本發(fā)明屬于食品安全檢測和分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測雌酚和雙酚A的電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)、己烷雌酚(hexestrol，HEX)和己二烯雌酚(dienestrol，DIEN)(結(jié)構(gòu)見式1)是一類人工合成的具有雌性激素作用的藥物，因具有促進(jìn)動物生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率和減少脂肪合成等作用，曾被批準(zhǔn)為促生長劑而大量應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)。此類藥物的濫用會通過食物鏈最終到危害人類健康，引發(fā)各種嚴(yán)重后果，如發(fā)育異常、腫瘤、胎兒畸形等，因此在我國和歐美等國家已經(jīng)明令禁止在動物養(yǎng)殖過程中使用。

雙酚A(bisphenol A，BPA)(結(jié)構(gòu)見式1)在聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂等多種高分子材料生產(chǎn)中廣泛使用，并大量應(yīng)用于生活塑料制品中，如飲用水瓶、嬰兒奶瓶等，同時也應(yīng)用于金屬表面的涂層，使罐頭食品不易惡化、變質(zhì)。BPA能導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)，威脅著胎兒和兒童的健康。癌癥和新陳代謝紊亂導(dǎo)致的肥胖也被認(rèn)為與此有關(guān)。歐盟認(rèn)為含雙酚A的奶瓶會誘發(fā)性早熟，從2011年3月2日起，禁止生產(chǎn)含雙酚A的嬰兒奶瓶。

目前用于檢測雌酚和雙酚A的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等。但是這些分析方法需要大型分析儀器，操作過程繁瑣、使用及維護(hù)成本高昂，難以滿足日益增強(qiáng)的現(xiàn)場快速檢測需要，因此有必要研究建立更加高效快速、靈敏度高、成本低廉的分析測試方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測雌酚和雙酚A的電化學(xué)免疫傳感器。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測雌酚和雙酚A的方法，所述檢測方法快速、高效、靈敏度高。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

一種檢測雌酚和雙酚A的電化學(xué)免疫傳感器，包括基底玻碳電極，其特征在于，所述傳感器的基底玻碳電極表面沉積有納米金顆粒，N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺通過自組裝的方法修飾在所述的納米金顆粒表面。

所述電化學(xué)免疫傳感器采用以下方法制備：

(Ⅰ)將清潔干凈的玻碳電極浸入質(zhì)量百分濃度為0.5％的氯金酸溶液中，采用恒電位法將氯金酸還原為納米金顆粒從而沉積于玻碳電極表面；

(Ⅱ)將沉積納米金顆粒的玻碳電極浸入1mmol/L的N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺溶液中，4℃條件下反應(yīng)，制得納米金和N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺修飾的電化學(xué)免疫傳感器。

所述N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺結(jié)構(gòu)如下式所示：

所述N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺采用以下方法制備：

(a)將N-乙酰半胱胺溶于四氫呋喃，在0℃下分批加入N-溴代琥珀酰亞胺，繼續(xù)在0℃下反應(yīng)2小時，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后過中性氧化鋁柱純化，得到α-溴代N-乙酰半胱胺；

(b)將步驟(a)所述的α-溴代N-乙酰半胱胺溶于丙酮，得到A液；將己烷雌酚溶于二氧六環(huán)得到B液，A液緩慢滴入B液，再緩慢滴入碳酸鈉溶液，70℃攪拌反應(yīng)12h；抽濾，將所得濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后的產(chǎn)物溶于沸騰的氯仿，過濾，向所得濾液中加入石油醚，10000r/m下離心20分鐘，棄去上清液，殘余物真空干燥，制得N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺。

合成路線如下所示：

一種基于電化學(xué)免疫傳感器的檢測雌酚和雙酚A的方法，包括以下步驟：

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：配制含有雌酚或雙酚A的磷酸緩沖溶液，其中均含有濃度為0.5mg/L的己烷雌酚單克隆抗體，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液；

(2)工作曲線的建立：將上述電化學(xué)免疫傳感器浸入步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育，然后轉(zhuǎn)移至含有K₃[Fe(CN)₆]的KCl溶液中進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜掃描，作出Nyquist圖并計算出其電極表面的電荷轉(zhuǎn)移電阻R_ct；將傳感器未經(jīng)孵育直接在KCl溶液中所測得的R_ct值記為R₀，將傳感器在含有雌酚或雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育后在KCl溶液中所測得的R_ct值記為R_x，R_ct的變化值ΔR_ct等于R_x與R₀的差值；將所述ΔR_ct與雌酚或雙酚A的濃度對數(shù)值lgC繪制成ΔR_ct-lgC工作曲線，采用線性回歸法得到ΔR_ct-lgC線性回歸方程；

(3)雌酚和雙酚A的檢測：將待測樣品配制為含有與步驟(1)相同濃度的己烷雌酚單克隆抗體的磷酸緩沖溶液，按照與步驟(2)相同的方法對上述電化學(xué)免疫傳感器進(jìn)行孵育和電化學(xué)阻抗譜掃描，計算得到其電荷轉(zhuǎn)移電阻R_ct；根據(jù)ΔR_ct-lgC線性回歸方程，計算得到樣品中雌酚或雙酚A的濃度C。

所述雌酚分別為己烯雌酚、己烷雌酚和己二烯雌酚。

本發(fā)明提供的電化學(xué)免疫傳感器及檢測方法可用于多種實際樣品中雌酚和雙酚A的檢測，所述實際樣品包括但不限于食品、土壤、水質(zhì)、塑料等。

本發(fā)明提供的傳感器及方法用于雌酚和雙酚A的檢測，檢測限分別為己烯雌酚和己烷雌酚0.25ng/mL、己二烯雌酚0.15ng/mL、雙酚A 0.2ng/mL；線性范圍均為0.5～2000ng/mL。

本發(fā)明具有如下的有益效果：由于傳感器表面采用化學(xué)法修飾了N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺，使用后經(jīng)過簡單處理即可再生，可重復(fù)利用，減少了能源的消耗，并且所述的檢測方法具有較低的檢出限(0.15ng/mL～0.25ng/mL)和較寬的線性范圍(0.5～2000ng/mL)。

本發(fā)明的保護(hù)范圍并不以具體實施方式為限，而是由權(quán)利要求加以限定。

附圖說明

圖1為電化學(xué)免疫傳感器對己烯雌酚進(jìn)行檢測的EIS曲線圖。

圖2為電荷轉(zhuǎn)移電阻的變化值ΔR_ct與己烯雌酚濃度對數(shù)值lgC的工作曲線圖。

圖3為電化學(xué)免疫傳感器對己烷雌酚進(jìn)行檢測的EIS曲線圖。

圖4為電荷轉(zhuǎn)移電阻的變化值ΔR_ct與己烷雌酚濃度對數(shù)值lgC的工作曲線圖。

圖5為電化學(xué)免疫傳感器對己二烯雌酚進(jìn)行檢測的EIS曲線圖。

圖6為電荷轉(zhuǎn)移電阻的變化值ΔR_ct與己二烯雌酚濃度對數(shù)值lgC的工作曲線圖。

圖7為電化學(xué)免疫傳感器對雙酚A進(jìn)行檢測的EIS曲線圖。

圖8為電荷轉(zhuǎn)移電阻的變化值ΔR_ct與雙酚A濃度對數(shù)值lgC的工作曲線圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例結(jié)合附圖對本發(fā)明所述的技術(shù)方案給予進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但有必要指出以下實施例只用于對發(fā)明內(nèi)容的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。

實施例1N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺的合成

1)α-溴代N-乙酰半胱胺的合成

將N-乙酰半胱胺(119mg，1mmol)溶于10ml四氫呋喃，冷卻至0℃后分批加入N-溴代琥珀酰亞胺(NBS，195mg，1.1mmol)，繼續(xù)在0℃下反應(yīng)2小時，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后過中性氧化鋁柱純化，得產(chǎn)物α-溴代N-乙酰半胱胺135mg(產(chǎn)率68％)。

2)N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺的合成

將99mg(0.5mmol)α-溴代N-乙酰半胱胺溶于1ml丙酮中，得到A液；取122mg(0.5mmol)己烷雌酚溶于5ml二氧六環(huán)得B液，A液緩慢滴入B液，再緩慢滴入0.5ml的碳酸鈉溶液(1mol/L)，70℃攪拌反應(yīng)12h。抽濾，將所得濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后的產(chǎn)物溶于15ml沸騰的氯仿，過濾，向所得濾液中加入石油醚，10000r/m下離心20分鐘，棄去上清液，殘余物真空干燥得產(chǎn)物N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺81mg(產(chǎn)率45％)。

合成路線如下所示：

實施例2對己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測

1)電化學(xué)免疫傳感器的制備：

將直徑為3mm的玻碳電極依次用直徑為0.3μm和0.05μm的Al₂O₃拋光粉打磨，依次用無水乙醇-蒸餾水、蒸餾水超聲清洗2min，再用蒸餾水沖洗干凈。將上述電極置于1％的氯金酸溶液中進(jìn)行恒電位電化學(xué)沉積(電壓為-0.2V，沉積時間30s)，用去離子水沖洗干凈后浸入1mmol/L的N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺溶液中，置于4℃冰箱中反應(yīng)24小時，即可得到納米金/N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺修飾的電化學(xué)免疫傳感器。

2)己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測：

將步驟1)中所述的電化學(xué)免疫傳感器浸入總體積為50μL的含有濃度為0.5mg/L的己烷雌酚單克隆抗體和一系列不同濃度的己烯雌酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，37℃孵育30分鐘，用磷酸緩沖溶液沖洗干凈后置于含有2mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]的KCl溶液(0.1mol/L)中進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜(EIS)掃描，作出Nyquist圖并計算出其電極表面的電荷轉(zhuǎn)移電阻(R_ct)。EIS曲線圖如圖1所示，圖中曲線從上到下濃度依次為0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL。將傳感器未經(jīng)孵育直接在KCl溶液中所測得的R_ct值記為R₀，與含有一定濃度己烯雌酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液孵育后所測得的R_ct值記為R_x，R_ct的變化值ΔR_ct等于R_x與R₀的差值；將所述ΔR_ct與己烯雌酚的濃度對數(shù)值lgC(ng/mL)繪制成ΔR_ct-lgC工作曲線。工作曲線圖如圖2所示，采用線性回歸法得到其ΔR_ct-lgC線性回歸方程為ΔR_ct(Ω)＝487.7575-86.5832lgC(ng/mL)，己烯雌酚的濃度在0.5～2000ng/mL范圍內(nèi)ΔR_ct與lgC成正比，線性相關(guān)系數(shù)為0.9962。以空白標(biāo)樣測定值標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍(3σ)作為樣品檢測限，重復(fù)10次實驗得出，以上述方法檢測己烯雌酚的樣品檢測限為0.25ng/mL。將待測樣品在上述條件下進(jìn)行孵育和掃描并計算出其電荷轉(zhuǎn)移電阻R_ct；根據(jù)R_ct的變化值ΔR_ct和ΔR_ct-lgC線性回歸方程，可計算出待測樣品中己烯雌酚的濃度C。

實施例3對己烷雌酚標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測

以與實施例2步驟1)完全相同的方法制備納米金/N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺修飾的電化學(xué)免疫傳感器，將其浸入總體積為50μL的含有濃度為0.5mg/L的己烷雌酚單克隆抗體和一系列不同濃度的己烷雌酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，再用與實施例2步驟2)相同的方法進(jìn)行EIS掃描和數(shù)據(jù)處理。EIS曲線圖如圖3所示，圖中曲線從上到下濃度依次為0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL。所得到的電荷轉(zhuǎn)移電阻變化值ΔR_ct與己烷雌酚濃度對數(shù)值lgC在己烷雌酚濃度在0.5～2000ng/mL之間時成線性關(guān)系，工作曲線圖如圖4所示，線性相關(guān)系數(shù)為0.9936，線性回歸方程為ΔR_ct(Ω)＝474.9995-102.8059lgC(ng/mL)。以空白標(biāo)樣測定值標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍(3σ)作為樣品檢測限，重復(fù)10次實驗得出，以上述方法檢測己烷雌酚的樣品檢測限為0.25ng/mL。

實施例4對己二烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測

以與實施例2步驟1)完全相同的方法制備納米金/N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺修飾的電化學(xué)免疫傳感器，將其浸入總體積為50μL的含有濃度為0.5mg/L的己烷雌酚單克隆抗體和一系列不同濃度的己二烯雌酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，再用與實施例2步驟2)相同的方法進(jìn)行EIS掃描和數(shù)據(jù)處理。EIS曲線圖如圖5所示，圖中曲線從上到下濃度依次為0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL。所得到的電荷轉(zhuǎn)移電阻變化值ΔR_ct與己二烯雌酚濃度對數(shù)值lgC在己二烯雌酚濃度在0.5～2000ng/mL之間時成線性關(guān)系，工作曲線圖如圖6所示，線性相關(guān)系數(shù)為0.9933，線性回歸方程為ΔR_ct(Ω)＝407.9338-72.3777lgC(ng/mL)。以空白標(biāo)樣測定值標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍(3σ)作為樣品檢測限，重復(fù)10次實驗得出，以上述方法檢測己二烯雌酚的樣品檢測限為0.15ng/mL。

實施例5對雙酚A標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測

以與實施例2步驟1)完全相同的方法制備納米金/N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺修飾的電化學(xué)免疫傳感器，將其浸入總體積為50μL的含有濃度為0.5mg/L的己烷雌酚單克隆抗體和一系列不同濃度的雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，再用與實施例2步驟2)相同的方法進(jìn)行EIS掃描和數(shù)據(jù)處理。EIS曲線圖如圖7所示，圖中曲線從上到下濃度依次為0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、200ng/mL和1000ng/mL。所得到的電荷轉(zhuǎn)移電阻變化值ΔR_ct與雙酚A濃度對數(shù)值lgC在己二烯雌酚濃度在0.5～1000ng/mL之間時成線性關(guān)系，工作曲線圖如圖8所示，線性相關(guān)系數(shù)為0.9903，線性回歸方程為ΔR_ct(Ω)＝359.0275-60.9422lgC(ng/mL)。以空白標(biāo)樣測定值標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍(3σ)作為樣品檢測限，重復(fù)10次實驗得出，以上述方法檢測雙酚A的樣品檢測限為0.20ng/mL。

實施例6奶粉中加標(biāo)己烯雌酚的測定

1)奶粉樣品的處理：稱取1±0.0050g奶粉于到10mL的樣品管中，加入己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液和6mL正己烷，混合物超聲分散30分鐘，于2000r/m下離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至氮吹管中，殘渣用3mL的相同提取液重復(fù)提取1次，上清液合并在氮吹管中。提取物在氮吹條件下于50℃溫度下濃縮蒸發(fā)，濃縮物加入1mL的pH為7.4磷酸緩沖溶液溶解后用于電化學(xué)分析。

2)奶粉樣品中加標(biāo)己烯雌酚的測定：分別取不同體積的奶粉提取液樣品，加入到磷酸緩沖溶液中配制成一系列含有不同濃度己烯雌酚和相同濃度己烷雌酚單克隆抗體且總體積均為200μL的孵育液。將納米金/N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺修飾的電化學(xué)免疫傳感器浸入上述孵育液中，采用與實施例2中步驟2)相同的方法進(jìn)行孵育、EIS掃描和數(shù)據(jù)處理，計算出己烯雌酚的濃度C，檢測回收率結(jié)果見表1。

表1為加標(biāo)奶粉中的己烯雌酚濃度的回收率結(jié)果

實施例7豬肉中加標(biāo)己烷雌酚的測定

1)豬肉樣品的處理：稱取1±0.0050g豬肉于到10mL的樣品管中，加入己烷雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液和3mL乙腈-丙酮提取液(V：V＝4：1)，混合物超聲分散30分鐘，于2000r/m下離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至氮吹管中，殘渣用3mL的相同提取液重復(fù)提取1次，上清液合并在氮吹管中。提取物在氮吹條件下于50℃溫度下濃縮蒸發(fā)，濃縮物加入1mL的pH為7.4磷酸緩沖溶液溶解后用于電化學(xué)分析。

2)豬肉樣品中加標(biāo)己烷雌酚的測定：分別取不同體積的豬肉提取液樣品，加入到磷酸緩沖溶液中配制成一系列含有不同濃度己烷雌酚和相同濃度己烷雌酚單克隆抗體且總體積均為200μL的孵育液。將納米金/N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺修飾的電化學(xué)免疫傳感器浸入上述孵育液中，采用與實施例2中步驟2)相同的方法進(jìn)行孵育、EIS掃描和數(shù)據(jù)處理，計算出己烷雌酚的濃度C，檢測回收率結(jié)果見表2。

表2為加標(biāo)豬肉中的己烷雌酚濃度的回收率結(jié)果

按照與實施例7基本相同的方法，也可進(jìn)行各種動物源性食品，包括豬、牛、羊等常用動物的肉制品、內(nèi)臟等中含有的己烯雌酚、己二烯雌酚的檢測。

實施例8土壤樣品中加標(biāo)己二烯雌酚的測定

1)土壤樣品的處理：稱取1±0.0050g土壤，研磨粉碎后加入到10mL的樣品管中，加入己二烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液和3mL乙腈-丙酮提取液(V：V＝4：1)，混合物超聲分散30分鐘，于2000r/m下離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至氮吹管中，殘渣用3mL的相同提取液重復(fù)提取1次，上清液合并在氮吹管中。提取物在氮吹條件下于50℃溫度下濃縮蒸發(fā)，濃縮物加入1mL的pH為7.4磷酸緩沖溶液溶解后用于電化學(xué)分析。

2)土壤樣品中加標(biāo)己二烯雌酚的測定：分別取不同體積的土壤提取液樣品，加入到磷酸緩沖溶液中配制成一系列含有不同濃度己二烯雌酚和相同濃度己烷雌酚單克隆抗體且總體積均為200μL的孵育液。將納米金/N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺修飾的電化學(xué)免疫傳感器浸入上述孵育液中，采用與實施例2中步驟2)相同的方法進(jìn)行孵育、EIS掃描和數(shù)據(jù)處理，計算出己二烯雌酚的濃度C，檢測回收率結(jié)果見表3。

表3為免疫傳感器檢測加標(biāo)土壤中的己二烯雌酚濃度的回收率