本發(fā)明涉及生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及基于核酸適配體構(gòu)象變化的汞離子的電化學(xué)傳感器，還涉及其制備方法。

背景技術(shù)：

汞及其化合物對(duì)人體健康存在多種傷害，若存在于天然水體中，則會(huì)對(duì)大范圍的人群造成威脅。它能夠在生物體內(nèi)積累，通過食物鏈轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)。人體內(nèi)累積的微量汞無法通過自身代謝進(jìn)行排泄，將直接導(dǎo)致心臟、肝甲狀腺疾病，引起神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，慢性汞中毒，甚至引發(fā)惡性腫瘤的形成。

溶解態(tài)的Hg2⁺往往具有較高的化學(xué)活性，是排入天然水體中汞污染物的主要存在形式，其化合物具有較高的水溶性，也是各種汞形態(tài)轉(zhuǎn)化的樞紐。因此，汞離子的分析測定是人們十分關(guān)注的課題。目前，常用的汞化合物檢測方法包括分光光度法、原子發(fā)射光譜法、原子吸收光譜法、氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法等，這些方法往往存在儀器昂貴、分析周期長、樣品預(yù)處理復(fù)雜、檢測費(fèi)用昂貴等問題，已經(jīng)難以適應(yīng)汞離子檢測的方便、快捷、靈敏度等方面的要求。

因此，目前急需建立一種快速，準(zhǔn)確，靈敏且高特異性的檢測方法來檢測食品中汞離子的殘留。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中檢測汞離子的方法特異性和靈敏度都比較低、成本高的問題，本發(fā)明提供了一種特異性和靈敏度高、成本低、檢測速度快的基于核酸適配體構(gòu)象變化檢測汞離子的電化學(xué)傳感器。

本發(fā)明還提供了基于核酸適配體構(gòu)象變化檢測汞離子的電化學(xué)傳感器的制備方法。

本發(fā)明是通過以下步驟得到的：

本發(fā)明中一共用到了3條DNA鏈，其序列分別是：

HAP: 5’-CCCAACTTTCCTCAGCTTGGGTAGGGCGGGTTGGGTTTTTT-SH-3’ (SEQ ID NO:1) ；

Helper1: 5’-CCTACCCTTTGTTCTTTG-3’ (SEQ ID NO:2) ；

Helper2: 5’-CTTTGTTCTTTGCTGAGG-3’ (SEQ ID NO:3) 。

其中Helper1與Helper2中畫橫線部分的T之間可特異性結(jié)合汞離子，從而形成“T-Hg2⁺-T”結(jié)構(gòu)。

HAP的3’端修飾有巰基（-SH），可以與金電極形成穩(wěn)定的Au-S鍵，從而將HAP固定在電極表面；序列中有富含鳥嘌呤G的DNA序列即血紅素hemin的適配體，它在被暴露的情況下可以和hemin特異性的形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，在鉀離子和雙氧水的存在下，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，我們就是通過檢測該氧化還原信號(hào)來達(dá)到定量的檢測目標(biāo)物的目的。

本發(fā)明中只用到了一種酶：核酸限制性內(nèi)切酶Nt. BbvCI，可以識(shí)別特定的雙鏈序列。

本發(fā)明中汞離子的檢測是在電極上實(shí)現(xiàn)的，通過目標(biāo)循環(huán)的方式來實(shí)現(xiàn)信號(hào)的增大，從而實(shí)現(xiàn)汞離子的高靈敏檢測，并獲得較低的檢測下限。

均相中發(fā)生的反應(yīng)主要有：在有目標(biāo)物存在的情況下，Helpe1與Helper2 中T之間會(huì)由目標(biāo)物連接形成“T-Hg²⁺-T”結(jié)構(gòu)，而Helper1與Helper2未結(jié)合的部分會(huì)與固定在電極表面的HAP的環(huán)部通過堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行結(jié)合，形成Y型結(jié)構(gòu)，在限制性內(nèi)切酶Nt. BbvCI的作用下，HAP被切割，暴露出hemin的適配體序列，并釋放目標(biāo)物Hg²⁺同Helper1及Helper2結(jié)合在一起的復(fù)合物部分同未參與反應(yīng)的HAP形成新的Y型結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)循環(huán)放大信號(hào)。加入hemin后，暴露出來的適配體形成G-四聯(lián)體，在K⁺和雙氧水存在的情況下，產(chǎn)生氧化還原信號(hào)。

在均相反應(yīng)中，放大的反應(yīng)條件均為37℃，反應(yīng)時(shí)間是2h。

一種基于核酸適配體檢測汞離子的生物傳感器，在電極上依次修飾有HAP層和Helper層；

HAP層中HAP為5’-CCCAACTTTCCTCAGCTTGGGTAGGGCGGGTTGGGTTTTTT-SH-3’

Helper層中含有Helper1、Helper2、Hg²⁺、Nt. BbvCI、

Helper1: 5’-CCTACCCTTTGTTCTTTG-3’ ，

Helper2: 5’-CTTTGTTCTTTGCTGAGG-3’；

所述的生物傳感器， HAP層的厚度為15±2nm、Helper層的厚度約為10±2nm。

所述的生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

（1）對(duì)電極進(jìn)行預(yù)處理；

（2）將HAP層修飾到電極表面；

（3）將Helper層修飾到電極表面。

所述的制備方法，優(yōu)選將HAP層修飾到電極表面的操作步驟如下：將10μM的HAP滴加10μL到經(jīng)過預(yù)處理的電極表面，在37℃下孵育2h。

所述的制備方法，優(yōu)選將Helper層修飾到電極表面的操作步驟如下：

（1）將滅菌水，1X的buffer緩沖液、Helper1、Helper2、核酸限制性內(nèi)切酶Nt. BbvCI和待測目標(biāo)物加入離心管中，震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

（2）將孵育好的混合溶液滴加到修飾好HAP層的電極上，將電極繼續(xù)放在37℃的恒溫箱中孵育2h，清洗。

所述的制備方法，優(yōu)選對(duì)電極進(jìn)行預(yù)處理操作為電極在0.3和0.05 μm的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水沖洗。

所述的制備方法，優(yōu)選所述電極為金電極。

該發(fā)明的檢測方式是電化學(xué)檢測，利用傳統(tǒng)的三電極體系。Ag/AgCl為參比電極，鉑絲為對(duì)電極，修飾的金電極為工作電極。在檢測之前，先通過Au-S鍵將HAP固定到電極表面。將反應(yīng)后的均相溶液修飾到電極表面，然后37℃孵育2h使均相中的Helper1及Helper2未結(jié)合部分與電極表面的HAP完成雜交反應(yīng)，并由核酸限制性內(nèi)切酶Nt. BbvCI完成對(duì)其的切割。暴露出的hemin適配體在加入hemin后形成G-四聯(lián)體，在K⁺和雙氧水存在的情況下產(chǎn)生氧化還原信號(hào)，用三電極工作體系檢測氧化還原峰。以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對(duì)電極，電位設(shè)置為0到-0.5 V，脈沖寬度0.05V，掃描速率為0.06 S，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取氧化還原信號(hào)的變化，檢測待測目標(biāo)物。

本發(fā)明基于核酸適配體特異性識(shí)別hemin形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，目標(biāo)物與核酸形成“T-Hg²⁺-T”結(jié)構(gòu)，核酸限制性內(nèi)切酶在特異性位點(diǎn)對(duì)核酸雙鏈的切割作用以及G-四聯(lián)體氧化還原特性構(gòu)建了適配體電化學(xué)生物傳感器。該傳感器具有檢測速度快，檢測限低，特異性高等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)汞離子現(xiàn)有檢測方法的缺陷與不足，實(shí)現(xiàn)對(duì)其快速，準(zhǔn)確的定量檢測。

本發(fā)明的有益效果：

1、利用了核酸適配體的特異型識(shí)別，利用汞離子的適體作為識(shí)別物質(zhì)實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)物汞離子的高特異性檢測；

2、利用核酸限制性內(nèi)切酶的切割作用，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的循環(huán)利用，起到了信號(hào)增大的作用；

3、利用核酸適配體的特異性識(shí)別，在加入hemin后形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，在K⁺和雙氧水存在的情況下產(chǎn)生氧化還原信號(hào)；

4、該傳感器的反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快；

5、由于使用金電極，其電極簡便、小型化、易攜帶、可多次使用；

6、檢測原理的主要過程均是在電極上實(shí)現(xiàn)的，提高了反應(yīng)速度，降低了操作的復(fù)雜程度，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的快速，簡單，靈敏的檢測；

7、制備方法簡單，性能穩(wěn)定，電極的重復(fù)性好，適用于食品安全中汞離子的檢測和生物傳感器產(chǎn)業(yè)化的實(shí)際應(yīng)用；

8、制作電極的工藝成本低，適用于產(chǎn)業(yè)化中價(jià)廉的要求。

附圖說明

圖1為電化學(xué)傳感器的檢測原理圖；

圖2為實(shí)施例1Helper1優(yōu)化檢測結(jié)果圖；

圖3為實(shí)施例2Helper2優(yōu)化檢測結(jié)果圖；

圖4為實(shí)施例3HAP優(yōu)化檢測結(jié)果圖；

圖5為實(shí)施例4目標(biāo)物工作曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

電極修飾過程的主要步驟如下：

a、金電極首先在0.3和0.05 μm的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水反復(fù)沖洗；

b、將10μL的HAP（10μM）滴加到電極表面，在室溫下（37℃）孵育2h。通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面；

至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發(fā)生的反應(yīng)，均相反應(yīng)中的主要步驟：

a、將滅菌水，1X的緩沖液（buffer），1μL Helper1（濃度分別為1μM，2μM，5μM，10μM，20μM），1μL Helper2，限制性核酸內(nèi)切酶Nt. BbvCI（1μL）和目標(biāo)物加入到預(yù)先準(zhǔn)備好的滅菌的離心管中。震蕩30s，然后將混勻的混合液放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

b、將a步反應(yīng)后的溶液滴加到預(yù)先修飾好HAP的電極上。然后將電極繼續(xù)放在37 ℃的恒溫箱中孵育2h；

c、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次。

以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對(duì)電極，電位設(shè)置為0到-0.5 V，脈沖寬度0.05V，掃描速率0.06 s，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取氧化還原電信號(hào)的變化，檢測目標(biāo)物。

結(jié)果見圖2，從圖中可以看出，檢測到的電流信號(hào)隨著Helper1的濃度在0-10μM區(qū)間內(nèi)增大而增大，當(dāng)濃度超過10μM后，電流趨于穩(wěn)定。所以Helper1的最佳濃度為10μM。

上述過程中用到的溶液的制備方法：

1、PBS緩沖液是由方法配制：Na₂HPO₄ (10mM)，NaH₂PO₄ (10mM), NaCl (140mM), KCl (1mM), MgCl₂ (1mM), CaCl₂ (1mM), 最終溶液的pH值為7.4。

1X的緩沖液（buffer）是隨核酸限制性內(nèi)切酶Nt. BbvCI一起買來的，可直接使用。

2、配置的PBS緩沖液與超純水均需進(jìn)行高溫滅菌處理。具體方法是，將PBS和超純水分別放置在不同的錐形瓶中，然后用錫箔紙和報(bào)紙進(jìn)行封口。在高壓滅菌鍋中在120 ℃的溫度下滅菌20 min。

實(shí)施例2

一種本發(fā)明所述電化學(xué)生物傳感器的制備方法：

電極修飾過程的主要步驟如下：

a、金電極首先在0.3和0.05 μm的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水反復(fù)沖洗；

b、將10μL的HAP（10μM）滴加到電極表面，在室溫下孵育2h。通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面；

至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發(fā)生的反應(yīng)，均相反應(yīng)中的主要步驟：

a、將滅菌水，1X的緩沖液（buffer），1μL Helper1，1μL不同濃度的Helper2（濃度分別是1μM，2μM，5μM，10μM，20μM），限制性核酸內(nèi)切酶Nt. BbvCI（1μL）和目標(biāo)物加入到預(yù)先準(zhǔn)備好的滅菌的離心管中，震蕩30s，然后將混勻的混合液放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

b、將a步反應(yīng)后的溶液滴加到預(yù)先修飾好HAP的電極上。然后將電極繼續(xù)放在37 ℃的恒溫箱中孵育2h；

c、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次。

以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對(duì)電極，電位設(shè)置為0到-0.5 V，脈沖寬度0.05V，掃描速率為0.06 s，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取氧化還原電信號(hào)的變化，檢測目標(biāo)物。

結(jié)果見圖3，從圖中可以看出，檢測到的電流信號(hào)隨著Helper2的濃度在0-10μM區(qū)間內(nèi)增大而增大，當(dāng)濃度超過10μM后，電流趨于穩(wěn)定。所以Helper2的最佳濃度為10μM。

實(shí)施例3

一種本發(fā)明所述電化學(xué)生物傳感器的制備方法：

a、金電極首先在0.3和0.05 μm的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水反復(fù)沖洗；

b、將10μL的不同濃度的HAP（1μM，2μM，5μM，10μM，20μM）滴加到電極表面，在室溫下孵育2h。通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面；

至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發(fā)生的反應(yīng)，均相反應(yīng)中的主要步驟：

a、將滅菌水，1X的緩沖液（buffer），Helper1（10μM）、Helper2（10μM），限制性核酸內(nèi)切酶Nt. BbvCI（1μL）和目標(biāo)物加入到預(yù)先準(zhǔn)備好的滅菌的離心管中。震蕩30s，然后將混勻的混合液放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

b、將a步反應(yīng)后的溶液滴加到預(yù)先修飾好HAP的電極上。然后將電極繼續(xù)放在37 ℃的恒溫箱中孵育2h；

c、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次。

以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對(duì)電極，電位設(shè)置為0到-0.5 V，脈沖寬度0.05V，掃描速率為0.06 s，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取氧化還原電信號(hào)的變化，檢測目標(biāo)物。

結(jié)果見圖4，從圖中可以看出，檢測到的電流信號(hào)隨著HAP的濃度在0-10μM區(qū)間內(nèi)增大而增大，當(dāng)濃度超過10μM后，電流趨于穩(wěn)定。所以HAP的最佳濃度為10μM。

實(shí)施例4

一種本發(fā)明所述電化學(xué)生物傳感器的制備方法：

a、金電極首先在0.3和0.05 μm的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水反復(fù)沖洗；

b、將10μL的HAP（10μM）滴加到電極表面，在室溫下孵育2h。通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面；

至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發(fā)生的反應(yīng)，均相反應(yīng)中的主要步驟：

a、將滅菌水，1X的緩沖液（buffer），1μL Helper1（10μM）、1μL Helper2（10μM），限制性核酸內(nèi)切酶Nt. BbvCI（1μL）和1μL不同濃度的目標(biāo)物（0nM，10nM，50nM，100nM，500nM，1μM，5μM，10μM，）加入到預(yù)先準(zhǔn)備好的滅菌的離心管中。震蕩30s，然后將混勻的混合液放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

b、將a步反應(yīng)后的溶液滴加到預(yù)先修飾好HAP的電極上。然后將電極繼續(xù)放在37 ℃的恒溫箱中孵育2h；

c、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次。

以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對(duì)電極，電位設(shè)置為0到-0.5 V，脈沖寬度0.05V，掃描速率為0.06 s，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取氧化還原電信號(hào)的變化，檢測目標(biāo)物。

檢測結(jié)果如圖5所示，圖中我們可以看到，在汞離子的濃度在10nM 到10 μM時(shí)，汞離子濃度的對(duì)數(shù)與氧化還原信號(hào)的大小成正比關(guān)系，擬合曲線：A = 0.921*logC -0.1789（A是氧化還原信號(hào)，C是汞離子的濃度），同時(shí)，我們?cè)?0nM的濃度基礎(chǔ)上繼續(xù)向更低的濃度檢測，經(jīng)檢測當(dāng)濃度低于10nM時(shí)，氧化還原信號(hào)與濃度的關(guān)系恰好不再符合擬合曲線規(guī)律，即圖中的峰值的最低點(diǎn)。因此可得到該方法的檢測下限為10nM。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受實(shí)施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110>濟(jì)南大學(xué)

<120>一種基于核酸適配體檢測氨芐青霉素的方法

<160>2

<210>1

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(41)

<223>引物

<400>1

CCC AAC TTT CCT CAG CTT GGG TAG GGC GGG 30

TTG GGT TTT TT 41

<210>2

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<212>DNA

<213>人工序列

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<221>misc_feature

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<223>引物

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CCT ACC CTT TGT TCT TTG 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223>引物

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CTT TGT TCT TTG CTG AGG 18