本發(fā)明總體涉及環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域以及生物、食品樣本中固醇類激素物質(zhì)的水平監(jiān)測，尤其是對于睪酮的選擇性分析方法。
背景技術(shù)：
睪酮作為非常重要的固醇類雄性激素，其本身不僅作為調(diào)控因子廣泛參與到生物新陳代謝以及生殖發(fā)育的過程中，其在生物體中水平的高低與多種生理指標(biāo)甚至疾病，諸如二型糖尿病、前列腺癌、冠狀動脈疾病和腎結(jié)石相關(guān)，由于睪酮的重要生理作用使其也被應(yīng)用于醫(yī)藥和獸藥中從而通過醫(yī)療、生活和農(nóng)業(yè)污水排放進(jìn)入環(huán)境中。而現(xiàn)有的對于睪酮的檢測分析主要依靠HPLC、GC-MS、HPLC-MS/MS等高性能、精密儀器。雖然對于生物樣本有基于酶聯(lián)免疫反應(yīng)的ELISA快速檢測試劑盒可以應(yīng)用于睪酮含量的分析，但這樣分析需要對于樣品的前處理不能做到原位(in situ)的檢測。因此一種高效簡便可以in situ可視化分析睪酮水平的方法不僅對于生化檢測意義重大，更可以拓展應(yīng)用到環(huán)境以及食品安全的檢測中。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是合成β環(huán)糊精功能化的碳點(diǎn)，基于其對于睪酮的選擇性識別能力從而提供一種方便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確的液體樣本睪酮的分析方法。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種β-環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)材料，該碳點(diǎn)材料是通過N，S摻雜碳點(diǎn)(N,S-CDs)基于酰胺縮合反應(yīng)將β環(huán)糊精鍵合于碳點(diǎn)表面而制得。
首先，環(huán)糊精作為功能性識別體，根據(jù)其本身組成它們的吡喃葡萄糖分子數(shù)的不同分為有α-環(huán)糊精，β-環(huán)糊精，γ-環(huán)糊精，δ-環(huán)糊精四種，其中以前三種最為常見，考慮到目標(biāo)分子的體積故只有6個(gè)吡喃葡萄糖分子的α-環(huán)糊精由于其內(nèi)部空腔體積太小不適宜使用，同理γ-環(huán)糊精，δ-環(huán)糊精雖然內(nèi)部空間足夠容納目標(biāo)分子但是由于其本身空間太大后相應(yīng)的空間位阻作用位點(diǎn)減少，從而使分子識別能力降低，因此選用β-環(huán)糊精。
其次，在側(cè)鏈官能團(tuán)選擇上，首先末端必須含有易于碳點(diǎn)表面羧基反應(yīng)的基團(tuán)，故選擇氨基，此外側(cè)本身長度不能太長，不然不利于光激發(fā)電子轉(zhuǎn)移，因此選擇單(6-氨基-6-去氧)基為側(cè)鏈基團(tuán)
綜上所述優(yōu)選情況下，所述β環(huán)糊精為單(6-氨基-6-去氧)β環(huán)糊精。
具體情況下：先將N,S-CDs溶解在去離子水中，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCL)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，攪拌一定時(shí)間后，加入單(6-氨基-6-去氧)β環(huán)糊精，繼續(xù)攪拌反應(yīng)，所得產(chǎn)物使用透析袋進(jìn)行透析，最后冷凍干燥得到所述β環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)材料。
優(yōu)選情況下，考慮EDC.HCL的催化機(jī)理，使NHS略微過量使得EDC.HCL與NHS的摩爾比在1:1.5到1:2之間，故N,S-CDs與EDC.HCL、NHS、單(6-氨基-6-去氧)β環(huán)糊精的物質(zhì)配比范圍為質(zhì)量比(1：3：3.5：10)到(1：3：4：20)之間。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種檢測睪酮的方法，包括以下步驟：
(1)提供上述的β-環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)材料；
(2)取一定量的β環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)材料和(二茂鐵基甲基)三甲基碘化銨(Fc+)混合溶解在一定pH的水中，振蕩一定時(shí)間，形成熒光探針；
(3)配置一系列濃度的睪酮標(biāo)準(zhǔn)液，分別加入到熒光探針系統(tǒng)中，振蕩一定時(shí)間后，分別采用熒光光譜儀檢測一定波長下的熒光強(qiáng)度，經(jīng)線性擬合后得到標(biāo)準(zhǔn)方程；
(4)將待檢測樣品液加入到熒光探針系統(tǒng)中，振蕩一定時(shí)間后采用熒光光譜儀檢測一定波長下的熒光強(qiáng)度，與標(biāo)準(zhǔn)方程比對后得出樣品液中睪酮的含量。
優(yōu)選情況下，β環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)材料和Fc+的配比范圍為質(zhì)量比為1：4到1:6之間。
優(yōu)選情況下，所述一定pH的水為磷酸緩沖液。
優(yōu)選情況下，步驟(2)和(3)中所述振蕩一定時(shí)間都為20min分鐘以上。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供一種檢測睪酮的熒光探針系統(tǒng)，包括上述的β-環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)材料、(二茂鐵基甲基)三甲基碘化銨(Fc+)和磷酸緩沖液。
本發(fā)明采用主客體熒光探針系統(tǒng)，再通過熒光光譜分析液體樣本中的睪酮水平。該方法首次采用了β環(huán)糊精功能化的碳點(diǎn)作為選擇性識別熒光探針對于目標(biāo)分析物的睪酮有著很好的識別效果，并且與傳統(tǒng)方法相比大量減少了有機(jī)溶劑的使用量，大幅縮短了前處理時(shí)間以及對于先進(jìn)儀器的依賴；本發(fā)明是基于主客體熒光探針系統(tǒng)的熒光比色法，其對于睪酮這種固醇類雄性激素有著很好的選擇性，其線性關(guān)系良好、檢出限較低，可以廣泛應(yīng)用于液體樣本中睪酮的含量水平檢測，同時(shí)由于材料細(xì)胞毒性低生物兼容性好，有潛力應(yīng)用于生物樣本內(nèi)睪酮水平的原位可視檢測。
附圖說明
圖1為采用本發(fā)明的熒光探針系統(tǒng)對一系列濃度的睪酮標(biāo)準(zhǔn)液的熒光光譜分析結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
一、儀器與試劑
Varian CARY Eclipse熒光光譜儀(美國Varian公司)
睪酮標(biāo)準(zhǔn)品(98.0％)購于上海Aladdin公司，使用時(shí)用乙醇稀釋成工作溶液。雄烯二酮、黃體酮、17α-羥孕酮、醋酸甲地孕酮、雌酮、雌二酮，均購買于百靈威；其他有機(jī)溶劑均購來源于北京化工廠試劑。
二、β環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)材料制備及熒光探針系統(tǒng)的構(gòu)建
按照文獻(xiàn)方法由使用檸檬酸和L-半胱氨酸利用水熱法制備N,S-CDs，在200攝氏度下在反應(yīng)釜中反應(yīng)3小時(shí)后，粗產(chǎn)物使用截留質(zhì)量為3500Da的透析袋透析純化，最后所得N,S-CDs在紅外光譜下有著明顯的1702cm-1的吸收峰證明其表面富含羧酸官能團(tuán)，同時(shí)XPS能譜分析得到的284.5eV的能級峰證明其C-C鍵以sp2雜化后形成石墨化結(jié)構(gòu)。
取15mg N,S-CDs溶解在30mL的去離子水中，先加入43mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCL)和51mg N-羥基丁二酰亞胺(NHS)在室溫下攪拌30min后加入200mg單(6-氨基-6-去氧)β環(huán)糊精后繼續(xù)攪拌反應(yīng)12h，所得產(chǎn)物使用3500Da的透析袋，透析48h，最后冷凍干燥得到最后的β環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)材料。
將60μg的β環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)材料和320μM的Fc+溶解在3.0mL的磷酸緩沖溶液(10mM,pH＝7.4)中，在室溫下振蕩20min，形成熒光探針系統(tǒng)。
三、熒光比色法檢測睪酮水平
先構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)方程(如后文所詳細(xì)描述)，將待檢測樣品液加入到熒光探針系統(tǒng)中，振蕩20min后采用熒光光譜儀檢測355nm激發(fā)波長下425nm處的熒光強(qiáng)度，與標(biāo)準(zhǔn)方程比對后得出樣品液中睪酮的含量。
四、熒光探針系統(tǒng)構(gòu)建優(yōu)化
熒光探針系統(tǒng)的合理構(gòu)建對于成功檢測目標(biāo)分析物有著十分重要的意義，合適的體系能提高對于目標(biāo)分析物的檢出靈敏度，而影響探針系統(tǒng)的條件因素有體系pH值，淬滅劑用量以及平衡時(shí)間。
1.體系pH值的影響
pH在熒光探針系統(tǒng)中是一個(gè)重要的因素，不同的pH可能會顯著的影響熒光探針的穩(wěn)定性和強(qiáng)度變化。
初步實(shí)驗(yàn)中，首先驗(yàn)證了β環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)在不同pH值下的熒光穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)條件為取一定量的β環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)溶解在不同pH的磷酸緩沖液中(10mM)，使其終濃度為20μg mL-1，振蕩30min后使用熒光光譜儀記錄體系在355nm激發(fā)波長下425nm處的發(fā)射光強(qiáng)度變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在所測的pH范圍內(nèi)(5.16-9.05)β環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)的熒光表現(xiàn)很穩(wěn)定，未出現(xiàn)較大的波動，詳細(xì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
表1
2.淬滅劑Fc+用量
由上一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，pH對于探針的熒光強(qiáng)度影響不大，故選擇中性pH＝7.00作為后續(xù)試驗(yàn)條件，取一定量的β環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)和不同量的Fc+溶解在pH＝7.00的磷酸緩沖液中(10mM)使碳點(diǎn)的終濃度為20μg mL-1，而Fc+的濃度在0-500μM之間，振蕩30min后使用熒光光譜儀記錄體系在355nm激發(fā)波長下425nm處的發(fā)射光強(qiáng)度變化。由結(jié)果可見，隨著Fc+的濃度的增加，體系的熒光強(qiáng)度逐漸下降，超過300μM以后體系的熒光強(qiáng)度基本維持不再變化，說明此時(shí)Fc+與β環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)結(jié)合達(dá)到飽和，具體結(jié)果見下表2。
表2
3.平衡時(shí)間的影響
根據(jù)上一步優(yōu)化結(jié)果選擇構(gòu)建探針體系條件：取一定量的β環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)和Fc+溶解在pH＝7.00的磷酸緩沖液中(10mM)使碳點(diǎn)的終濃度為20μg mL-1而Fc+的濃度為320μM，振蕩30min后加入一定量的睪酮標(biāo)準(zhǔn)液，使用熒光光譜儀記錄體系在355nm激發(fā)波長下425nm處的發(fā)射光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。由結(jié)果可知，隨著加入睪酮后的時(shí)間增加體系逐漸平衡且熒光強(qiáng)度恢復(fù)，20min以后平衡完成熒光強(qiáng)度不再變化，詳細(xì)結(jié)果見下表3。
表3
五、標(biāo)準(zhǔn)方程的建立
在上述優(yōu)化條件下取一定量的β環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)和Fc+溶解在pH＝7.00的磷酸緩沖液中(10mM)，使碳點(diǎn)的終濃度為20μg mL-1，而Fc+的濃度為320μM，振蕩30min后加入不同量的睪酮標(biāo)準(zhǔn)液(0-480μM)，在室溫下平衡20min后使用熒光光譜儀記錄體系在355nm激發(fā)波長下425nm處的發(fā)射光強(qiáng)度的變化，結(jié)果如表4。由結(jié)果可知熒光探針體系對于0-280μM范圍內(nèi)變化的睪酮有著很好的相應(yīng)，使用Origin對數(shù)據(jù)作圖后，結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，熒光探針系統(tǒng)對于睪酮有著很好的識別和定量分析能力，在一定范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度與睪酮濃度之間有著良好的線性關(guān)系。線性方程為y(熒光強(qiáng)度，a.u.)＝0.2078x(睪酮濃度，μM)+142.73。
表4
六、特異性驗(yàn)證
為了驗(yàn)證熒光探針體系對于睪酮的特異性，在優(yōu)化條件下取一定量的β環(huán)糊精功能化碳點(diǎn)和Fc+溶解在pH＝7.00的磷酸緩沖液中(10mM)，使碳點(diǎn)的終濃度為20μg mL-1，而Fc+的濃度為320μM，振蕩30min后分別加入高低水平(200、80μM)的睪酮以及其他固醇類激素物質(zhì)(雄烯二酮、黃體酮、17α-羥孕酮、醋酸甲地孕酮、雌酮、雌二酮)，在室溫下平衡20min后使用熒光光譜儀記錄體系在355nm激發(fā)波長下425nm處的發(fā)射光強(qiáng)度的變化，并與未加入這些物質(zhì)前的原始體系熒光作比較(ΔI/I0)，由結(jié)果可知，只有睪酮能在加入后較大水平改變體系熒光強(qiáng)度，因此體系對于睪酮有著特異性的響應(yīng)。具體結(jié)果見下表5。
表5
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，上文所述具體實(shí)施方式僅為了更好地理解本發(fā)明，并不用于對本發(fā)明進(jìn)行限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求書的限定為準(zhǔn)。