本發(fā)明涉及到食品安全、材料化學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種基于二氧化硅包覆金納米三角的表面增強拉曼真菌毒素檢測方法。

背景技術(shù)：

真菌毒素(mycotoxin)是真菌生長產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，花生等谷物食品由于其儲存方式不當(dāng)、加工過程中(包括干燥、加工、儲藏過程)特別容易受黃曲霉毒素的污染，具有潛在的致肝癌、胃癌、腎癌的可能性。目前常規(guī)的用于真菌毒素檢測的方法，主要有生物鑒定法，但此方法只能用于定性檢測，專一性不強，靈敏度低；化學(xué)分析法(薄層層析法)，其精密度差，難以在實際中應(yīng)用；儀器法(氣相色譜法、液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、液質(zhì)聯(lián)用法)，其前處理復(fù)雜，儀器昂貴；免疫分析法(酶聯(lián)免疫吸附法，免疫熒光技術(shù)，放射免疫測定法等)，其存在一定的假陽性。所以急需建立一種靈敏度高，穩(wěn)定性強，操作簡單的檢測方法。

表面增強拉曼散射是拉曼散射的延伸和發(fā)展，具有表面增強拉曼效應(yīng)的基底材料(金、銀、銅和一些過渡金屬)與被測物質(zhì)接觸時其產(chǎn)生的電磁場會增強被測物質(zhì)的拉曼信號，從而達到檢測的目的。因此，表面增強拉曼效應(yīng)的強弱與基底材料的結(jié)構(gòu)、形狀、尺寸以及與被測物的結(jié)合方式有很大的關(guān)系。表面增強拉曼光譜技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于農(nóng)藥、抗生素、細菌等痕量物質(zhì)的檢測，但在真菌毒素檢測方面的研究相對較少，且基底材料的種類單一，檢測靈敏度低，信號穩(wěn)定性差，檢測限需要進一步的提高。

單金屬增強基底與金屬、二氧化硅、四氧化三鐵、石墨烯等復(fù)合在一起可以組成具有特定化學(xué)特性和拉曼特性的核殼形增強基底，相對于單金屬增強基底其拉曼增強效應(yīng)更顯著。金納米三角與其它形貌的金納米材料相比，由于其具有尖銳的邊角，因此具有更好的等離子增強效應(yīng)，拉曼增強效果相對于金納米顆粒更顯著；銀具有很好的等離子增強效應(yīng)，作為金納米三角的外殼，能顯著提高納米三角的拉曼增強效果。dtnb作為一種沒有熒光干擾和具有大散射截面的分子，作為拉曼信號分子標記于金銀納米三角殼層中間，能顯著提高拉曼信號的穩(wěn)定性。適配體的特異性和磁性材料的分離聚集作用可以拉近增強基底和待測物距離，進一步提高拉曼信號的強度和穩(wěn)定性。因此，本專利制備了真菌毒素適配體修飾的金納米三角為內(nèi)核的dtnb標記的金@dtnb@銀核殼納米三角和殼聚糖四氧化三鐵(cs-fe3o4)磁性材料，構(gòu)建了三明治結(jié)構(gòu)的檢測體系，大大提高了拉曼信號的強度和穩(wěn)定性，成功應(yīng)用于真菌毒素的超靈敏定量檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于二氧化硅包覆金納米三角的表面增強拉曼真菌毒素檢測方法，該方法對真菌毒素的檢測穩(wěn)定性好，靈敏度高。適用于食品安全、材料化學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域。

本發(fā)明的技術(shù)方案包括：

金納米三角為內(nèi)核的真菌毒素適配體修飾的金@dtnb@二氧化硅核殼納米三角的制備,真菌毒素適配體修飾的殼聚糖四氧化三鐵(cs-fe3o4)磁性材料的制備,真菌毒素表面增強拉曼光譜檢測體系的構(gòu)建以及標準曲線的建立；步驟為：

步驟1)金@dtnb@二氧化硅核殼納米三角的制備：采用三步種子生長法制得金納米三角，將10ml上述制備的金納米三角溶液在6000rpm、20min條件下離心兩次，用去離子水清洗，除去過量的ctac溶液，沉淀重新分散到10ml去離子水中，向上述溶液中加入20ul，0.01mol/l的5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(dtnb)乙醇溶液，室溫下磁力攪拌2h；離心去除未連接的5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(dtnb)，重新分散到相同體積的去離子水中；將200μl,1mm的aptms逐滴加入混合溶液中，反應(yīng)15min后，將質(zhì)量分數(shù)為1ml0.54％的硅酸鈉加入溶液中，在90℃水浴環(huán)境下磁力攪拌30min，得到增強基底待用；

步驟2)真菌毒素核酸適配體鏈修飾的金@dtnb@二氧化硅核殼納米三角的制備：將上述步驟1)制備的金@dtnb@二氧化硅核殼納米三角冷卻后加入100μl、1mm的aptms，攪拌15min，離心分離后沉淀用乙醇和乙腈分別清洗三次，隨后與溶解在乙腈溶劑中的0.6ml，0.2m三聚氯氰連續(xù)攪拌反應(yīng)4h；此后，將產(chǎn)物進行離心，棄上層液體，獲得的沉淀用乙腈、超純水、硼酸鹽緩沖液(bbs)分別清洗3次，沉淀重新分散在5ml，ph＝8.4的bbs溶液中，將10μl，100um的核酸適配體鏈的bbs溶液加入其中，室溫下孵育12h；

步驟3)殼聚糖四氧化三鐵(cs-fe3o4)磁性材料的制備：0.82g三氯化鐵強烈攪拌下溶于40ml乙二醇中，強烈攪拌直至溶液變澄清，3.6g無水醋酸鈉和0.5g殼聚糖，在連續(xù)攪拌條件下加入上述溶液，攪拌持續(xù)30min，反應(yīng)結(jié)束后溶液轉(zhuǎn)移到50ml聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜中，發(fā)應(yīng)釜放在200℃恒溫箱里反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束，冷卻到室溫，磁分離，乙醇清洗三次，60℃恒溫箱干燥5h，產(chǎn)物密封放在4℃冰箱備用；

步驟4)真菌毒素核酸適配體鏈修飾的殼聚糖四氧化三鐵(cs-fe3o4)磁性材料的制備：1mg上述步驟3)合成的殼聚糖四氧化三鐵磁性材料超聲分散在0.5ml，5％的戊二醛溶液中，0.5ml，5um的氨基修飾的真菌毒素適配體鏈的pbs溶液加入上述混合溶液，室溫孵育4h，反應(yīng)結(jié)束后加入牛血清蛋白(bsa)溶液封閉磁性材料上未連接的活性位點，上述溶液用2ml水和2ml，tris-hcl緩沖溶液清洗，最終分散在1ml,tris-hcl緩沖溶液中，備用；

步驟5)表面增強拉曼檢測體系的構(gòu)建：在上述合成的真菌毒素適配體修飾的殼聚糖四氧化三鐵磁性材料100μl中加入100μl不同濃度的真菌毒素(0.0,0.001,0.01,0.1,1.0,10.0,100,1000ng/ml)，室溫下孵育2h，反應(yīng)結(jié)束后，加入上述合成的真菌毒素適配體鏈修飾的金@dtnb@銀核殼納米三角溶液200μl，充分混合后室溫下孵育6h，磁分離去除上清液，沉淀重新分散到100μl、tris-hcl緩沖溶液中。用拉曼光譜儀在780nm激光激發(fā)下采集不同濃度真菌毒素組裝體系的拉曼信號，從而建立組裝體拉曼信號強度和對應(yīng)真菌毒素濃度間的標準曲線。

與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1.本發(fā)明通過標記dtnb信號分子于金@銀核殼納米棒殼層中間，增強拉曼信號穩(wěn)定性，利用金銀納米棒的強拉曼增強效果，以及適配體的特異性識別作用，磁性材料的分離富集作用，構(gòu)建了一種真菌毒素定量檢測的超靈敏檢測方法，同時為其它真菌毒素的檢測提供了一種檢測體系的參考。

2.本發(fā)明所制備的金納米三角，采用三步金種子生長法制得邊長為100±10nm，通過在種子溶液和生長溶液中快速加入碘化鈉來增加金納米三角的產(chǎn)率。

3.本發(fā)明所制備的金納米三角，將不同體積的金種子溶液1(200μl，400μl，600μl，800μl，1200μl)加入到金種子溶液2中(10ml)，最終制得不同尺寸的金納米三角，對制得的金納米三角溶液進行紫外和透射電鏡表征。

4.本發(fā)明所制備的金@dtnb@二氧化硅核殼納米三角，將二氧化硅包覆在金納米三角外，使增強劑更容易與適配體連接，同時，可以有效的防止dtnb信號分子受外界環(huán)境的干擾，信號更加穩(wěn)定。

5.本發(fā)明所制備的金@dtnb@二氧化硅核殼納米三角，dtnb標記分子標記金納米三角的最佳標記濃度為2mm，超聲1h能夠增加標記分子的連接。

6.本發(fā)明制備的的殼聚糖修飾的四氧化三鐵磁性材料，其具有超順磁性和很好的水溶性，保證了磁性材料對真菌毒素的分離和富集。

附圖說明

圖1為加入不同體積金種子溶液1所對應(yīng)的金納米三角紫外表征圖；

圖2為不同濃度黃曲霉度b1檢測的表面增強拉曼光譜圖；

圖3為不同濃度黃曲霉毒素b1檢測的散點圖(a)和標準曲線圖(b)。

具體實施方式

實施實例1

為了進一步驗證本發(fā)明所制備檢測方法對食品中真菌毒素檢測的靈敏性，本發(fā)明實例，以黃曲霉毒素b1為例，具體操作步驟如下：

步驟1)金納米三角的制備：采用三步金種子誘導(dǎo)法合成金納米三角，具體的：

金種子溶液1：

25μl、0.05m的haucl4溶液加入到4.7ml、0.1m的ctac溶液中，強烈攪拌條件下加入300μl新鮮制備的0.01m的nabh4溶液中，將其放在室溫下3h除去過量的nabh4；

金種子溶液2：

1.6ml、0.1m的ctac溶液用8ml的超純水稀釋，加入40μl、0.05m的haucl4溶液，快速加入0.01m、15μl的碘化鈉溶液；

生長溶液：1ml、0.05m的haucl4溶液加入到80ml，0.05m的ctac溶液中，快速加入0.01m，600μl的碘化鈉溶液；

種子溶液生長：將金種子溶液1用0.1m的ctac溶液稀釋10倍，40μl，0.1m的aa和800μl，0.1m的抗壞血酸分別加入到金種子溶液2和生長溶液中，將不同體積上述稀釋的金種子溶液1加入到金種子溶液2，快速搖勻，將6.4ml快速加入到生長溶液中，手動攪拌幾秒，室溫放置1h；

金納米三角的純化：40ml上述合成的金三角溶液加入6ml、25wt％的ctac溶液，室溫下反12h，去除上清液，沉淀重新分散在10ml、0.1m的ctac溶液中，得到純化后的金納米三角溶液，如圖1為加入不同體積金種子溶液1所對應(yīng)的金納米三角紫外表征圖；

步驟2)金@dtnb@二氧化硅核殼納米三角的制備：采用三步種子生長法制得金納米三角，將10ml上述步驟1)制備的金納米三角溶液在6000rpm、20min條件下離心兩次，用去離子水清洗，除去過量的ctac溶液，沉淀重新分散到10ml去離子水中，然后向上述溶液中加入20ul、0.01mol/l的dtnb乙醇溶液，室溫下磁力攪拌2h；離心去除未連接的dtnb，重新分散到相同體積的去離子水中；將200μl、1mm的aptms逐滴加入混合溶液中，反應(yīng)15min后，將1ml0.54％(w/w)的硅酸鈉加入溶液中，在90℃水浴環(huán)境下磁力攪拌30min，得到增強基底待用。

步驟3)afb1核酸適配體鏈修飾的金@dtnb@二氧化硅核殼納米三角的制備：將上述步驟2)制備的金@dtnb@二氧化硅核殼納米三角冷卻后加入100μl、1mm的aptms，攪拌15min，離心分離后沉淀用乙醇和乙腈分別清洗三次，隨后與溶解在乙腈溶劑中的0.6ml、0.2m三聚氯氰連續(xù)攪拌反應(yīng)4h；此后，將產(chǎn)物進行離心，棄上層液體，獲得的沉淀用乙腈、超純水、硼酸鹽緩沖液(bbs)分別清洗3次，沉淀重新分散在5ml，ph＝8.4的bbs溶液中，將10μl，100um的afb1核酸適配體鏈的bbs溶液加入其中，室溫下孵育12h。

氨基修飾的afb1適配體鏈：5’-nh2-gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggccc-3’；

步驟4)殼聚糖四氧化三鐵(cs-fe3o4)磁性材料的制備：0.82g三氯化鐵強烈攪拌下溶于40ml乙二醇中，強烈攪拌直至溶液變澄清，3.6g無水醋酸鈉和0.5g殼聚糖，在連續(xù)攪拌條件下加入上述溶液，攪拌持續(xù)30min，反應(yīng)結(jié)束后溶液轉(zhuǎn)移到50ml聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜中，發(fā)應(yīng)釜放在200℃恒溫箱里反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束，冷卻到室溫，磁分離，乙醇清洗三次，60℃恒溫箱干燥5h，產(chǎn)物密封放在4℃冰箱備用。

步驟5)afb1核酸適配體鏈修飾的殼聚糖四氧化三鐵(cs-fe3o4)磁性材料的制備：1mg上述步驟4)合成的cs-fe3o4磁性材料超聲分散在0.5ml、5％的戊二醛溶液中，0.5ml、5um的氨基修飾的afb1適配體鏈的pbs溶液加入上述混合溶液，室溫孵育4h，反應(yīng)結(jié)束后加入加入牛血清蛋白(bsa)溶液封閉磁性材料上未連接的活性位點，上述溶液用2ml水和2ml,tris-hcl緩沖溶液清洗，最終分散在1ml,tris-hcl緩沖溶液中，備用。

氨基修飾的afb1適配體鏈：5’-gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggccc-nh2-3’；

步驟6)表面增強拉曼檢測體系的構(gòu)建：在上述步驟5)合成的afb1適配體修飾的cs-fe3o4磁性材料100μl中加入100μl不同濃度的afb1(0.0，0.001，0.01，0.1，1.0，10.0，100，1000ng/ml)，室溫下孵育2h，反應(yīng)結(jié)束后，加入上述合成的afb1適配體鏈修飾的金@dtnb@銀核殼納米三角溶液200μl，充分混合后室溫下孵育6h，磁分離去除上清液，沉淀重新分散到100μl，tris-hcl緩沖溶液中。用拉曼光譜儀在780nm激光激發(fā)下采集不同濃度真菌毒素組裝體系的拉曼信號，從而建立組裝體拉曼信號強度和對應(yīng)afb1濃度間的標準曲線，如圖2為不同濃度黃曲霉度b1檢測的表面增強拉曼光譜圖；如圖3為不同濃度黃曲霉毒素b1檢測的散點圖(a)和標準曲線圖(b)。

綜上，本發(fā)明制備的一種基于二氧化硅包覆金納米三角的表面增強拉曼真菌毒素檢測方法，合成了具有良好生物相容性和穩(wěn)定拉曼信號的二氧化硅包覆金納米三角的表面拉曼增強劑，同時，合成了超順磁性殼聚糖四氧化三鐵(cs-fe3o4)磁性材料，在增強劑和磁性材料上修飾真菌毒素適配體鏈，當(dāng)檢測體系中有真菌毒素存在時，增強劑和磁性材料會通過適配體的特異性識別作用結(jié)合在一起，隨著真菌毒素濃度的改變，磁性分離后，檢測體系的拉曼信號強度改變，實現(xiàn)食品中真菌毒素的定量檢測的目的；該方法適用于食品安全、材料化學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域。

所述實施例為本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，但本發(fā)明并不限于上述實施方式，在不背離本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠做出的任何顯而易見的改進、替換或變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。

sequencelisting

<110>江蘇大學(xué)

<120>一種基于二氧化硅包覆金納米三角的表面增強拉曼真菌毒素檢測方法

<130>一種基于二氧化硅包覆金納米三角的表面增強拉曼真菌毒素檢測方法

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