本發(fā)明屬于生物傳感器制造領(lǐng)域，涉及一種高靈敏度可回收納米生物傳感器及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默癥是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其患者腦中Tau蛋白總量多于正常人，因此，可通過檢測(cè)患者腦脊液中Tau蛋白含量來診斷阿爾茨海默癥。

目前，在人類體液的蛋白質(zhì)檢測(cè)方面，免疫分析方法因其特異性和高選擇性而得到了廣泛應(yīng)用。特別是酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)幾乎是體液中蛋白質(zhì)檢驗(yàn)的唯一方法。因?yàn)轶w液中各種物質(zhì)含量復(fù)雜，難以使用其他化學(xué)方法對(duì)特定的某一種目標(biāo)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。而抗體對(duì)抗原的特異性識(shí)別，可以使得抗體有效地從復(fù)雜的成分中識(shí)別并俘獲抗原，對(duì)原料的前處理要求比較少，可以進(jìn)行直接檢驗(yàn)。基于這個(gè)原理的ELISA分析方法，理論上可以檢測(cè)任何蛋白質(zhì)。但是該方法在設(shè)計(jì)上存在以下缺陷：首先，是抗體被包覆在聚苯乙烯酶標(biāo)板上的工藝問題，因?yàn)榫郾揭蚁┡c抗體之間僅僅是分子間力吸附而不是化學(xué)連接，這使得抗體不能有效地附著在酶標(biāo)板上；其次，ELISA需要一些清洗過程，在清洗的過程中，已經(jīng)連接上去的抗體和抗原會(huì)再次掉落；最后，二抗和抗原的識(shí)別并不是一對(duì)一的，一個(gè)抗原有可能吸附多個(gè)二抗，而只有二抗才會(huì)提供信息，這就使得二抗的量只能大約指示抗原的量。上述問題都導(dǎo)致了ELISA的檢測(cè)精度和重現(xiàn)度較低。故ELISA只能停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，難以被臨床應(yīng)用。

石墨烯是一種由碳原子構(gòu)成的單層片狀結(jié)構(gòu)的新材料，具有非同尋常的導(dǎo)電性能、超出鋼鐵數(shù)十倍的強(qiáng)度和極好的透光性，可被廣泛應(yīng)用于電子科技、新能源及基因測(cè)序等領(lǐng)域。石墨烯還可以吸附和脫附各種原子和分子，在化學(xué)及生物等領(lǐng)域有許多潛在的應(yīng)用。

申請(qǐng)公布號(hào)為CN 102590309 A的中國(guó)發(fā)明專利公布了一種石墨烯晶體管及其生物傳感器的制作與應(yīng)用方法，該方法針對(duì)石墨烯晶體管傳感器選擇性較差的問題，提出了制作基于石墨烯晶體管的生物傳感器的方法，該方法是在石墨烯晶體管表面生長(zhǎng)氧化鋅納米線或金屬納米顆粒，而這些晶體管表面的納米材料有利于吸附具有專一識(shí)別功能力的生物活性物質(zhì)(如酶，DNA，RNA，適體，抗原或抗體等)，使得石墨烯晶體管通道具有選擇性吸附目標(biāo)分析物的能力，提高了基于石墨烯晶體管通道傳感器的靈敏度和選擇性。上述專利公布的技術(shù)方案中，晶體管表面的納米材料表層通過靜電作用吸附生物活性物質(zhì)，通過吸附目標(biāo)分析物后石墨烯的電阻特性變化來檢測(cè)樣本中的微量目標(biāo)分析物。其中抗體和晶體管的這種吸附不具備特異性，只要是結(jié)構(gòu)上具有和碳的六元環(huán)相似的物質(zhì)都能被吸附，而且這種吸附是可逆的，這使得在運(yùn)用中已經(jīng)吸附的抗體容易被待測(cè)樣品中的某些物質(zhì)替換，從而影響檢測(cè)精度。因此在實(shí)際應(yīng)用上對(duì)待測(cè)樣品的前處理要求很高。不同于上述專利，本發(fā)明是通過抗體與石墨烯之間形成肽鍵，來增強(qiáng)石墨烯對(duì)抗體的結(jié)合力，抗體結(jié)合效率更高更牢固，且采用免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)檢測(cè)樣品的蛋白濃度，對(duì)抗體的要求較低，可以直接使用多克隆抗體代替單克隆抗體，降低了成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種靈敏度高、與抗體結(jié)合牢固，檢測(cè)效率高，經(jīng)濟(jì)成本低的高靈敏度可回收納米生物傳感器及其制備方法與應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種高靈敏度可回收納米生物傳感器，該生物傳感器是以納米級(jí)石墨烯為載體，通過抗體與納米級(jí)石墨烯之間形成肽鍵，將抗體負(fù)載在納米級(jí)石墨烯上。

所述的納米級(jí)石墨烯的厚度≤0.9nm，長(zhǎng)度≤100nm，寬度≤100nm。

所述的抗體為單抗或多抗中的一種。

所述的抗體包括但不限于Tau蛋白抗體。

一種高靈敏度可回收納米生物傳感器的制備方法，該方法具體包括以下步驟：

(1)將氧化石墨烯或羧基化石墨烯加入酸性緩沖溶液中，超聲分散均勻；

(2)再加入偶聯(lián)劑及催化劑，反應(yīng)1-12小時(shí)；

(3)待反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，除去上層清液，保留剩余固體I；

(4)將剩余固體I加入到堿性緩沖溶液中，超聲分散均勻；

(5)再加入抗體，反應(yīng)1-8小時(shí)；

(6)待反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，除去上層清液，保留剩余固體II；

(7)將剩余固體II加入到封閉液中，超聲分散均勻后，繼續(xù)反應(yīng)1-2小時(shí)，隨后離心分離，除去上層清液，保留剩余固體III；

(8)將剩余固體III加入到堿性緩沖溶液中，超聲分散均勻，保存。

步驟(2)中所述的氧化石墨烯或羧基化石墨烯與偶聯(lián)劑、催化劑的質(zhì)量比為1-5:1-10:1-10；

步驟(5)中所述的抗體與氧化石墨烯或羧基化石墨烯的質(zhì)量比為1-3:100000-500000。

所述的酸性緩沖溶液包括MES(2-嗎啉代乙磺酸)、MEST(2-嗎啉代乙磺酸-吐溫)、Bis-Tris(二(2-羥乙基)三亞氨基(羥甲基)甲烷)、HEPES(羥乙基哌嗪乙硫磺酸)、PIPES(哌嗪-1,4-二乙磺酸)、MOPS(3-嗎啉丙磺酸)或甘氨酸-鹽酸緩沖液中的一種；

所述的偶聯(lián)劑為碳二亞胺類偶聯(lián)劑，包括EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺)，DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)或DIC(N,N-'二異丙基碳二亞胺)中的一種；

所述的催化劑包括NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)或DMAP(4-二甲氨基吡啶)中的一種；

所述的堿性緩沖溶液包括TAE(三羥甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸二鈉，冰醋酸緩沖液)、TPE(三羥甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸二鈉，磷酸緩沖液)、tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸)、PBS(磷酸-磷酸鹽緩沖液)或磷酸氫二鈉-氫氧化鈉中的一種；

所述的封閉液包括BSA(牛血清蛋白)、HSA(人血清白蛋白)或明膠中的一種。

所述的酸性緩沖溶液的pH為0-5，所述的堿性緩沖溶液的pH＞7。

一種高靈敏度可回收納米生物傳感器的應(yīng)用，所述的生物傳感器基于免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)用于檢測(cè)包括Tau蛋白在內(nèi)的人體體液蛋白質(zhì)。

本發(fā)明生物傳感器中，抗體在納米級(jí)石墨烯上的負(fù)載量由待測(cè)樣品的估計(jì)濃度來確定。例如，人體待檢測(cè)的Tau蛋白含量在0-1000pg/mL之間，那么抗體的負(fù)載量應(yīng)為該濃度范圍的0.5-2倍。

本發(fā)明生物傳感器制備方法的反應(yīng)機(jī)理是經(jīng)典的碳二亞胺偶聯(lián)機(jī)理，具體反應(yīng)機(jī)理的一種典型化學(xué)式為：

上述化學(xué)反應(yīng)式中，1代表氧化石墨烯或羧基化石墨烯，2代表抗體。氧化石墨烯或羧基化石墨烯的羧基與偶聯(lián)劑發(fā)生反應(yīng)，脫去羧基上的羥基基團(tuán)，與偶聯(lián)劑形成一個(gè)中間產(chǎn)物A；生成的中間產(chǎn)物A再與抗體反應(yīng)，并生成產(chǎn)物B，即為所述的納米生物傳感器。以上化學(xué)式僅為一種典型的實(shí)施例，根據(jù)偶聯(lián)劑及其穩(wěn)定劑的不同，可以有一定的變化。

本發(fā)明生物傳感器在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，以免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)代替二抗標(biāo)記，具體步驟為：

(a)將待檢測(cè)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品按不同濃度配成10個(gè)樣品；

(b)分別加入一定量的抗體-石墨烯復(fù)合材料的溶液，培養(yǎng)0-2小時(shí)后，再分別加入一定量的帶有熒光標(biāo)記(包括但不局限于各種辣根類、異硫氰酸酯類熒光染料)的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品并繼續(xù)培養(yǎng)0-2小時(shí)；

(c)采用步驟(b)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行處理；

(d)將培養(yǎng)結(jié)束后的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，使用熒光儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，并重復(fù)5-10次，繪制濃度-熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(e)將待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度與濃度-熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬合，即可計(jì)算出待測(cè)樣品中的蛋白濃度。

本發(fā)明采用納米級(jí)石墨烯作為載體，結(jié)合免疫識(shí)別、熒光共振技術(shù)，構(gòu)建了一種超靈敏，高選擇性，低檢測(cè)下限的納米生物傳感體系，所采用的制備方法是獨(dú)創(chuàng)的有別于ELISA的新的檢測(cè)手段，免除分離步驟，比傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫ELISA方法操作更加簡(jiǎn)便，靈敏度高，誤差低，適合應(yīng)用于臨床診斷檢測(cè)分析，可以用于檢測(cè)人體體液中的蛋白質(zhì)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)：

1)石墨烯與抗體之間是形成肽鍵的化學(xué)結(jié)合，而不是ELISA的ps板與抗體之間的一般吸附，使得抗體結(jié)合效率更高更牢固，更能經(jīng)受住清洗；

2)以納米級(jí)別的石墨烯代替ELISA板，表面積更大，富集能力更強(qiáng)；

3)除抗體-石墨烯復(fù)合材料的制備中需要清洗外，實(shí)際檢測(cè)過程中不需要任何清洗步驟，避免了ELISA的清洗步驟帶來的誤差；

4)以免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)代替二抗標(biāo)記，避免了二抗與抗原之間的識(shí)別問題造成的誤差，能夠?qū)崿F(xiàn)檢測(cè)什么就標(biāo)記什么；

5)本發(fā)明正因?yàn)楸苊饬硕古c抗原之間的識(shí)別問題，實(shí)際上只要第一抗體能夠抓住抗原就可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的檢測(cè)，對(duì)抗體的要求較低，可以直接使用多克隆抗體代替單克隆抗體，降低了檢測(cè)成本；

6)本發(fā)明的檢測(cè)下限可以達(dá)到100pg/ml以下，回收率99％以上，有望開發(fā)成為臨床診斷試劑盒。

附圖說明

圖1-a為實(shí)施例1制備抗體-石墨烯復(fù)合材料生物傳感器反應(yīng)前復(fù)合物的AFM圖；

圖1-b為實(shí)施例1制備抗體-石墨烯復(fù)合材料生物傳感器反應(yīng)前復(fù)合物AFM圖中某縱截面的高度分布曲線圖；

圖2-a為實(shí)施例1制備抗體-石墨烯復(fù)合材料生物傳感器活化后復(fù)合物的AFM圖；

圖2-b為實(shí)施例1制備抗體-石墨烯復(fù)合材料生物傳感器活化后復(fù)合物AFM圖中某縱截面的高度分布曲線圖；

圖3-a為實(shí)施例1制備抗體-石墨烯復(fù)合材料生物傳感器接上抗體后復(fù)合物的AFM圖；

圖3-b為實(shí)施例1制備抗體-石墨烯復(fù)合材料生物傳感器接上抗體后復(fù)合物AFM圖中某縱截面的高度分布曲線圖；

圖4為實(shí)施例1所繪制濃度-熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1：

將0.2mg氧化石墨烯分散在一定濃度的pH<6的MES溶液中，加入0.5mg的EDC溶液和0.5mg的NHS溶液，在10℃以下反應(yīng)1小時(shí)。接著離心分離清液，留下固體，加入pH>7的一定濃度的PBS溶液。用超聲波清洗后再次離心去除清液，將固體再次分散在PBS溶液中。加入1-3ng Tau蛋白抗體，并持續(xù)振蕩反應(yīng)2小時(shí)。接著加入一定濃度的BSA溶液，反應(yīng)1小時(shí)以封閉石墨烯上可能的剩余活性基團(tuán)，清洗后，待用。

由圖1-a、1-b分析可得，反應(yīng)前的石墨烯厚度為1nm以下，由圖2-a、2-b分析可得，活化后的石墨烯厚度約為4nm，由圖3-a、3-b分析可得，接上抗體后的石墨烯厚度約為6nm。

配制濃度在0-200pg的10個(gè)Tau蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品。分別加入制得的納米生物傳感器，在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)。接著在每個(gè)樣品中加入100pg的帶有熒光標(biāo)記的Tau蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品。持續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)后，使用熒光儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。

將待測(cè)樣按上述步驟處理，測(cè)得熒光強(qiáng)度，與該標(biāo)準(zhǔn)曲線作對(duì)比，以得出待測(cè)樣的濃度。

實(shí)施例2：

一種高靈敏度可回收納米生物傳感器，該生物傳感器是以納米級(jí)石墨烯為載體，通過抗體與納米級(jí)石墨烯之間形成肽鍵，將抗體負(fù)載在納米級(jí)石墨烯上。

其中，納米級(jí)石墨烯的厚度≤0.9nm，長(zhǎng)度≤100nm，寬度≤100nm。抗體為Tau蛋白抗體。

本實(shí)施例高靈敏度可回收納米生物傳感器的制備方法，具體包括以下步驟：

(1)將氧化石墨烯加入酸性緩沖溶液中，超聲分散均勻；

(2)再加入偶聯(lián)劑及催化劑，反應(yīng)12小時(shí)；

(3)待反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，除去上層清液，保留剩余固體I；

(4)將剩余固體I加入到堿性緩沖溶液中，超聲分散均勻；

(5)再加入抗體，反應(yīng)8小時(shí)；

(6)待反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，除去上層清液，保留剩余固體II；

(7)將剩余固體II加入到封閉液中，超聲分散均勻后，繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，隨后離心分離，除去上層清液，保留剩余固體III；

(8)將剩余固體III加入到堿性緩沖溶液中，超聲分散均勻，保存。

步驟(2)中，氧化石墨烯與偶聯(lián)劑、催化劑的質(zhì)量比為5:10:10；

步驟(4)中，剩余固體I在堿性緩沖溶液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL；

步驟(5)中，抗體與氧化石墨烯的質(zhì)量比為3:500000；

步驟(7)中，剩余固體II在封閉液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL；

步驟(8)中，剩余固體III在堿性緩沖溶液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL。

本實(shí)施例所采用的酸性緩沖溶液為Bis-Tris，偶聯(lián)劑為DCC，催化劑為DMAP，堿性緩沖溶液為TPE，封閉液為HSA。

在實(shí)際制備時(shí)，控制酸性緩沖溶液的pH為0-5，堿性緩沖溶液的pH＞7。

本實(shí)施例制得的高靈敏度可回收納米生物傳感器基于免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)用于檢測(cè)包括Tau蛋白在內(nèi)的人體體液蛋白質(zhì)。

實(shí)施例3：

一種高靈敏度可回收納米生物傳感器，該生物傳感器是以納米級(jí)石墨烯為載體，通過抗體與納米級(jí)石墨烯之間形成肽鍵，將抗體負(fù)載在納米級(jí)石墨烯上。

其中，納米級(jí)石墨烯的厚度≤0.9nm，長(zhǎng)度≤100nm，寬度≤100nm?？贵w為Tau蛋白抗體。

本實(shí)施例高靈敏度可回收納米生物傳感器的制備方法，具體包括以下步驟：

(1)將氧化石墨烯加入酸性緩沖溶液中，超聲分散均勻；

(2)再加入偶聯(lián)劑及催化劑，反應(yīng)1小時(shí)；

(3)待反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，除去上層清液，保留剩余固體I；

(4)將剩余固體I加入到堿性緩沖溶液中，超聲分散均勻；

(5)再加入抗體，反應(yīng)1小時(shí)；

(6)待反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，除去上層清液，保留剩余固體II；

(7)將剩余固體II加入到封閉液中，超聲分散均勻后，繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)，隨后離心分離，除去上層清液，保留剩余固體III；

(8)將剩余固體III加入到堿性緩沖溶液中，超聲分散均勻，保存。

步驟(2)中，氧化石墨烯與偶聯(lián)劑、催化劑的質(zhì)量比為1:3:5；

步驟(4)中，剩余固體I在堿性緩沖溶液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL；

步驟(5)中，抗體與氧化石墨烯的質(zhì)量比為1:100000；

步驟(7)中，剩余固體II在封閉液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL；

步驟(8)中，剩余固體III在堿性緩沖溶液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL。

本實(shí)施例所采用的酸性緩沖溶液為MEST，偶聯(lián)劑為DIC，催化劑為NHS，堿性緩沖溶液為tris-HCl，封閉液為明膠。

在實(shí)際制備時(shí)，控制酸性緩沖溶液的pH為0-5，堿性緩沖溶液的pH＞7。

本實(shí)施例制得的高靈敏度可回收納米生物傳感器基于免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)用于檢測(cè)包括Tau蛋白在內(nèi)的人體體液蛋白質(zhì)。

實(shí)施例4：

一種高靈敏度可回收納米生物傳感器，該生物傳感器是以納米級(jí)石墨烯為載體，通過抗體與納米級(jí)石墨烯之間形成肽鍵，將抗體負(fù)載在納米級(jí)石墨烯上。

其中，納米級(jí)石墨烯的厚度≤0.9nm，長(zhǎng)度≤100nm，寬度≤100nm?？贵w為Tau蛋白抗體。

本實(shí)施例高靈敏度可回收納米生物傳感器的制備方法，具體包括以下步驟：

(1)將氧化石墨烯加入酸性緩沖溶液中，超聲分散均勻；

(2)再加入偶聯(lián)劑及催化劑，反應(yīng)6小時(shí)；

(3)待反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，除去上層清液，保留剩余固體I；

(4)將剩余固體I加入到堿性緩沖溶液中，超聲分散均勻；

(5)再加入抗體，反應(yīng)4小時(shí)；

(6)待反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，除去上層清液，保留剩余固體II；

(7)將剩余固體II加入到封閉液中，超聲分散均勻后，繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，隨后離心分離，除去上層清液，保留剩余固體III；

(8)將剩余固體III加入到堿性緩沖溶液中，超聲分散均勻，保存。

步驟(2)中，氧化石墨烯與偶聯(lián)劑、催化劑的質(zhì)量比為1:1:1；

步驟(4)中，剩余固體I在堿性緩沖溶液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL；

步驟(5)中，抗體與氧化石墨烯的質(zhì)量比為3:200000；

步驟(7)中，剩余固體II在封閉液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL；

步驟(8)中，剩余固體III在堿性緩沖溶液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL。

本實(shí)施例所采用的酸性緩沖溶液為HEPES，偶聯(lián)劑為WSCD，催化劑為NHS，堿性緩沖溶液為PBS，封閉液為BSA。

在實(shí)際制備時(shí)，控制酸性緩沖溶液的pH為0-5，堿性緩沖溶液的pH＞7。

本實(shí)施例制得的高靈敏度可回收納米生物傳感器基于免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)用于檢測(cè)包括Tau蛋白在內(nèi)的人體體液蛋白質(zhì)。

實(shí)施例5：

一種高靈敏度可回收納米生物傳感器，該生物傳感器是以納米級(jí)石墨烯為載體，通過抗體與納米級(jí)石墨烯之間形成肽鍵，將抗體負(fù)載在納米級(jí)石墨烯上。

其中，納米級(jí)石墨烯的厚度≤0.9nm，長(zhǎng)度≤100nm，寬度≤100nm?？贵w為Tau蛋白抗體。

本實(shí)施例高靈敏度可回收納米生物傳感器的制備方法，具體包括以下步驟：

(1)將氧化石墨烯加入酸性緩沖溶液中，超聲分散均勻；

(2)再加入偶聯(lián)劑及催化劑，反應(yīng)10小時(shí)；

(3)待反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，除去上層清液，保留剩余固體I；

(4)將剩余固體I加入到堿性緩沖溶液中，超聲分散均勻；

(5)再加入抗體，反應(yīng)3小時(shí)；

(6)待反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，除去上層清液，保留剩余固體II；

(7)將剩余固體II加入到封閉液中，超聲分散均勻后，繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，隨后離心分離，除去上層清液，保留剩余固體III；

(8)將剩余固體III加入到堿性緩沖溶液中，超聲分散均勻，保存。

步驟(2)中，氧化石墨烯與偶聯(lián)劑、催化劑的質(zhì)量比為3:7:8；

步驟(4)中，剩余固體I在堿性緩沖溶液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL；

步驟(5)中，抗體與氧化石墨烯的質(zhì)量比為2:300000；

步驟(7)中，剩余固體II在封閉液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL；

步驟(8)中，剩余固體III在堿性緩沖溶液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL。

本實(shí)施例所采用的酸性緩沖溶液為PIPES，偶聯(lián)劑為WSCI，催化劑為NHS，堿性緩沖溶液為磷酸氫二鈉，封閉液為BSA。

在實(shí)際制備時(shí)，控制酸性緩沖溶液的pH為0-5，堿性緩沖溶液的pH＞7。

本實(shí)施例制得的高靈敏度可回收納米生物傳感器基于免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)用于檢測(cè)包括Tau蛋白在內(nèi)的人體體液蛋白質(zhì)。

實(shí)施例6：

一種高靈敏度可回收納米生物傳感器，該生物傳感器是以納米級(jí)石墨烯為載體，通過抗體與納米級(jí)石墨烯之間形成肽鍵，將抗體負(fù)載在納米級(jí)石墨烯上。

其中，納米級(jí)石墨烯的厚度≤0.9nm，長(zhǎng)度≤100nm，寬度≤100nm。抗體為Tau蛋白抗體。

本實(shí)施例高靈敏度可回收納米生物傳感器的制備方法，具體包括以下步驟：

(1)將羧基化石墨烯加入酸性緩沖溶液中，超聲分散均勻；

(2)再加入偶聯(lián)劑及催化劑，反應(yīng)8小時(shí)；

(3)待反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，除去上層清液，保留剩余固體I；

(4)將剩余固體I加入到堿性緩沖溶液中，超聲分散均勻；

(5)再加入抗體，反應(yīng)5小時(shí)；

(6)待反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，除去上層清液，保留剩余固體II；

(7)將剩余固體II加入到封閉液中，超聲分散均勻后，繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，隨后離心分離，除去上層清液，保留剩余固體III；

(8)將剩余固體III加入到堿性緩沖溶液中，超聲分散均勻，保存。

步驟(2)中，羧基化石墨烯與偶聯(lián)劑、催化劑的質(zhì)量比為2:5:6；

步驟(4)中，剩余固體I在堿性緩沖溶液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL；

步驟(5)中，抗體與羧基化石墨烯的質(zhì)量比為1:400000；

步驟(7)中，剩余固體II在封閉液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL；

步驟(8)中，剩余固體III在堿性緩沖溶液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL。

本實(shí)施例所采用的酸性緩沖溶液為MOPS，偶聯(lián)劑為EDC，催化劑為NHS，堿性緩沖溶液為tris-HCl，封閉液為BSA。

在實(shí)際制備時(shí)，控制酸性緩沖溶液的pH為0-5，堿性緩沖溶液的pH＞7。

本實(shí)施例制得的高靈敏度可回收納米生物傳感器基于免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)用于檢測(cè)包括Tau蛋白在內(nèi)的人體體液蛋白質(zhì)。

實(shí)施例7：

一種高靈敏度可回收納米生物傳感器，該生物傳感器是以納米級(jí)石墨烯為載體，通過抗體與納米級(jí)石墨烯之間形成肽鍵，將抗體負(fù)載在納米級(jí)石墨烯上。

其中，納米級(jí)石墨烯的厚度≤0.9nm，長(zhǎng)度≤100nm，寬度≤100nm?？贵w為Tau蛋白抗體。

本實(shí)施例高靈敏度可回收納米生物傳感器的制備方法，具體包括以下步驟：

(1)將羧基化石墨烯加入酸性緩沖溶液中，超聲分散均勻；

(2)再加入偶聯(lián)劑及催化劑，反應(yīng)8小時(shí)；

(3)待反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，除去上層清液，保留剩余固體I；

(4)將剩余固體I加入到堿性緩沖溶液中，超聲分散均勻；

(5)再加入抗體，反應(yīng)5小時(shí)；

(6)待反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，除去上層清液，保留剩余固體II；

(7)將剩余固體II加入到封閉液中，超聲分散均勻后，繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，隨后離心分離，除去上層清液，保留剩余固體III；

(8)將剩余固體III加入到堿性緩沖溶液中，超聲分散均勻，保存。

步驟(2)中，羧基化石墨烯與偶聯(lián)劑、催化劑的質(zhì)量比為1:3:5；

步驟(4)中，剩余固體I在堿性緩沖溶液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL；

步驟(5)中，抗體與羧基化石墨烯的質(zhì)量比為1:400000；

步驟(7)中，剩余固體II在封閉液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL；

步驟(8)中，剩余固體III在堿性緩沖溶液中的質(zhì)量濃度≤1mg/mL。

本實(shí)施例所采用的酸性緩沖溶液為甘氨酸-鹽酸緩沖液，偶聯(lián)劑為DCC，催化劑為NHS，堿性緩沖溶液為磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液，封閉液為BSA。

在實(shí)際制備時(shí)，控制酸性緩沖溶液的pH為0-5，堿性緩沖溶液的pH＞7。

本實(shí)施例制得的高靈敏度可回收納米生物傳感器基于免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)用于檢測(cè)包括Tau蛋白在內(nèi)的人體體液蛋白質(zhì)。