米光纖生物傳感器檢測(cè)有毒物質(zhì)的裝置，它包括：臺(tái)架1、多個(gè)激發(fā)光源2、多微孔板3、熒光檢測(cè)裝置4和熒光光譜儀5；所述的多微孔板3上設(shè)有微孔31，微孔31為錐形圓柱凹槽，呈圓周排列在八微孔板3上；所述的臺(tái)架1包括底板14、載物臺(tái)13、可調(diào)支架12、光源固定板11；所述的載物臺(tái)13、設(shè)置在底板14上方，可調(diào)支架12固定在載物臺(tái)13上，光源固定板11設(shè)置載物臺(tái)在上方，固定在可調(diào)支架12上；激發(fā)光源2固定在光源固定板11；所述的熒光檢測(cè)裝置4固定在載物臺(tái)13上；所述的熒光檢測(cè)裝置4包括熒光檢測(cè)探頭41、凸透鏡42、錐孔；熒光檢測(cè)裝置4上部設(shè)有與微孔31外形相對(duì)應(yīng)的錐孔，下部設(shè)有熒光檢測(cè)探頭41；

所述的錐孔下部、熒光檢測(cè)探頭41上部設(shè)有凸透鏡42；

所述的激發(fā)光源2、微孔板3的微孔31、熒光檢測(cè)裝置4均為8個(gè)；

所述的微孔31為錐形圓柱凹槽，上底面直徑為6.8mm，下底面直徑為6.21mm，高11.7mm。

本實(shí)用新型提供了一種基于納米光纖生物傳感器檢測(cè)有毒物質(zhì)的裝置，它包括：臺(tái)架1、多個(gè)激發(fā)光源2、多微孔板3、熒光檢測(cè)裝置4和熒光光譜儀5；所述的多微孔板3上設(shè)有微孔31，微孔31為錐形圓柱凹槽，呈圓周排列在八微孔板3上；所述的臺(tái)架1包括底板14、載物臺(tái)13、可調(diào)支架12、光源固定板11；所述的載物臺(tái)13、設(shè)置在底板14上方，可調(diào)支架12固定在載物臺(tái)13上，光源固定板11設(shè)置載物臺(tái)在上方，固定在可調(diào)支架12上；激發(fā)光源2固定在光源固定板11；所述的熒光檢測(cè)裝置4固定在載物臺(tái)13上；所述的熒光檢測(cè)裝置4包括熒光檢測(cè)探頭41、凸透鏡42、錐孔；熒光檢測(cè)裝置4上部設(shè)有與微孔31外形相對(duì)應(yīng)的錐孔，下部設(shè)有熒光檢測(cè)探頭41；通過(guò)熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀，可以同時(shí)檢測(cè)七種有毒物質(zhì)，操作過(guò)程簡(jiǎn)便，且各檢測(cè)物彼此并不干擾，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度好。

附圖說(shuō)明

圖1為本實(shí)用新型一種基于納米光纖生物傳感器檢測(cè)有毒物質(zhì)的裝置整體結(jié)構(gòu)立體圖；

圖2為本本實(shí)用新型一種基于納米光纖生物傳感器檢測(cè)有毒物質(zhì)的裝置整體結(jié)構(gòu)立體圖；

圖3為本實(shí)用新型一種基于納米光纖生物傳感器檢測(cè)有毒物質(zhì)的裝置原理圖；

圖4為本實(shí)用新型一種基于納米光纖生物傳感器檢測(cè)有毒物質(zhì)的裝置局部結(jié)構(gòu)圖；

圖5為本實(shí)用新型一種基于納米光纖生物傳感器檢測(cè)有毒物質(zhì)的裝置檢測(cè)檢測(cè)傳感器剖面圖；

圖6為本實(shí)用新型一種基于納米光纖生物傳感器檢測(cè)有毒物質(zhì)的裝置檢測(cè)檢測(cè)八孔板立體圖；

圖7本實(shí)用新型一種基于納米光纖生物傳感器檢測(cè)有毒物質(zhì)的裝置檢測(cè)檢測(cè)八孔板剖面圖；

圖8 三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖9伏馬毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖10 T-2毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖11黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖12赭曲霉毒素A的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖13嘔吐毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖14玉米赤霉烯酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀

請(qǐng)參見(jiàn)圖1-7；一種基于納米光纖生物傳感器檢測(cè)有毒物質(zhì)的裝置，包括：臺(tái)架1、激發(fā)光源2、八孔板3、熒光檢測(cè)裝置4；

其中所述的八孔板3上設(shè)有微孔31，微孔31為錐形圓柱凹槽，呈圓周排列在八孔板3上；

所述的臺(tái)架1包括底板14、載物臺(tái)13、可調(diào)支架12、光源固定板11；

所述的載物臺(tái)13、設(shè)置在底板14上方，可調(diào)支架12固定在載物臺(tái)13上，光源固定板11設(shè)置載物臺(tái)在上方，固定在可調(diào)支架12上；

所輸?shù)目烧{(diào)支架12可以調(diào)節(jié)載物臺(tái)13與光源固定板11之間的高度；

所述的載物臺(tái)13、光源固定板11上均設(shè)有與八孔板3位置相對(duì)應(yīng)的通孔；

所述的激發(fā)光源2固定在光源固定板11的通孔上；

所述的熒光檢測(cè)裝置4固定在載物臺(tái)13上的通孔內(nèi)；

所述的熒光檢測(cè)裝置4包括熒光檢測(cè)探頭41、凸透鏡42、錐孔；

熒光檢測(cè)裝置4上部設(shè)有與微孔31外形相對(duì)應(yīng)的錐孔，錐孔下部設(shè)有凸透鏡42，凸透鏡42下部設(shè)有熒光檢測(cè)探頭41；

所述的熒光檢測(cè)探頭41設(shè)置在凸透鏡42焦點(diǎn)處；

熒光檢測(cè)探頭41的輸出光纖與熒光光譜儀5連接，熒光光譜儀5與電腦6連接；

所述的微孔31為錐形圓柱凹槽，上底面直徑為6.8mm，下底面直徑為6.21mm，高11.7mm。

使用時(shí)，將待測(cè)液體注入八孔板3的微孔31中，液面低于微孔31，調(diào)節(jié)可調(diào)支架12，升高激發(fā)光源2，將八孔板3放在熒光檢測(cè)裝置4上，使微孔31完全進(jìn)入錐孔內(nèi)，節(jié)可調(diào)支架12，降低激發(fā)光源2，使激發(fā)光源2的探頭位于待測(cè)液體上表面；打開激發(fā)光源2，待測(cè)液體發(fā)出的熒光經(jīng)熒光檢測(cè)探頭42傳遞至熒光光譜儀5，最后輸送至電腦6。

實(shí)施例2 量子點(diǎn)和抗體的偶聯(lián)

1）量子點(diǎn)選擇：ZnSe/ZnS（粒徑 4nm，紫色）、CdS/ZnS（粒徑 8nm，藍(lán)色）、CdSe/ZnS（粒徑 10nm，青色）、CdSe/ZnS（粒徑 12nm，綠色）、CdSe/ZnS（粒徑 5nm，黃色）CdSe/ZnS（粒徑 6nm，橙色）、CdSe/ZnS（粒徑 7nm，紅色）（蘇州星爍納米科技有限公司提供）

2）量子點(diǎn)的活化：

取1mLPBS緩沖溶液，加入量子點(diǎn)ZnSe/ZnS 100μL，加入EDC20μL，加入NHS20μL，渦旋，放于避光處活化30min；

3）量子點(diǎn)與BSA全抗原的偶聯(lián):

加入20μLBSA全抗原，30℃，10rpm搖床避光偶聯(lián)2h；

4）封閉：

加入50μL10%BSA封閉30min；

5）終洗：

15000rpm 離心30min，收集沉淀，向沉淀中加入500μL PBS緩沖溶液后重懸回收，4℃避光備用。

實(shí)施例3基底的包被與檢測(cè)

1)八孔板處理:

在紫外燈下，用254nm波長(zhǎng)的紫外光照射八孔板1h；

2)包被:

三聚氰胺單抗包被于八孔板的微孔中，用0.01 M，pH7.4 PBS 緩沖液將三聚氰胺單抗稀釋為10μg/mL，每孔加入200μL，4°C包被過(guò)夜；

3) 純化:

由于量子點(diǎn)-BSA全抗原的粒徑要比游離的量子點(diǎn)大很多，所以截留分子質(zhì)量為100000的超濾膜可以使游離的量子點(diǎn)通過(guò)，而截留下ZnSe/ZnS -三聚氰胺-BSA全抗原的量子點(diǎn)，加入100μL PBS緩沖溶液后重懸回收，4℃避光備用；

4)封閉：

加入200 μL 5%BSA封閉微孔中未被包被的位點(diǎn)，防止非特異性吸附，37°C孵育2h后取出；PBS洗滌除去多余的BSA溶液，洗滌3次，每次3分鐘，甩干，4℃保存。

實(shí)施例4 應(yīng)用熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)三聚氰胺

1)應(yīng)用熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)三聚氰胺的方法

加入100μL待測(cè)液到采用實(shí)施例3中的方法制備的三聚氰胺單抗基底上，37°C下孵育2h，每孔加入200μL由實(shí)施例2提供的方法制備的濃度為200ng/mL的ZnSe/ZnS-三聚氰胺-BSA全抗原偶聯(lián)量子點(diǎn)，經(jīng)PBS洗滌離心3次，去除未與基底結(jié)合的量子點(diǎn)-三聚氰胺-BSA全抗原后每個(gè)微孔中加入0.01M，pH7.4的PBS緩沖液200μL，在370nm激發(fā)波長(zhǎng)下用熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)405nm時(shí)的發(fā)射峰強(qiáng)度。

2）檢測(cè)靈敏度的確定

采用上述檢測(cè)方法，分別在基底中加入濃度為0μg/L、0.1μg/L、0.2μg/L、0.3μg/L、0.4μg/L、0.5μg/L、0.6μg/L的三聚氰胺溶液及空白溶液，在370nm激發(fā)波長(zhǎng)下用熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)405nm時(shí)的發(fā)射峰強(qiáng)度。測(cè)試結(jié)果如圖8所示，檢出限為0.1μg/L。

3）特異性試驗(yàn)

根據(jù)實(shí)施例2和實(shí)施例3制備好ZnSe/ZnS -三聚氰胺-BSA全抗原和三聚氰胺單抗基底，將三聚氰胺、伏馬毒素B₁、T-2毒素、黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮分別配成系列濃度采用上述的檢測(cè)方法進(jìn)行特異性交叉試驗(yàn)，同時(shí)空白對(duì)照。計(jì)算各競(jìng)爭(zhēng)物的 IC50。計(jì)算公式為：交叉反應(yīng)率 (％)＝[IC50(三聚氰胺)/IC50(待測(cè)藥物 )]×100。

測(cè)定及計(jì)算結(jié)果如表 1 所示，結(jié)果表明該方法異性較強(qiáng)，只對(duì)三聚氰胺發(fā)生反應(yīng)，而對(duì)其他毒性化合物沒(méi)有交叉反應(yīng)。

4）待測(cè)液的制備

用粉碎機(jī)粉碎待測(cè)谷物，粒度小于2mm。稱取5g試樣(精確到0.01 g)加入不同濃度的三聚氰胺水平的標(biāo)準(zhǔn)品，置于具塞塑料離心管中，加人PBS溶液25 mL，超聲振蕩15 min后4000 r/min離心10 min。取上層17. 5 mL PBS溶液于干凈的容器，通過(guò)微纖維濾紙過(guò)濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液A)。向下層固體樣品中加人17. 5 mL甲醇，超聲振蕩15 min后4 000 r/min離心10 min，取上層溶液10 mL，用90 mL PBS溶液稀釋后通過(guò)微纖維濾紙過(guò)濾，將濾液收集于干凈的容器（提取液B）。

將免疫親和柱連接于10mL玻璃針筒下，準(zhǔn)確移取50mL提取液B過(guò)免疫親和柱，以每秒1～2滴的流速全部通過(guò)親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱；將20mLPBS溶液以每秒1～2滴的流速通過(guò)親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱；準(zhǔn)確移取5mLA以每秒1～2滴的流速全部通過(guò)親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱；將20mL超純水以每秒1～2滴的流速淋洗柱子，直至空氣流經(jīng)親和柱；棄去全部流出液。將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將洗脫液收集于玻璃試管中，當(dāng)甲醇大部分過(guò)柱后，不要完全過(guò)柱，停止加壓，靜止5min，再將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將全部洗脫液收集于同一玻璃試管中，待測(cè)。

5）準(zhǔn)確度和精密度的檢測(cè)

以重復(fù)測(cè)定某一濃度樣品的檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)（CV%）作為精密度評(píng)價(jià)指標(biāo)。以回收率作為準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)指標(biāo)。變異系數(shù) CV% 計(jì)算公式為：CV% =SD/ X ×100% ；其中 SD 為標(biāo)準(zhǔn)偏差，X 為測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值。回收率計(jì)算公式為：回收率（%）= 實(shí)際測(cè)定值/理論值×100%。其中理論值為模擬樣品的添加濃度。

采用上述待測(cè)液的制備方法，對(duì)玉米樣品進(jìn)行三聚氰胺陽(yáng)性添加，三聚氰胺分別添加0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.5μg/kg三個(gè)濃度水平的樣品，每個(gè)添加水平做4個(gè)平行，選取PBSS作為空白對(duì)照1，再選取未添加的玉米樣品做空白對(duì)照2，利用實(shí)施例1中的熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀，參照實(shí)施例4中1）的試驗(yàn)步驟進(jìn)行添加回收測(cè)定。樣品的平均回收率及精密度結(jié)果見(jiàn)表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：平均回收率在90.6～91.5之間。變異系數(shù)均小于11%，說(shuō)明方法精密度和準(zhǔn)確度好，檢測(cè)效果好。

實(shí)施例5應(yīng)用熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)伏馬毒素B₁

1)應(yīng)用熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)伏馬毒素B1的方法

加入100μL待測(cè)液到采用實(shí)施例3中的方法制備的伏馬毒素B1單抗基底上，37°C下孵育2h，每孔加入200μL由實(shí)施例2提供的方法制備的濃度為200ng/mL的ZnSe/ZnS-伏馬毒素B1-BSA全抗原偶聯(lián)量子點(diǎn)，經(jīng)PBS洗滌離心3次，去除未與基底結(jié)合的量子點(diǎn)-伏馬毒素B1-BSA全抗原后，每個(gè)微孔中加入0.01M，pH7.4的PBS緩沖液200μL，在370nm激發(fā)波長(zhǎng)下用熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)450nm時(shí)的發(fā)射峰強(qiáng)度。

2）檢測(cè)靈敏度的確定

采用上述檢測(cè)方法，分別在基底中加入濃度為0μg/L、0.25μg/L、0.3μg/L、0.35μg/L、0.4μg/L、0.45μg/L、0.5μg/L的伏馬毒素B1溶液及空白溶液，在370nm激發(fā)波長(zhǎng)下用熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)450nm時(shí)的發(fā)射峰強(qiáng)度。測(cè)試結(jié)果如圖9所示，檢出限為0.25μg/L。

3）交叉反應(yīng)試驗(yàn)

根據(jù)實(shí)施例2和實(shí)施例3制備好CdS/ZnS-伏馬毒素B₁-BSA全抗原和伏馬毒素B₁單抗基底，將三聚氰胺、伏馬毒素B₁、T-2毒素、黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮分別配成系列濃度采用上述的檢測(cè)方法進(jìn)行特異性交叉試驗(yàn)，同時(shí)空白對(duì)照。計(jì)算各競(jìng)爭(zhēng)物的 IC50。計(jì)算公式為：交叉反應(yīng)率 (％) ＝ [IC50(伏馬毒素B1)/IC50(待測(cè)藥物 )]×100。

測(cè)定及計(jì)算結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明該方法異性較強(qiáng)，只對(duì)伏馬毒素B₁發(fā)生反應(yīng)，而對(duì)其他毒性化合物沒(méi)有交叉反應(yīng)。

4）待測(cè)液的制備

用粉碎機(jī)粉碎待測(cè)谷物，粒度小于2mm。稱取5g試樣(精確到0.01 g)加入不同濃度的伏馬毒B₁水平的標(biāo)準(zhǔn)品，置于具塞塑料離心管中，加人PBS溶液25 mL，超聲振蕩15 min后4000 r/min離心10 min。取上層17. 5 mL PBS溶液于干凈的容器，通過(guò)微纖維濾紙過(guò)濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液A)。向下層固體樣品中加人17. 5 mL甲醇，超聲振蕩15 min后4 000 r/min離心10 min，取上層溶液10 mL，用90 mL PBS溶液稀釋后通過(guò)微纖維濾紙過(guò)濾，將濾液收集于干凈的容器（提取液B）。

將免疫親和柱連接于I0mL玻璃針筒下，準(zhǔn)確移取50mL提取液B過(guò)免疫親和柱，以每秒1～2滴的流速全部通過(guò)親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱；將20mLPBS溶液以每秒1～2滴的流速通過(guò)親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱；準(zhǔn)確移取5mLA以每秒1～2滴的流速全部通過(guò)親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱；將20mL超純水以每秒1～2滴的流速淋洗柱子，直至空氣流經(jīng)親和柱；棄去全部流出液。將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將洗脫液收集于玻璃試管中，當(dāng)甲醇大部分過(guò)柱后，不要完全過(guò)柱，停止加壓，靜止5min，再將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將全部洗脫液收集于同一玻璃試管中，待測(cè)。

5）準(zhǔn)確度和精密度的檢測(cè)

以重復(fù)測(cè)定某一濃度樣品的檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)（CV%）作為精密度評(píng)價(jià)指標(biāo)。以回收率作為準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)指標(biāo)。變異系數(shù) CV% 計(jì)算公式為：CV% =SD/ X ×100% ；其中 SD 為標(biāo)準(zhǔn)偏差，X 為測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值?；厥章视?jì)算公式為：回收率（%）= 實(shí)際測(cè)定值/理論值×100%。其中理論值為模擬樣品的添加濃度。

采用上述待測(cè)液的制備方法，對(duì)玉米樣品進(jìn)行伏馬毒素B1陽(yáng)性添加，伏馬毒素B1分別添加0.25μg/kg、0.35μg/kg、0.45μg/kg三個(gè)濃度水平的樣品，每個(gè)添加水平做4個(gè)平行，選取PBS作為空白對(duì)照1，再選取未添加的玉米樣品做空白對(duì)照2，利用實(shí)施例1中的熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀，參照實(shí)施例5中1）的試驗(yàn)步驟進(jìn)行添加回收測(cè)定。樣品的平均回收率及精密度結(jié)果見(jiàn)表4。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：平均回收率在87.7～90.5之間。變異系數(shù)均小于11%，說(shuō)明方法精密度和準(zhǔn)確度好，檢測(cè)效果好。

實(shí)施例6應(yīng)用熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)T-2毒素

1)應(yīng)用熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)T-2毒素的方法

加入100μL待測(cè)液到采用實(shí)施例3中的方法制備的T-2毒素單抗基底上，37°C下孵育2h，每孔加入加入200μL濃度為200ng/mL的ZnSe/ZnS-T-2毒素-BSA全抗原偶聯(lián)量子點(diǎn)，經(jīng)PBS洗滌離心3次，去除未與基底結(jié)合的量子點(diǎn)-T-2毒素-BSA全抗原后每個(gè)微孔中加入0.01M，pH7.4的PBS緩沖液200μL，在370nm激發(fā)波長(zhǎng)下用熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)500nm時(shí)的發(fā)射峰強(qiáng)度。

2）檢測(cè)靈敏度的確定

采用上述檢測(cè)方法，分別在基底中加入濃度為0μg/L、0.25μg/L、0.3μg/L、0.35μg/L、0.4μg/L、0.45μg/L、0.5μg/L的T-2毒素溶液及空白溶液，在370nm激發(fā)波長(zhǎng)下用熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)500nm時(shí)的發(fā)射峰強(qiáng)度。測(cè)試結(jié)果如圖10所示，檢出限為0.25μg/L。

3）交叉反應(yīng)試驗(yàn)

根據(jù)實(shí)施例2和實(shí)施例3制備CdSe/ZnS-T-2毒素-BSA全抗原和-T-2毒素單抗基底，將三聚氰胺、伏馬毒素B₁、T-2毒素、黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮分別配成系列濃度采用上述的檢測(cè)方法進(jìn)行特異性交叉試驗(yàn)，同時(shí)空白對(duì)照。計(jì)算各競(jìng)爭(zhēng)物的 IC50。計(jì)算公式為：交叉反應(yīng)率 (％) ＝ [IC50(T-2毒素)/IC50( 待測(cè)藥物 )]×100。

測(cè)定及計(jì)算結(jié)果如表5所示，結(jié)果表明該方法異性較強(qiáng)，只對(duì)T-2毒素發(fā)生反應(yīng)，而對(duì)其他毒性化合物沒(méi)有交叉反應(yīng)。

4）待測(cè)液的制備

用粉碎機(jī)粉碎待測(cè)谷物，粒度小于2mm。稱取5g試樣(精確到0.01 g)加入不同濃度的三聚氰胺水平的標(biāo)準(zhǔn)品，置于具塞塑料離心管中，加人PBS溶液25 mL，超聲振蕩15 min后4000 r/min離心10 min。取上層17. 5 mL PBS溶液于干凈的容器，通過(guò)微纖維濾紙過(guò)濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液A)。向下層固體樣品中加人17. 5 mL甲醇，超聲振蕩15 min后4 000 r/min離心10 min，取上層溶液10 mL，用90 mL PBS溶液稀釋后通過(guò)微纖維濾紙過(guò)濾，將濾液收集于干凈的容器（提取液B）。

將免疫親和柱連接于10mL玻璃針筒下，準(zhǔn)確移取50mL提取液B過(guò)免疫親和柱，以每秒1～2滴的流速全部通過(guò)親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱；將20mLPBS溶液以每秒1～2滴的流速通過(guò)親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱；準(zhǔn)確移取5mLA以每秒1～2滴的流速全部通過(guò)親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱；將20mL超純水以每秒1～2滴的流速淋洗柱子，直至空氣流經(jīng)親和柱；棄去全部流出液。將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將洗脫液收集于玻璃試管中，當(dāng)甲醇大部分過(guò)柱后，不要完全過(guò)柱，停止加壓，靜止5min，再將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將全部洗脫液收集于同一玻璃試管中，待測(cè)。

5）準(zhǔn)確度和精密度的檢測(cè)

以重復(fù)測(cè)定某一濃度樣品的檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)（CV%）作為精密度評(píng)價(jià)指標(biāo)。以回收率作為準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)指標(biāo)。變異系數(shù) CV% 計(jì)算公式為：CV% =SD/ X ×100% ；其中 SD 為標(biāo)準(zhǔn)偏差，X 為測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值?；厥章视?jì)算公式為：回收率（%）= 實(shí)際測(cè)定值/理論值×100%。其中理論值為模擬樣品的添加濃度。

采用上述待測(cè)液的制備方法，對(duì)玉米樣品進(jìn)行T-2毒素陽(yáng)性添加，T-2毒素分別添加0.25μg/kg、0.35μg/kg、0.45μg/kg三個(gè)濃度水平的樣品，每個(gè)添加水平做4個(gè)平行，選取PBS作為空白對(duì)照1，再選取未添加的玉米樣品做空白對(duì)照2，利用實(shí)施例1中的熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀，參照實(shí)施例6中1）的試驗(yàn)步驟進(jìn)行添加回收測(cè)定。樣品的平均回收率及精密度結(jié)果見(jiàn)表6。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：平均回收率在88.2～89.6之間。變異系數(shù)均小于11%，說(shuō)明方法精密度和準(zhǔn)確度好，檢測(cè)效果好。

實(shí)施例7應(yīng)用熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)黃曲霉毒素B₁

1)應(yīng)用熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)黃曲霉毒素B₁的方法

加入100μL待測(cè)液到采用實(shí)施例3中的方法制備的黃曲霉毒素B₁單抗基底上，37°C下孵育2h，每孔加入200μL由實(shí)施例2提供的方法制備的濃度為200ng/mL的ZnSe/ZnS-黃曲霉毒素B1-BSA全抗原偶聯(lián)量子點(diǎn)，經(jīng)PBS洗滌離心3次，去除未與基底結(jié)合的量子點(diǎn)-黃曲霉毒素B1-BSA全抗原后每個(gè)微孔中加入0.01M，pH7.4的PBS緩沖液200μL，在370nm激發(fā)波長(zhǎng)下用熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)520nm時(shí)的發(fā)射峰強(qiáng)度。

2）檢測(cè)靈敏度的確定

采用上述檢測(cè)方法，分別在基底中加入濃度為0μg/L、0.3μg/L、0.35μg/L、0.4μg/L、0.45μg/L、0.5μg/L、0.55μg/L的黃曲霉毒素B₁溶液及空白溶液，在370nm激發(fā)波長(zhǎng)下用熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)520nm時(shí)的發(fā)射峰強(qiáng)度。測(cè)試結(jié)果如圖11所示，檢出限為0.3μg/L。

3）交叉反應(yīng)試驗(yàn)

根據(jù)實(shí)施例2和實(shí)施例3的方法制備好CdSe/ZnS-黃曲霉毒素B₁-BSA全抗原和-黃曲霉毒素B1單抗基底，將三聚氰胺、伏馬毒素B₁、T-2毒素、黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮分別配成系列濃度采用上述的檢測(cè)方法進(jìn)行特異性交叉試驗(yàn)，同時(shí)空白對(duì)照。計(jì)算各競(jìng)爭(zhēng)物的 IC50。計(jì)算公式為：交叉反應(yīng)率 (％) ＝ [IC50(黃曲霉毒素B1)/IC50( 待測(cè)藥物 )]×100。

測(cè)定及計(jì)算結(jié)果，結(jié)果表明該方法異性較強(qiáng)，只對(duì)黃曲霉毒素B₁發(fā)生反應(yīng)，而對(duì)其他毒性化合物沒(méi)有交叉反應(yīng)。