發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于評價(jià)基于蛋白質(zhì)的制劑相對于潤滑容器的潤滑劑的穩(wěn)定性的方法，其中所述制劑預(yù)期被儲(chǔ)存在所述容器中。本發(fā)明還涉及使基于蛋白質(zhì)的制劑適應(yīng)潤滑容器的潤滑劑的方法和選擇適應(yīng)潤滑預(yù)期儲(chǔ)存基于蛋白質(zhì)的制劑的容器的潤滑劑的方法，以便改善所述制劑相對于所述潤滑劑的穩(wěn)定性。

背景技術(shù)：

預(yù)裝填的注射裝置是將藥物或疫苗遞送給患者的常見的容器，并且包括注射器、藥筒和自動(dòng)注射器。它們通常包括滑動(dòng)接合(glidingengagement)進(jìn)入容器的密封塞，所述容器中填充有藥物組合物，以便給從業(yè)醫(yī)師提供隨時(shí)可用的注射裝置。

當(dāng)與恰好在注射前使用小瓶儲(chǔ)存的藥物組合物填充的空注射裝置比較時(shí)，預(yù)裝填注射裝置的應(yīng)用產(chǎn)生了幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。特別地，因?yàn)橄拗圃谧⑸淝爸苽洌灶A(yù)裝填的注射裝置提供給藥誤差的減小、最小化的微生物污染風(fēng)險(xiǎn)和對于從業(yè)醫(yī)師使用的增強(qiáng)的便利性。此外，這類預(yù)裝填的容器促進(jìn)并且簡化了患者的自我給藥，從而能夠降低治療成本并且增加患者的依從性。最終，預(yù)裝填的注射裝置減少了有價(jià)值的藥物組合物的損耗，這種情況通常在將藥物組合物從小瓶轉(zhuǎn)至無預(yù)裝填注射裝置時(shí)發(fā)生。這對于指定的制造批次藥物產(chǎn)品而言產(chǎn)生了更大數(shù)量的可能的注射劑，由此降低了購買和供應(yīng)鏈的成本。

然而，連同這些改善，藥物組合物在預(yù)裝填注射裝置中的商業(yè)化賦予其自身挑戰(zhàn)的集合，特別是在敏感性生物制品的情況中。實(shí)際上，生物制品例如細(xì)胞因子、單克隆抗體、基于核酸的產(chǎn)品和疫苗是高度復(fù)雜的分子，并且經(jīng)歷可能影響療法效能和患者安全性的各種降解途徑。

例如，在預(yù)裝填注射器的情況中，例如鎢、基于硅酮的潤滑劑和粘著劑這樣的組分均被鑒定為對于生物制品的不相容性的潛在來源。潤滑劑通常且更具體地是硅油已經(jīng)收到制劑科學(xué)家的增加的關(guān)注，以便理解其與蛋白質(zhì)和疫苗的相容性。醫(yī)用級硅油例如聚-(二甲基硅氧烷)(pdms)因其潤滑劑特性而常用于注射裝置：它們確保在將藥物組合物注射給患者的過程中塞子至始至終在注射裝置套筒上有效滑動(dòng)。然而，已經(jīng)報(bào)道，硅油牽涉治療性蛋白質(zhì)降解，例如在包括疫苗的藥物制劑中形成顆粒。這些顆粒通常包含帶有輔助劑和/或硅油的聚集的蛋白質(zhì)。

除蛋白質(zhì)活性明顯缺失外，不期望的臨床作用和安全性擔(dān)憂因這類聚集的蛋白質(zhì)的胃腸外施用產(chǎn)生。此外，聚集水平甚至在極低百分比，例如1％也可能產(chǎn)生關(guān)于目前最佳實(shí)踐和管理所不接受的藥物組合物。然而，當(dāng)儲(chǔ)存于潤滑容器中時(shí)，基于蛋白質(zhì)的制劑的穩(wěn)定性評價(jià)可能是困難和耗時(shí)的。此外，使基于蛋白質(zhì)的制劑適應(yīng)這類容器通常是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)的且在產(chǎn)品研發(fā)的后期進(jìn)行。一些基于蛋白質(zhì)的藥物組合物由此可能到達(dá)了研發(fā)的更后期階段，然后在儲(chǔ)存于注射裝置時(shí)鑒定了主要穩(wěn)定性問題。這可能導(dǎo)致昂貴的再配制步驟且對于患者而言無法獲得珍貴的藥物組合物。

最終，當(dāng)?shù)玫綆追N潤滑劑時(shí)，無法得到選擇針對指定基于蛋白質(zhì)的組合物的最適合的潤滑劑的快速方法。耗時(shí)的穩(wěn)定性研究由此必須由醫(yī)療公司針對不同的注射裝置和潤滑劑組成進(jìn)行，而沒有任何最富有希望的解決方案的候選清單的可能性。

作為結(jié)果，對于快速和有效的方法存在強(qiáng)烈需求，所述方法用于評價(jià)基于蛋白質(zhì)的制劑相對于潤滑容器的潤滑劑的穩(wěn)定性，其中所述制劑預(yù)期被儲(chǔ)存在所述容器中。此外，對于可靠的方法存在需求，所述方法用于指導(dǎo)預(yù)期儲(chǔ)存于潤滑容器中的基于蛋白質(zhì)的制劑的配制。最終，選擇用于預(yù)期儲(chǔ)存基于蛋白質(zhì)的制劑的容器的最適合的潤滑劑的方法也是期望的。

發(fā)明概述

因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面是用于評價(jià)基于蛋白質(zhì)的制劑相對于潤滑容器的潤滑劑的穩(wěn)定性的方法，所述基于蛋白質(zhì)的制劑包含蛋白質(zhì)、肽和/或蛋白質(zhì)衍生物和緩沖劑，其中所述制劑預(yù)期要被儲(chǔ)存在所述容器中，所述方法包括：

a)評價(jià)所述緩沖劑與所述潤滑劑之間界面張力隨時(shí)間的減??；

b)評價(jià)所述基于蛋白質(zhì)的制劑與所述潤滑劑之間的界面張力隨時(shí)間的減??；

c)通過比較步驟b)中評價(jià)的減小與步驟a)中評價(jià)的減小來鑒定與所述潤滑劑發(fā)生相互作用的所述基于蛋白質(zhì)的制劑的至少一種組分。

所述方法使用簡單和低廉的界面張力測量方法對基于蛋白質(zhì)的制劑相對于潤滑容器的潤滑劑的穩(wěn)定性提供極為良好的洞察力。具體地，所述方法允許測定所述蛋白質(zhì)與所述潤滑劑之間或所述緩沖劑與所述潤滑劑之間是否發(fā)生相互作用。因此，允許在制劑研發(fā)的最早期階段檢測到穩(wěn)定性問題并且在制劑研發(fā)更后期階段過程中避免昂貴的再配制步驟。所述方法由此在緩解基于蛋白質(zhì)的制劑研發(fā)過程中的穩(wěn)定性風(fēng)險(xiǎn)方面和為制藥公司節(jié)約時(shí)間和資金方面是有價(jià)值的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括評價(jià)步驟a)中的緩沖劑的每種組分與潤滑劑之間的界面張力的減小。實(shí)際上，基于蛋白質(zhì)的制劑和潤滑劑的不穩(wěn)定性可能與所述制劑的任意組分相關(guān)，而并非僅僅是與蛋白質(zhì)相關(guān)。所述方法由此用于鑒定緩沖劑的所有組分中發(fā)生相互作用的組分。

本發(fā)明的第二個(gè)方面在于改善所述基于蛋白質(zhì)的制劑相對于所述容器的潤滑劑的穩(wěn)定性的方法。在第一種途徑中，所述方法包括：

a)根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面，評價(jià)基于蛋白質(zhì)的制劑的穩(wěn)定性；

b)選擇輔助劑，所述輔助劑帶來與所述潤滑劑的界面張力隨時(shí)間的減小高于所述基于蛋白質(zhì)的制劑與所述潤滑劑的界面張力隨時(shí)間的減??；

c)通過將所述選擇的輔助劑添加到所述基于蛋白質(zhì)的制劑中使所述基于蛋白質(zhì)的制劑適應(yīng)。

這種輔助劑可能已經(jīng)存在于緩沖劑中，且其濃度由此得到增加，以便與本發(fā)明第一個(gè)方面中檢測到的相互作用，例如所述蛋白質(zhì)與所述潤滑劑之間的相互作用競爭。因此，不期望的相互作用被非敏感性相互作用替代，所述非敏感性相互作用不會(huì)阻礙所述基于蛋白質(zhì)的制劑的穩(wěn)定性或效能。所添加的輔助劑還可以是不存在于所述基于蛋白質(zhì)的制劑中的輔助劑，然后通過本方法使所述制劑適應(yīng)。例如，所述輔助劑可以是表面活性劑，例如聚山梨酯80。

在第二種途徑中，所述方法包括：

a)根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面，評價(jià)基于蛋白質(zhì)的制劑的穩(wěn)定性；

b)選擇輔助劑，所述輔助劑能夠絡(luò)合(complexing)所述基于蛋白質(zhì)的制劑的蛋白質(zhì)；

c)通過添加所述選擇的輔助劑，使所述基于蛋白質(zhì)的制劑適應(yīng)，以便至少部分減少所述基于蛋白質(zhì)的制劑與所述潤滑劑之間的界面張力隨時(shí)間的減小。

在這種第二種途徑中，通過所述蛋白質(zhì)與所述輔助劑之間形成的絡(luò)合物，防止本發(fā)明第一個(gè)方面中鑒定的不期望的相互作用，且所適應(yīng)的基于蛋白質(zhì)的制劑不會(huì)呈現(xiàn)任何與所述潤滑劑的界面張力隨時(shí)間的減小。例如，所添加的輔助劑可以是鹽，例如鋁鹽，例如氫氧化鋁。

本發(fā)明第二個(gè)方面的兩種途徑提供再配制基于蛋白質(zhì)的制劑的簡便方法，所述基于蛋白質(zhì)的制劑被發(fā)現(xiàn)相對于潤滑容器中的指定潤滑劑不穩(wěn)定。通過使用界面張力作為指導(dǎo)，可以預(yù)期和減少昂貴和冗長的穩(wěn)定性研究。

本發(fā)明的第三個(gè)方面是選擇適應(yīng)容器的潤滑劑的方法，所述容器預(yù)期用于儲(chǔ)存基于蛋白質(zhì)的制劑，所述方法包括：

a)提供至少一種所研究的潤滑劑；

b)通過本發(fā)明第一個(gè)方面的方法，評價(jià)所述基于蛋白質(zhì)的制劑相對于所述至少一種潤滑劑的穩(wěn)定性；

c)測定所述基于蛋白質(zhì)的制劑對步驟b)中鑒定的相互作用的敏感性；

d)選擇潤滑劑，其導(dǎo)致與所述基于蛋白質(zhì)的制劑的不敏感相互作用或使所述基于蛋白質(zhì)的制劑適應(yīng)，其中通過本發(fā)明第二個(gè)方面的方法進(jìn)行。

所述方法能夠選擇最適應(yīng)特定的基于蛋白質(zhì)的制劑的潤滑劑。

更具體地，步驟b)允許鑒定與步驟a)所要研究的至少一種潤滑劑發(fā)生相互作用的所述基于蛋白質(zhì)的制劑的至少一種組分。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，該組分通過下列鑒定：比較所述基于蛋白質(zhì)的制劑與所述潤滑劑之間的界面張力隨時(shí)間的減小與所述緩沖劑的每種組分與所述潤滑劑之間的界面張力隨時(shí)間的減小。

也就是說，當(dāng)全部潤滑劑與所述基于蛋白質(zhì)的制劑發(fā)生相互作用時(shí)，所述緩沖劑的每種組分與所述潤滑劑之間的界面張力隨時(shí)間的減小的隨后比較是唯一必不可少的。否則，應(yīng)當(dāng)選擇與所述基于蛋白質(zhì)的制劑不發(fā)生相互作用的潤滑劑。

一旦根據(jù)步驟b)已經(jīng)鑒定與所述潤滑劑發(fā)生相互作用的所述基于蛋白質(zhì)的制劑的組分，則步驟c)進(jìn)一步允許測定所述基于蛋白質(zhì)的制劑對于所述組分與所述潤滑劑之間的相互作用的敏感性。然后，在其中至少一種潤滑劑導(dǎo)致與所述基于蛋白質(zhì)的制劑的不敏感性相互作用的情況中，選擇這種潤滑劑。在其中全部潤滑劑導(dǎo)致與所述基于蛋白質(zhì)的制劑的敏感性相互作用的情況中，通過向所述制劑中添加輔助劑使所述基于蛋白質(zhì)的制劑適應(yīng)，所述制劑中添加輔助劑能夠帶來界面張力隨時(shí)間的更高的減小，或者可以使用另外的潤滑劑進(jìn)行目前的研究。

步驟a)和b)是快速而價(jià)格低廉的。然而，根據(jù)步驟c)和d)測定基于蛋白質(zhì)的制劑對相互作用的敏感性可能需要本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的額外的實(shí)驗(yàn)并且根據(jù)研究中的特定相互作用選擇。例如，如果在緩沖劑與潤滑劑之間鑒定了相互作用，則可能需要ph控制。然而，如果與蛋白質(zhì)發(fā)生有限的相互作用，則研究這種相互作用蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和折疊可能需要圓二色性、紅外和拉曼光譜法或核磁共振。

界面張力由此用作研究基于蛋白質(zhì)的制劑在潤滑容器中的穩(wěn)定性的強(qiáng)有力工具。當(dāng)檢測到相互作用時(shí)，界面張力也是使所述基于蛋白質(zhì)的制劑適應(yīng)潤滑容器或選擇與所述基于蛋白質(zhì)的制劑相容的潤滑劑的精確指導(dǎo)。

附圖簡述

圖1是顯示兩種針對腦膜炎的疫苗即疫苗a和疫苗b及其相應(yīng)的緩沖劑即疫苗a緩沖劑和疫苗b緩沖劑(它們是不含疫苗蛋白質(zhì)的疫苗制劑)的界面張力隨時(shí)間的減小的示意圖。

圖2a-2d是顯示通過分別對疫苗a、疫苗緩沖劑a(圖2a和2c)、疫苗b和疫苗緩沖劑b(圖2b和2d)的微流量(micro-flow)成像測定的顆粒濃度的示意圖。圖2a和2b是球形顆粒濃度，且圖2c和2d是非球形顆粒濃度。

圖3a-3d是顯示通過分別對疫苗a、疫苗緩沖劑a(圖3a和3c)、疫苗b和疫苗緩沖劑b(圖3b和3d)的共振質(zhì)量測量所測定的顆粒濃度的示意圖。圖3a和3b是正電顆粒(positiveparticles)濃度，且圖3c和3d是負(fù)電(negativeparticles)顆粒濃度。

圖4是概括本發(fā)明第一個(gè)方面的方法的流程圖。

圖5是顯示硅油分別與3×10^-6m濃度的聚山梨酯80(十字形)、3×10^-4m濃度的聚山梨酯80(三角形)、疫苗b(空心圓圈)和含有3×10^-4m濃度的聚山梨酯80的疫苗b(實(shí)心圓圈)之間的界面張力隨時(shí)間的減小的示意圖。

圖6a和6b是通過分別對疫苗b、疫苗緩沖劑b、含有3×10^-4m濃度的聚山梨酯80的疫苗b和含有3×10^-4m濃度的聚山梨酯80的疫苗緩沖劑b的微流量成像測定的顆粒濃度的示意圖。

圖7a和7b是通過分別對疫苗b、疫苗緩沖劑b、含有3×10^-4m濃度的聚山梨酯80的疫苗b和含有3×10^-4m濃度的聚山梨酯80的疫苗緩沖劑b的共振質(zhì)量測量所測定的顆粒濃度的示意圖。

圖8是顯示硅油分別與1g/l濃度的胰島素、10^-4m濃度的聚山梨酯80(菱形)、3×10^-4m濃度的聚山梨酯80(三角形)和使用10^-4m濃度的聚山梨酯80適應(yīng)的胰島素(正方形)之間的界面張力隨時(shí)間減小的示意圖。

圖9是顯示硅油分別與疫苗緩沖劑a(空心圓圈)、氫氧化鋁(空心三角形)、疫苗a(實(shí)心圓圈)和含有氫氧化鋁的疫苗(實(shí)心圓圈)之間的界面張力隨時(shí)間減小的示意圖。

圖10是概括本發(fā)明第三個(gè)方面的方法的流程圖。

發(fā)明詳述

在本說明書中，潤滑容器可以是適應(yīng)儲(chǔ)存基于蛋白質(zhì)的制劑并且包括塞子和預(yù)期有利于塞子在容器內(nèi)滑動(dòng)的潤滑劑的任意容器。所述容器可以是，例如，小瓶、藥筒或注射器。術(shù)語“基于蛋白質(zhì)的制劑”用于指包含肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)衍生物的任意預(yù)防性或治療性藥物制劑。措詞“疫苗”用于指包括疫苗蛋白質(zhì)和所有輔助劑和溶劑的疫苗制劑。“疫苗蛋白質(zhì)”用于指僅包括抗原和載體蛋白、但不含輔助劑和溶劑的疫苗蛋白質(zhì)?！耙呙缇彌_劑”用于指不含疫苗蛋白質(zhì)、即僅包含輔助劑和溶劑的疫苗制劑。

將界面張力定義為因兩種液體之間的分子間相互作用差異導(dǎo)致的這兩種不互溶液體之間的界面上存在的張力。在大量液體中，每種分子被相鄰分子以全方位等同吸引。然而，位于與不互溶液體界面上的分子不會(huì)被另一種液體分子吸引，而僅被其類似的相鄰分子(neighbors)吸引。這產(chǎn)生誘導(dǎo)液體表面收縮而將界面能降至最低的張力。本發(fā)明使用界面張力作為基于蛋白質(zhì)的制劑領(lǐng)域中的創(chuàng)新工具。

本發(fā)明的第一個(gè)方面在于在評價(jià)基于蛋白質(zhì)的制劑相對于潤滑容器的潤滑劑的穩(wěn)定性的方法中使用界面張力。所述方法的意義已經(jīng)使用兩種多綴合的(polyconjugated)針對腦膜炎的疫苗、在常用的硅油的存在下得以證實(shí)，所述針對腦膜炎的疫苗即疫苗a和b，所述硅油即聚-(二甲基硅氧烷)–參見材料和方法。

下列方法針對疫苗a和b進(jìn)行：

在第一步中，評價(jià)疫苗緩沖劑與硅油(聚-(二甲基硅氧烷))之間的界面張力隨時(shí)間的減小，得到曲線1。如上所述，疫苗緩沖劑相當(dāng)于不含疫苗蛋白質(zhì)的疫苗制劑。

在第二步中，評價(jià)所述疫苗與硅油之間的界面張力隨時(shí)間的減小，得到曲線2。

在第三步中比較曲線1和2，例如，根據(jù)同一示意圖上的疊加(superimposition)，如圖1中所示。

一般而言，如圖1中所示，疫苗a和疫苗b導(dǎo)致與硅油的界面張力隨時(shí)間顯著減小。這些使用兩種疫苗得到的減小由此證實(shí)硅油與所述疫苗之間存在相互作用，這類相互作用導(dǎo)致界面穩(wěn)定且由此減小所述疫苗與不互溶硅油之間的張力。

然而，針對疫苗a和疫苗b得到的曲線呈現(xiàn)兩種不同的圖形。實(shí)際上，在疫苗a的情況中，曲線(圖1中的實(shí)心三角形)以適度的斜率有規(guī)則地下降，導(dǎo)致界面張力隨實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間(即500秒)減少約13％(從41.6至36.2mn/m)。相反，使用疫苗b得到的界面張力曲線(圖1中的實(shí)心圓圈)顯示在前15秒明顯的斜度，并且在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)在相同時(shí)間期限內(nèi)達(dá)到超過20％的減少(從43.9至35.0mn/m)。

現(xiàn)在注意使用疫苗緩沖劑a(圖1中的空心三角形)和b(圖1中的空心圓圈)得到的曲線，未觀察到界面張力隨時(shí)間明顯下降，這表明沒有相互作用能夠穩(wěn)定保持高張力狀態(tài)的界面。由于使用所述疫苗觀察到隨時(shí)間界面張力減小，而使用疫苗緩沖劑(不含疫苗蛋白質(zhì)的疫苗制劑)未觀察到這一結(jié)果，所以可以得出如下結(jié)論：疫苗蛋白質(zhì)導(dǎo)致界面張力隨時(shí)間減小。這些結(jié)果由此證實(shí)兩種疫苗蛋白質(zhì)與硅油之間明顯的相互作用，疫苗b與硅油的相互作用高于疫苗a。

不希望受到任何理論約束，這一結(jié)果可以解釋為：疫苗蛋白質(zhì)b遷移至與硅油的界面上，導(dǎo)致界面張力快速下降(在前15秒)。一旦在界面上，則疫苗b的蛋白質(zhì)可以以更有活力的有利構(gòu)象解折疊(unfold)，提供了界面張力再下降。然后解折疊的蛋白質(zhì)與疫苗制劑發(fā)生相互作用，并且產(chǎn)生蛋白質(zhì)聚集物，在硅油與疫苗b之間的界面由此為疫苗蛋白質(zhì)的聚集提供成核位點(diǎn)。

相反，疫苗a顯示與硅油的相互作用更有限，表明蛋白質(zhì)緩慢地遷移至所述界面且蛋白質(zhì)聚集物的產(chǎn)生有限。

該分析由通過使用兩種不同分析技術(shù)得到的結(jié)果支持，即微流量成像(mfi^tm)和共振質(zhì)量測量(rmm)。

mfi^tm是流式顯微技術(shù)，其俘獲流動(dòng)物流(flowingstream)中懸浮顆粒的圖像。得到不同的放大設(shè)定點(diǎn)以便適合期望的粒徑和圖像質(zhì)量。然后進(jìn)一步分析顆粒圖像以便區(qū)分球形顆粒和非球形顆粒。在目前的情況中，球形顆?？梢詺w因于硅酮顆粒，而非球形顆?？梢詺w因于蛋白質(zhì)聚集物，即共同聚集的解折疊的蛋白質(zhì)。

在本實(shí)驗(yàn)中，分別給硅油潤滑的注射器裝填疫苗a、疫苗緩沖劑a、疫苗b和疫苗緩沖劑b。然后在裝填后即刻(t0)和25℃下7-天溫育(t7)后測定球形和非球形顆粒的濃度。

通過mfi^tm得到的數(shù)據(jù)顯示在圖2a-2d中，其中圖2a和2b顯示球形顆粒的數(shù)字濃度(每立方厘米中的顆粒數(shù))，且圖2c和2d顯示非球形顆粒的濃度。疫苗a和疫苗緩沖劑a的顆粒濃度如圖2a和2c中所示，而圖2b和2d展示出對疫苗b和疫苗緩沖劑b測定的濃度。

正如圖2a中所觀察到的，儲(chǔ)存后，疫苗a的球形顆粒的濃度保持在369個(gè)顆粒/cc(part/cc)的有限值，而疫苗緩沖劑a的球形顆粒的濃度保持在1172個(gè)顆粒/cc。關(guān)于疫苗b，裝填后極高濃度的球形顆粒在圖2b中可見，達(dá)到7543個(gè)顆粒/cc，7-天溫育后為13959個(gè)顆粒/cc，而疫苗緩沖劑b產(chǎn)生的顆粒濃度低于1800個(gè)顆粒/cc。

使用非球形顆粒得到類似的結(jié)果，這歸因于蛋白質(zhì)聚集物，正如在圖2c和2d中觀察到的。實(shí)際上，在7天后測定裝填疫苗a的潤滑的注射器為673個(gè)顆粒/cc的有限濃度，而疫苗緩沖劑a為283個(gè)顆粒/cc(圖2c)，但在裝填疫苗b的潤滑的注射器中非球形顆粒達(dá)到極高濃度(圖2d)，7天后高于21000個(gè)顆粒/cc。當(dāng)在潤滑容器中溫育7天時(shí)，疫苗緩沖劑b再次僅產(chǎn)生444個(gè)顆粒/cc的有限量的非球形顆粒。

根據(jù)使用本發(fā)明第一個(gè)方面的方法得到的結(jié)果，基于界面張力的減小，這些結(jié)果證實(shí)疫苗b蛋白質(zhì)與硅油之間的強(qiáng)相互作用。

除mfi^tm外，還已經(jīng)通過使用共振質(zhì)量測量(rmm)采集數(shù)據(jù)。rmm基于振動(dòng)微流體回路，其允許通過測定振動(dòng)頻移來測定通過它循環(huán)的顆粒數(shù)量和尺寸。本實(shí)驗(yàn)允許測定小于mfi^tm尺寸的顆粒以及將硅油液滴與蛋白質(zhì)聚集物區(qū)分開，因?yàn)檎駝?dòng)頻移取決于顆粒質(zhì)量。因此，具有低于分析介質(zhì)(本實(shí)驗(yàn)中相應(yīng)的疫苗緩沖劑)的密度的顆粒得到正位移(positiveshift)，并且可以歸因于硅油。相反，具有高于分析介質(zhì)的密度的顆粒得到負(fù)位移(negativeshift)，并且可以歸因于蛋白質(zhì)聚集物。

這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖3a-3d中可見：圖3a和3b相當(dāng)于正電顆粒的濃度，而圖3c和3d提供有關(guān)負(fù)電顆粒的濃度。得到的數(shù)據(jù)顯示混合后(t0)對于疫苗a79,933個(gè)顆粒/cc的低濃度正電顆粒(歸因于硅油)和對于疫苗緩沖劑a25,867個(gè)顆粒/cc以及7-天儲(chǔ)存后甚至更低的濃度(t7，參見圖3a)。相反，正如在圖3b中觀察到的，疫苗b在潤滑容器中溫育過程產(chǎn)生高濃度的正電顆粒(高于1×10⁶個(gè)顆粒/cc)，而疫苗a或b的緩沖劑不會(huì)產(chǎn)生顯著顆粒濃度，低于95,000個(gè)顆粒/cc?，F(xiàn)在關(guān)注歸因于蛋白質(zhì)聚集物的負(fù)電顆粒的測量值(圖3c和3d)：疫苗a和疫苗緩沖劑a不會(huì)產(chǎn)生顯著濃度的顆粒，低于100,000個(gè)顆粒/cc，且疫苗緩沖劑b低于170,000個(gè)顆粒/cc。相反，裝填疫苗b的潤滑注射器在混合后(t0)產(chǎn)生高于460,000個(gè)負(fù)電顆粒/立方厘米的顯著濃度，所述濃度在7天后(t7)顯示，其明顯升高超過600％，達(dá)到3.1×10⁶個(gè)顆粒/cc。

因此，能夠從這些不同的實(shí)驗(yàn)中得出如下結(jié)論：疫苗b與硅油之間發(fā)生顯著相互作用。這種相互作用可以歸因于存在于疫苗b中的疫苗蛋白質(zhì)的性質(zhì)，因?yàn)橐呙缇彌_劑b在硅油的存在下不會(huì)產(chǎn)生顯著濃度的顆粒。

因此，mfi^tm和rmm的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提供根據(jù)本發(fā)明使用界面張力測量值的方法得到結(jié)論的強(qiáng)有力支持：疫苗b與硅油不相容，而疫苗b制劑或作為潤滑劑的硅油應(yīng)當(dāng)改變，以便將穩(wěn)定的疫苗b遞送入用硅油潤滑的預(yù)裝填容器中。這也驗(yàn)證了界面張力作為得到針對基于蛋白質(zhì)的制劑在潤滑容器中的穩(wěn)定性的洞察力的快速和強(qiáng)有力工具。實(shí)際上，潤滑劑與基于蛋白質(zhì)的制劑例如疫苗之間的界面張力隨時(shí)間的減小與低穩(wěn)定性和強(qiáng)濃度蛋白質(zhì)聚集物的生成相關(guān)。

在歸因于硅油的顆粒方面，通過mfi^tm測定的中等濃度的球形顆粒與通過rmm測定的高濃度的正電顆粒之間觀察到的不同結(jié)果可能與通過這些技術(shù)觀察到的不同粒徑相關(guān)。具體地，mfi^tm觀察到具有1-100微米的直徑的顆粒，而rmm檢測到0.05-5.00微米的直徑的顆粒。還已知聚山梨酯80能夠穩(wěn)定小尺寸顆粒形式的氣泡，其通過rmm以正電顆粒的形式有效地被觀察到。

在疫苗a和b的實(shí)例中，在所述方法的第一步中僅評價(jià)疫苗緩沖劑與潤滑劑之間的界面張力的時(shí)間依賴性，因?yàn)闈櫥瑒┡c疫苗蛋白質(zhì)之間發(fā)生相互作用。然而，緩沖劑的另外的組分可能與硅油發(fā)生相互作用，這種情況導(dǎo)致評價(jià)所述制劑的組分與所述潤滑劑之間的界面張力隨時(shí)間的減小，以便在第三步中鑒定哪種組分導(dǎo)致所述相互作用。實(shí)際上，所述緩沖劑的一些組分也可能與所述潤滑劑產(chǎn)生強(qiáng)相互作用，導(dǎo)致顆粒產(chǎn)生、治療性蛋白質(zhì)降解或所述基于蛋白質(zhì)的制劑至少失去穩(wěn)定性。

圖4中呈現(xiàn)的流程圖概括用于評價(jià)任意基于蛋白質(zhì)的制劑相對于潤滑容器的潤滑劑的穩(wěn)定性的一般方法的不同步驟。在步驟100中，評價(jià)所述緩沖劑與所述潤滑劑之間的界面張力。

例如，如果在所述方法的第一步中所述緩沖劑與所述潤滑劑之間的界面張力隨時(shí)間減小(分支d)，則需要中間步驟101來評價(jià)所述制劑緩沖劑的每種組分與所述潤滑劑之間的界面張力?；蛘?，如果發(fā)現(xiàn)所述緩沖劑與所述潤滑劑之間的界面張力穩(wěn)定(分支s)，則可以直接進(jìn)行第二步102。在所述方法的所述第二步102中，評價(jià)所述基于蛋白質(zhì)的制劑與所述潤滑劑之間的界面張力。如果在該步驟中發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性，則可以得出如下結(jié)論：所述基于蛋白質(zhì)的制劑在所研究的潤滑容器中是穩(wěn)定的(分支s’)且可以進(jìn)行接下來的研發(fā)階段p。

然而，如果通過界面張力減小檢測到任何相互作用(分支d’)，則需要鑒定實(shí)際上在本方法第三步103中實(shí)際起相互作用的組分。這允許在第四步104中研究所述基于蛋白質(zhì)的制劑對第三步中鑒定的相互作用的敏感性。實(shí)際上，所述制劑的組分與所述潤滑劑之間有限的相互作用是可以被接受的，例如，如果該組分以顯著濃度被導(dǎo)入和/或如果其功能不受所述相互作用阻礙。因此，可能需要另外的實(shí)驗(yàn)，以便確定所述相互作用是否實(shí)際影響所述基于蛋白質(zhì)的制劑的穩(wěn)定性或效能。例如，如果在所述方法的第三步103中鑒定了ph緩沖劑與所述潤滑劑之間的相互作用，則可能需要在老化后檢查所述基于蛋白質(zhì)的制劑的ph，以便確定所述基于蛋白質(zhì)的制劑仍在所需ph下。類似地，如果發(fā)現(xiàn)去氧劑與所述潤滑劑發(fā)生相互作用，則需要研究老化后的蛋白質(zhì)氧化，因?yàn)檠蹩梢耘c所述潤滑劑競爭并且消除與所述清除劑的相互作用。在其中所述基于蛋白質(zhì)的制劑對所述相互作用不敏感的情況中(分支ns)，隨即能夠使用所述基于蛋白質(zhì)的制劑接下來的研發(fā)步驟p進(jìn)行。然而，如果發(fā)現(xiàn)所述基于蛋白質(zhì)的制劑對特定的相互作用敏感(分支s)，則可能需要所述基于蛋白質(zhì)的制劑或所述潤滑劑的適應(yīng)(步驟105)。

一般而言，在乳劑-輔助的疫苗的情況中，蛋白質(zhì)與一些關(guān)鍵組分例如角鯊烯之間的相互作用可能無需另外的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗龌诘鞍踪|(zhì)的制劑對這些相互作用的高敏感性顯而易見或得到充分記載。在這些情況中，可能需要在任選的第四步104中使所述潤滑劑或所述基于蛋白質(zhì)的制劑適應(yīng)，無需測定所述基于蛋白質(zhì)的制劑的敏感性。

根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，界面張力用于使基于蛋白質(zhì)的制劑適應(yīng)潤滑容器的方法中。如上所述，用于克服基于蛋白質(zhì)的制劑與潤滑劑之間的不相容性的方法可以使所述基于蛋白質(zhì)的制劑適應(yīng)，以便防止在本發(fā)明第一個(gè)方面的方法中測定的不期望的相互作用。

使基于蛋白質(zhì)的制劑適應(yīng)潤滑容器可以通過下列步驟實(shí)現(xiàn)：添加制劑組分，從而實(shí)現(xiàn)競爭性相互作用，即在動(dòng)力學(xué)或熱力學(xué)方面比所鑒定的相互作用組分與所述潤滑劑之間的相互作用更有利。這種競爭性相互作用可以在另外的組分與所述潤滑劑或另外的組分與所述基于蛋白質(zhì)的制劑之間發(fā)生。

因此，第一種途經(jīng)在于通過在所述緩沖劑的另外的組分與所述潤滑劑之間生成更強(qiáng)的競爭性相互作用來防止所述基于蛋白質(zhì)的制劑與所述潤滑劑之間的相互作用。這種另外的組分可以是對于所述基于蛋白質(zhì)的制劑而言新的組分或已經(jīng)存在的組分，只要該組分的濃度可以在不影響所述基于蛋白質(zhì)的制劑穩(wěn)定性的情況下顯著改變。

申請人已經(jīng)在疫苗b實(shí)例中研究了所述第一種途經(jīng)。實(shí)際上，本發(fā)明第一個(gè)方面的方法證實(shí)了疫苗b蛋白質(zhì)與硅油之間的不相容性。然而，疫苗b包含聚山梨酯80作為非離子表面活性劑(參見材料和方法)，且這種組分能夠與疫苗b蛋白質(zhì)競爭與硅油的相互作用。

為了測定聚山梨酯80的適合濃度，已經(jīng)評價(jià)了不同濃度的聚山梨酯80與硅油之間的界面張力隨時(shí)間的減小并且與疫苗b產(chǎn)生的減小進(jìn)行比較。

在圖5中，3×10^-6m和3×10^-4m濃度的聚山梨酯80與硅油之間的界面張力隨時(shí)間的減小和疫苗b與硅油之間的界面張力減小疊加。如果3×10^-6m的聚山梨酯80濃度僅產(chǎn)生從41至36mn/m的有限減小，則3×10^-4m的濃度產(chǎn)生界面張力的顯著減小，達(dá)到14mn/m的最小值，明顯低于使用疫苗b得到的最小值36mn/m。該結(jié)果表明疫苗b可以通過將聚山梨酯80的濃度設(shè)定在3×10^-4m來適應(yīng)與硅油穩(wěn)定。這種適應(yīng)的制劑隨后稱作疫苗b+ps80，用于接下來的研究，而相應(yīng)的緩沖劑稱作疫苗b緩沖劑+ps80。

疫苗b+ps80的穩(wěn)定性使用微-流量成像(mfi^tm)和共振質(zhì)量測量(rmm)進(jìn)行評價(jià)。

圖6a和6b顯示通過mfi^tm測定的疫苗b和疫苗b+ps80產(chǎn)生的顆粒濃度以及疫苗b緩沖劑和疫苗緩沖劑b+ps80的顆粒濃度，它們均在使用硅油潤滑的注射器中溫育7天后。圖6a呈現(xiàn)球形顆粒的濃度(歸因于硅油)，而圖6b呈現(xiàn)非球形顆粒的濃度(歸因于蛋白質(zhì)聚集物)。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)由適應(yīng)的制劑產(chǎn)生的球形顆粒濃度(圖6a)、即疫苗b+ps80接近由原始制劑(疫苗b)產(chǎn)生的濃度的一半，從13959至7533個(gè)顆粒/cc。在歸因于蛋白質(zhì)聚集物的非球形顆粒方面(參見圖6b)，改進(jìn)的制劑疫苗b+ps80僅產(chǎn)生1887個(gè)顆粒/cc的濃度，約為疫苗b產(chǎn)生的21826個(gè)顆粒/cc濃度的9％。

rmm結(jié)果如圖7a和7b中所示，其中圖7a顯示正電顆粒的濃度(歸因于硅酮顆粒)且圖7b顯示負(fù)電顆粒濃度(歸因于蛋白質(zhì)聚集物)。7天溫育后，適應(yīng)的制劑(疫苗b+ps80)產(chǎn)生高于疫苗b的正電顆粒濃度，高于2×10⁶個(gè)顆粒/cc。然而，由疫苗b+ps80產(chǎn)生的負(fù)電顆粒濃度降至72667個(gè)顆粒/cc，約為由疫苗b產(chǎn)生的濃度的3.3％。

根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的方法，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了對疫苗b與硅油潤滑劑之間相互作用在添加聚山梨酯80后顯著減少的支持。在蛋白質(zhì)的相互作用中，聚山梨酯80成功地與疫苗蛋白質(zhì)b競爭，即疫苗蛋白質(zhì)b與硅油之間的相互作用被聚山梨酯80有效地阻止。所述方法由此允許使基于蛋白質(zhì)的制劑適應(yīng)指定潤滑劑，并且在這種情況中，允許使得疫苗b在潤滑容器、例如預(yù)裝填注射器中安全儲(chǔ)存。盡管聚山梨酯80已經(jīng)用于使疫苗b適應(yīng)，但是另外的非離子表面活性劑也可能是適合的，只要它們與所述制劑的蛋白質(zhì)和另外的組分相容。

已經(jīng)使用胰島素研究了類似的途經(jīng)，其為另一種常見的基于蛋白質(zhì)的制劑。

關(guān)于圖8，胰島素制劑與硅油之間的界面張力隨時(shí)間的減小顯示了顯著的相互作用。通過添加1×10^-4m濃度的聚山梨酯80，胰島素制劑成功地適應(yīng)硅油，并且在圖8中被稱作“胰島素+ps80”。胰島素+ps80產(chǎn)生與硅油之間界面張力隨時(shí)間的減小，降至17mn/m，這種減小高于使用原始胰島素制劑觀察到的減小(在100s時(shí)23mn/m)。然而，聚山梨酯80與適應(yīng)的胰島素制劑之間的界面張力曲線的疊加允許得出如下結(jié)論：僅聚山梨酯80與硅油發(fā)生相互作用，與胰島素不期望的相互作用被有效地掩蔽。

申請人研究的第二種途經(jīng)在于添加與不穩(wěn)定的基于蛋白質(zhì)的制劑的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的另外的組分。實(shí)際上，疫苗a蛋白質(zhì)的凈電荷是負(fù)的，且可以與鋁陽離子形成絡(luò)合物。因此，通過導(dǎo)入2g/dm³的氫氧化鋁已經(jīng)使疫苗a適應(yīng)，所述適應(yīng)的制劑稱作“疫苗a+ah”。

圖9示蹤硅油分別與疫苗緩沖劑a、疫苗a和疫苗a+ah(適應(yīng)的制劑)之間的界面張力隨時(shí)間的減小。盡管如上所述在先證實(shí)的相互作用結(jié)果，疫苗a與硅油的界面張力從43降至36mn/m，但是疫苗a+ah產(chǎn)生的界面張力僅有限地降至42mn/m。這種減小類似于疫苗緩沖劑a在相同期限內(nèi)產(chǎn)生的減小。因此，推定儲(chǔ)存在使用硅油潤滑容器中的疫苗a+ah將產(chǎn)生有限濃度的顆粒，類似于疫苗緩沖劑a得到的結(jié)果，并且顯示在圖2a、2c、3a、3c中。與第一種途經(jīng)(其中聚山梨酯80成功地與疫苗蛋白質(zhì)b競爭與硅油的相互作用)相反，在所述第二種途經(jīng)中疫苗蛋白質(zhì)a與硅油之間的相互作用通過形成疫苗蛋白質(zhì)絡(luò)合物而被阻止。這類疫苗蛋白質(zhì)絡(luò)合物不能再與硅油發(fā)生相互作用，且疫苗a+ah與疫苗緩沖劑a同樣穩(wěn)定。因此，該結(jié)果支持通過添加絡(luò)合鹽使得疫苗a有效適應(yīng)。氫氧化鋁已經(jīng)用于如下實(shí)例，但可以選擇另外的鹽，例如磷酸鋁。

根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，界面張力用于選擇適應(yīng)于預(yù)期用于儲(chǔ)存基于蛋白質(zhì)的制劑的容器的潤滑劑的方法。

關(guān)于圖10，在第一步201中評價(jià)所述基于蛋白質(zhì)的制劑與每種所研究的潤滑劑之間的界面張力隨時(shí)間的減小。如果潤滑劑不產(chǎn)生顯著減小，即鑒定不產(chǎn)生與所述基于蛋白質(zhì)的制劑的任何相互作用(分支s)，則能夠選擇它并且進(jìn)行制劑過程的下一個(gè)階段p。

然而，如果全部潤滑劑都與所述基于蛋白質(zhì)的制劑發(fā)生相互作用(分支d)，則必須在第二步202中評價(jià)緩沖劑的每種組分與每種所研究的潤滑劑之間的界面張力隨時(shí)間的減小。該步驟允許在第三步203中測定所述基于蛋白質(zhì)的制劑的哪種組分實(shí)際上與哪種潤滑劑發(fā)生相互作用。在該步驟中，可以選擇與所述基于蛋白質(zhì)的制劑的蛋白質(zhì)不發(fā)生相互作用的潤滑劑用于進(jìn)一步研究，而可以放棄與所述蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的潤滑劑。

使用這些數(shù)據(jù)，可以在第四步204中通過進(jìn)行額外的實(shí)驗(yàn)確定所述基于蛋白質(zhì)的制劑是否對所選擇的潤滑劑的相互作用敏感。這些實(shí)驗(yàn)可以牽涉顆粒計(jì)數(shù)法，例如mfi^tm或rmm(共振質(zhì)量測量)、結(jié)構(gòu)技術(shù)例如核磁共振或圓二色性和其它技術(shù)例如液相色譜法、尺寸排阻色譜法、ph-測量法、免疫測定法或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，視與所述潤滑劑發(fā)生相互作用的所述基于蛋白質(zhì)的制劑的組分的不同而定。實(shí)際上，可以發(fā)現(xiàn)一些相互作用是可接受的，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)妨礙所述基于蛋白質(zhì)的制劑的效能或穩(wěn)定性。如果在第四步204中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生與所述基于蛋白質(zhì)的制劑的不敏感性相互作用的潤滑劑(分支ns)，則可以選擇它，然后進(jìn)行所述基于蛋白質(zhì)的制劑的接下來的研發(fā)步驟p。然而，如果全部潤滑劑都產(chǎn)生與所述基于蛋白質(zhì)的制劑的敏感性相互作用(分支s)，則在第五步205中可能需要如本發(fā)明第二個(gè)方面中所述使所述基于蛋白質(zhì)的制劑適應(yīng)，或使用另外的潤滑劑繼續(xù)進(jìn)行目前的研究。

材料和方法

溶液

使用兩種不同的多-綴合的腦膜炎疫苗即疫苗a和疫苗b研究本發(fā)明的方法，所述兩種不同的多-綴合的腦膜炎疫苗均僅包含一種血清型。這些疫苗市售購得。疫苗a緩沖劑包含7mg/mlnacl、0.184mg/mlnah2po4.h2o、0.96mg/mlna2hpo4.7h2o和14.6mg/ml甘露糖醇。疫苗b緩沖劑包含9mg/mlnacl；1.335mg/mlna2hpo4.2h2o；0.345mg/mlnah2po4.h2o；0.68mg/mlkh2po4和25mg/ml蔗糖。全部化學(xué)化合物均購自sigma-aldrich。氫氧化鋁(ah)溶液以2mg/ml濃度由在商購疫苗a試劑盒提供，且由此符合usp和ep級。

聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯、稱作聚山梨酯80或ps80作為分子生物學(xué)等級購自sigma-aldrich，其商品名為80。分別制備具有3×10^-4m、3×10^-5m和3×10^-6m的終濃度的ps80溶液。制備具有ps803×10^-4m終濃度的疫苗b+ps80。

硅油是醫(yī)用級聚-(二甲基硅氧烷)(pdms)，其購自dowcorning，名稱為dc360。在預(yù)研究中研究20cst和1000cst，且分別使用空氣(air)或磷酸鹽緩沖溶液得到相同的界面張力曲線。因此，將得到較大降低曲率的粘性較低的20cstpdms用于界面張力測定(參見材料和界面張力測定方法)。

界面張力測定

使用剖面分析張力計(jì)(profileanalysistensiometer)(pat-1m張力計(jì),sinterfacetechnologies,berlin,germany)，基于垂滴技術(shù)(pendantdroptechnique)測定界面張力隨時(shí)間的減小。pat-1m張力計(jì)使用受控配量系統(tǒng)生成空氣或液體中的液滴，液滴形成被高分辨力視頻攝像機(jī)捕獲。sinterfacepat-1m張力計(jì)軟件允許進(jìn)行圖像采集、邊緣檢測并且利用young-laplace方程確定界面張力。將進(jìn)入20-ml玻璃池的測定溫度控制在25℃±2℃。用帶有浸入的具有1.0mm外徑的聚-(四氟乙烯)(ptfe)毛細(xì)管蓋封閉池。研究溶液的液滴在毛細(xì)管浸入端形成。在本方法中，形成的疫苗、疫苗緩沖劑或修飾的制劑的液滴進(jìn)入pdms(20cst)環(huán)境。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中通過自動(dòng)調(diào)節(jié)將液滴的表面積控制為恒定。在本實(shí)驗(yàn)過程中添加到液滴中的體積也得到連續(xù)監(jiān)測。對于每次實(shí)驗(yàn)調(diào)整液滴面積以便監(jiān)測液滴曲率，與young-laplace方程一致。作為結(jié)果，70mm²液滴面積用于不具有ps80或具有低于cmc(1×10^-5m)的ps80的溶液，而40mm²用于其它溶液。

穩(wěn)定性研究

研究疫苗a和疫苗b制劑在潤滑容器中的穩(wěn)定性，以便證實(shí)與界面張力測量值的相關(guān)性。容器為用0.4mg硅酮潤滑的具有潛水噴嘴(divingnozzle)的玻璃注射器(hypak^tm,29g1/2,rnsbd260black,超低鎢(ultralowtungsten),bd-pharmaceuticalsystems,lepont-de-clai×,france)。全部注射器都被hypakscf1ml不潤滑的涂敷塞子塞住。

給注射器裝填適合的溶液(疫苗或緩沖劑)并且以垂直位儲(chǔ)存在25℃±2℃溫度和60％rh±5％濕度下。通過謹(jǐn)慎地取下填充塞打開注射器并且將該溶液從邊緣轉(zhuǎn)入澄清的玻璃器皿。使用microfluidimaging^tm(mfi^tm)進(jìn)行并且通過阿基米德共振質(zhì)量測量(archimedesresonancemassmeasurement)(rmm)儀器在裝填后即刻和7-天儲(chǔ)存后進(jìn)行顆粒計(jì)數(shù)。

穩(wěn)定性研究過程中使用的顆粒計(jì)數(shù)方法

為了評估在穩(wěn)定性研究過程中生成的顆粒的濃度和尺寸，使用brightwelltechnologies的mfi^tm-dpa5200a系列和通過阿基米德系統(tǒng)(archimedessystem)的共振質(zhì)量測量(rmm)(affinitybiosensors,santabarbara,california)。

給mfi^tm-5200儀器安裝100μm流動(dòng)池，以高放大倍數(shù)操作。mfi^tmview軟件mvss2.r3版和mvas1版(protein-simple)用于數(shù)據(jù)分析。初始使用10μm聚苯乙烯nist可追蹤的粒徑標(biāo)準(zhǔn)品(dukescientificcorp.fremont,ca)校準(zhǔn)儀器。在每份樣品運(yùn)行前，使不含顆粒的流體流過所述系統(tǒng)，以提供純凈的基線并且優(yōu)化照明。然后使用蠕動(dòng)泵將樣品輕輕地插入流動(dòng)池。使用0.5ml運(yùn)行體積進(jìn)行3次獨(dú)立的運(yùn)行。基于mfi^tm系統(tǒng)的mvas軟件，建立定制過濾器(customfilters)。與sharma等人,pharmtech2009(33),p.74-9一致，硅油液滴與聚集的相同尺寸的蛋白質(zhì)顆粒相比具有始終如一的較高長寬比，這支持利用具有長寬比(ar)>0.85截止值的單一軟件過濾器。這種過濾器使球形群體與非球形群體分離，并且俘獲約95-98％的具有可見小纖維形態(tài)的顆粒。

給阿基米德系統(tǒng)安裝有hi-q微型傳感器(microsensor)(affinitybiosensors)，并且由particlelab軟件1.8版控制。用純水將該傳感器沖洗60s，然后分析。隨后，通過至少5次“打噴嚏”操作除去系統(tǒng)中可能的雜質(zhì)(將傳感器中的液體推入兩個(gè)方向)，并且用純水再將所述系統(tǒng)沖洗60s。然后如d.weinbuch等人journalofpharmaceuticalsciences2013(102),p.2152-65所述加載樣品溶液45s。將分析設(shè)置10min期限。加載新鮮的樣品溶液用于一式三份測定。通過rmm進(jìn)行的尺寸測定和分選顆粒基于頻移并且解釋在p.dextras等人,analyticalchemistry2009(81),p.4517-23中。