本發(fā)明屬于免疫納米磁珠的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種fe3o4免疫納米磁珠及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著食品行業(yè)的快速發(fā)展，環(huán)境污染加劇，過敏食物越來越多，食品過敏的發(fā)病率和流行情況日益加劇，食品過敏性疾病已成為一個(gè)新興的、公眾性、全球性的健康問題。其中，堅(jiān)果類制品的過敏更是占有很大的比重，因堅(jiān)果類食品具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及獨(dú)特的風(fēng)味，作為療效食品和休閑食品深受消費(fèi)者的喜愛，但是堅(jiān)果類食品過敏涉及食物過敏癥的90％。因此在食品標(biāo)簽上標(biāo)清過敏原的存在是避免過敏患者食入潛在過敏原的最有效途徑，堅(jiān)果過敏原的檢測(cè)是有必要的?，F(xiàn)有的檢測(cè)方法基本上都是通過前期的分離與富集后，再通過生物傳感器法、質(zhì)譜分析方法，進(jìn)而確認(rèn)靶標(biāo)蛋白，檢測(cè)速度慢，對(duì)設(shè)備要求高，成本高。

納米磁珠因其獨(dú)特的磁學(xué)特性，如超順磁性和高矯頑力，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景而備受關(guān)注。納米磁珠在細(xì)胞分離、固定化酶、免疫診斷及腫瘤靶向治療、dna分離及核酸雜交等方面均有廣泛應(yīng)用，其中將納米磁珠和抗體結(jié)合制成免疫磁珠，因其在免疫檢測(cè)、細(xì)胞分離和生物大分子純化等方面的應(yīng)用，受到人們的廣泛研究。免疫磁珠(immunomagneticbeads，imb)是表面包被有抗體(或配體)的磁性微球。免疫磁珠主要由載體微球和免疫配基兩部分組成。載體微球包括金屬小顆粒組成的核心和包裹在核心外層起修飾作用的高分子材料(如：聚苯乙烯、氨基硅烷化試劑、戊二醛等)，最外層為功能基層即免疫配基，一般包括抗原、抗體、生物酶、細(xì)胞、凝集素、金屬離子及有機(jī)物等。免疫磁珠的制備過程中，人們做了大量的研究。1979年，johnugelstad等成功地制備了一種均勻性和粒度適宜的聚苯乙烯微球，將其磁化并與抗體連接后，成為一種分離細(xì)胞效果極佳的免疫磁珠--dynabeads。迄今，我國(guó)尚沒有生產(chǎn)高質(zhì)量免疫磁珠的能力，而進(jìn)口磁珠的價(jià)格昂貴，因而限制了免疫磁珠在我國(guó)生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。其次，免疫磁珠制備難度較大，要獲得均一、球形、超順磁性且易于結(jié)合蛋白的磁珠很難，但是隨著科學(xué)的發(fā)展，免疫磁珠在整個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尤其是臨床上的作用會(huì)越來越大。

在眾多的納米材料中，fe3o4納米顆粒以其優(yōu)良的性質(zhì)和廣泛地應(yīng)用而備受關(guān)注。fe3o4納米顆粒的制備方法主要包括共沉淀法、熱分解法等。其中，共沉淀法是在有兩種或多種陽離子的溶液中加入沉淀劑，這種多元體系的溶液經(jīng)過沉淀反應(yīng)后，可以得到成分均一的沉淀。目前最普遍使用的方法是按方程式：fe²⁺+2fe³⁺+8oh^-＝fe3o4↓+4h2o為原理進(jìn)行的，按照一定摩爾比例配置fe²⁺，fe³⁺的水溶液，向其中加入過量naoh溶液作為沉淀劑，在一定條件下制成fe3o4納米磁珠。但是制備過程中要在氮?dú)鈿怏w的保護(hù)下才可進(jìn)行，具有一定的限制性，制備出的納米磁珠飽和磁化強(qiáng)度低。

有鑒于此，有必要提出一種新的fe3o4免疫納米磁珠及其制備方法和應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法，該方法可以不受雙氧水或氮?dú)獾牡南拗?，改善了fe3o4納米磁珠的磁學(xué)性質(zhì)，通過對(duì)納米磁珠的表面修飾，與堅(jiān)果過敏性血清抗體結(jié)合可以制成免疫磁珠。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，所采用的技術(shù)方案是：

一種四氧化三鐵免疫納米磁珠的制備方法，包括以下步驟：

(1)制備納米磁珠：

將fe²⁺的鐵鹽和fe³⁺的鐵鹽溶解于水中，得鐵鹽溶液；所述fe²⁺的鐵鹽中fe²⁺和fe³⁺的鐵鹽中fe³⁺的摩爾比為1:1-2；

在65-75℃的溫度下，先超聲鐵鹽溶液4-6分鐘，再加入過量的氫氧化鈉溶液并攪拌25-35分鐘，再靜置晶化2-3小時(shí)，得四氧化三鐵沉淀；

通過磁分離將四氧化三鐵沉淀分離出來，先用蒸餾水洗滌2-3次，再無水乙醇洗滌2-3次，得四氧化三鐵納米磁珠無水乙醇混合液；

(2)納米磁珠的表面修飾：

將四氧化三鐵納米磁珠無水乙醇混合液用無水乙醇稀釋5-7倍，得稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液；

超聲振蕩稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液25-35分鐘后，加入硅烷化試劑，室溫下攪拌6-8小時(shí)，磁分離，得硅烷化四氧化三鐵納米磁珠；所述硅烷化試劑為aptes；

用無水乙醇溶液洗滌硅烷化四氧化三鐵納米磁珠2-3次，得到硅烷化四氧化三鐵納米磁珠無水乙醇混合液；

再用pbs緩沖液洗滌硅烷化四氧化三鐵納米磁珠無水乙醇混合液2-3

次，得磁珠混合液；

向磁珠混合液中加入戊二醛溶液,室溫下振蕩交聯(lián)1.5-2.5小時(shí)，再磁分離，棄去上清液，得氨基化四氧化三鐵納米磁珠混合液混合液；

(3)免疫磁珠的制備：

用抗體包被氨基化四氧化三鐵納米磁珠混合液混合液，室溫下振蕩固定1.5-2.5小時(shí)，磁分離，得包被后的氨基化四氧化三鐵納米磁珠混合液，用蒸餾水和pbs緩沖液分別洗滌3-4次，得四氧化三鐵免疫納米磁珠；所述抗體為堅(jiān)果過敏小鼠陽性血清。

進(jìn)一步的，所述步驟(1)中，鐵鹽溶液中fe²⁺的摩爾濃度為0.2-0.35mol/l，fe³⁺的摩爾濃度為0.2-0.4mol/l；

所述氫氧化鈉溶液的摩爾濃度為0.5-1mol/l。

再進(jìn)一步的，所述fe²⁺的鐵鹽為feso4·7h2o，fe³⁺的鐵鹽為fecl3·6h2o。

進(jìn)一步的，所述步驟(2)中，所述aptes與稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液的體積比為1:350-400；

所述戊二醛溶液的用量為硅烷化四氧化三鐵納米磁珠無水乙醇混合液的3-5倍。

再進(jìn)一步的，所述戊二醛溶液的體積分?jǐn)?shù)為3-7％。

進(jìn)一步的，所述步驟(3)中，抗體與氨基化四氧化三鐵納米磁珠混合液的體積比0.8-1.2:1。

再進(jìn)一步的，所述步驟(3)中，抗體的稀釋度為1:600-1000。

再進(jìn)一步的，所述抗體的稀釋度為1:800。

本發(fā)明還有一個(gè)目的，在于提供上述四氧化三鐵免疫納米磁珠的應(yīng)用，該應(yīng)用可以有效檢測(cè)堅(jiān)果過敏蛋白。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，所采用的技術(shù)方案是：

一種四氧化三鐵免疫納米磁珠的應(yīng)用，其特征在于，包括：

采用酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗原；其中，所述抗原為堅(jiān)果過敏蛋白，所述第一抗體為四氧化三鐵免疫納米磁珠。

進(jìn)一步的，所述第二抗體為羊抗鼠ige-hrp抗體。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果在于：

1、本發(fā)明所述的一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法，該方法可以不受氮?dú)獾牡南拗?，制得的四氧化三鐵納米磁珠具有很高的飽和磁化強(qiáng)度，還提高了四氧化三鐵的磁響應(yīng)性，并顯示出弱鐵磁性特點(diǎn)，改善了四氧化三鐵的磁學(xué)性質(zhì)。

2、本發(fā)明所述的一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法，該方法對(duì)四氧化三鐵納米磁珠表面進(jìn)行改性，從而制成磁性高分子微球，與堅(jiān)果過敏性血清抗體結(jié)合制成免疫磁珠，增加了免疫納米磁珠的種類和制備方法。

3、本發(fā)明所述的一種四氧化三鐵免疫納米磁珠的應(yīng)用，使免疫磁珠與酶聯(lián)免疫法結(jié)合，無需生物傳感器法、質(zhì)譜儀等昂貴設(shè)備，成本低，可以有效檢測(cè)堅(jiān)果過敏蛋白，提高預(yù)測(cè)與評(píng)估交叉過敏反應(yīng)的準(zhǔn)確性，為我國(guó)食物過敏原標(biāo)簽標(biāo)識(shí)制度的實(shí)施提供了檢測(cè)技術(shù)方法。

附圖說明

圖1為實(shí)施例2中步驟(1)得到的fe3o4納米磁珠的x射線衍射圖譜。

圖2為實(shí)施例4中步驟(1)得到的fe3o4納米磁珠的x射線衍射圖譜。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法和應(yīng)用，達(dá)到預(yù)期發(fā)明目的，以下結(jié)合較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提出的一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法和應(yīng)用，其具體實(shí)施方式、結(jié)構(gòu)、特征及其功效，詳細(xì)說明如后。在下述說明中，不同的“一實(shí)施例”或“實(shí)施例”指的不一定是同一實(shí)施例。此外，一或多個(gè)實(shí)施例中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特點(diǎn)可由任何合適形式組合。

在詳細(xì)闡述本發(fā)明一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法和應(yīng)用之前，有必要對(duì)本發(fā)明中提及的相關(guān)材料、方法等做進(jìn)一步說明，以達(dá)到更好的效果。

本發(fā)明采用化學(xué)共沉淀法制備納米磁珠，它是在有兩種或多種陽離子的溶液中加入沉淀劑，這種多元體系的溶液經(jīng)過沉淀反應(yīng)后，可以得到成分均一的沉淀，是按方程式：fe²⁺+2fe³⁺+8oh^-＝fe3o4↓+4h2o為原理進(jìn)行的。在無氮?dú)鈿怏w保護(hù)或脫氧水等限制條件下，按照一定摩爾比例配置fe²⁺、fe³⁺的水溶液，向其中加入過量naoh溶液作為沉淀劑，在一定條件下制成fe3o4納米磁珠。

本發(fā)明采用有機(jī)小分子修飾方法中的偶聯(lián)劑修飾，通過硅烷劑處理后就在納米磁珠表面引入反應(yīng)基團(tuán)，為其功能提供進(jìn)一步的化學(xué)選擇性。本發(fā)明氨基修飾磁珠用戊二醛活化，以戊二醛的兩個(gè)醛基作為橋梁，一端的醛基與磁珠表面的活性基團(tuán)結(jié)合，而另一個(gè)醛基則與陽性堅(jiān)果過敏血清抗體分子中的氨基結(jié)合，從而使抗體偶聯(lián)到磁珠表面，在檢測(cè)時(shí)，用小牛血清白蛋白封閉未結(jié)合的位點(diǎn)，從而免疫磁珠可以用于檢測(cè)堅(jiān)果過敏原。

七水合硫酸亞鐵，分子式為feso4·7h2o，分子量278.01，淺藍(lán)綠色單斜晶體，別名綠礬，易溶于水，不溶于乙醇，熔點(diǎn)為64℃，沸點(diǎn)為330℃，加熱至70-73℃失去3分子水，至80-123℃失去6分子水，至156℃以上轉(zhuǎn)變成堿式硫酸鐵。

六水合三氯化鐵，分子式為fecl3·6h2o，分子量為270.2962，中文別名有三氯化鐵(六水)、高純?nèi)然F、三氯化鐵(iii)六水合物、六水氯化鐵、六水三氯化鐵，為橘黃色的晶體，熔點(diǎn)37℃，沸點(diǎn)280-285℃，易溶于水，不溶于甘油，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚。

四氧化三鐵，化學(xué)式fe3o4，俗稱氧化鐵黑、磁鐵、吸鐵石、黑鐵，為具有磁性的黑色晶體，故又稱為磁性氧化鐵。此物質(zhì)是鐵的一種混合價(jià)態(tài)氧化物，熔點(diǎn)為1597℃，密度為5.17g/cm³，溶于酸溶液，不溶于水、堿溶液及乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。

乙醇(ethanol)俗稱酒精，是一種有機(jī)物，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式ch3ch2oh或c2h5oh，分子式c2h6o，是最常見的一元醇。乙醇液體密度是0.789g/cm³，乙醇?xì)怏w密度為1.59kg/m³，相對(duì)分子質(zhì)量為46.07g/mol，沸點(diǎn)是78.4℃，熔點(diǎn)是-114.3℃。純乙醇是無色透明的液體，有特殊香味，易揮發(fā)。

磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline，簡(jiǎn)稱pbs)的是常用的用于生物學(xué)研究的一個(gè)緩沖溶液，用于分子克隆及細(xì)胞培養(yǎng)，主要成分為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉以及氯化鉀，其配制方法不同，ph值不同，發(fā)揮的生物學(xué)作用亦不完全相同。主要用于一些化學(xué)實(shí)驗(yàn)中不影響實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的情況下調(diào)節(jié)ph值，以便讓實(shí)驗(yàn)的化學(xué)反應(yīng)在最佳條件下進(jìn)行，部分用于食品或是飼料行業(yè)加工，如食品或者飼料，真菌毒素檢驗(yàn)中elisa方法的洗板或者食品微生物檢驗(yàn)中的稀釋緩沖液。本發(fā)明中優(yōu)先選用ph＝7.4的磷酸鹽緩沖液。

aptes是一種化學(xué)物質(zhì)，3-氨丙基三乙氧基硅烷，分子式是h2nch2ch2ch2si(oc2h5)3，沸點(diǎn)217℃，，折射率1.420，為淺黃色液體，吸入有毒，易水解，放出乙醇，生成相應(yīng)的硅醇縮合物；分子中的c—nh2鍵內(nèi)氨基可與酸、羧酸酯、醛、酮、鹵代烴、酰胺和腈等進(jìn)行反應(yīng)。aptes可以用來合成有機(jī)硅中間體及高分子化合物，也可用作硅烷偶聯(lián)劑。

戊二醛，分子式為c5h8o2，分子量為100.1158，熔點(diǎn)：-5℃，沸點(diǎn)：189℃，閃點(diǎn)：66℃，密度：0.947g/cm³，帶有刺激性氣味的無色透明油狀液體，溶于熱水；可作為食品工業(yè)加工助劑，菌消毒劑、鞣革劑、木材防腐劑，藥物和高分子合成原料等。

磁分離技術(shù)是將物質(zhì)進(jìn)行磁場(chǎng)處理的一種技術(shù)，是利用液體中顆粒的磁性進(jìn)行分離，該技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)滲透到各個(gè)領(lǐng)域。在本發(fā)明中，通過施加外加磁場(chǎng)，磁珠就匯集到磁場(chǎng)一邊，吸走上清液則可以分離出磁珠。

酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法，簡(jiǎn)稱酶聯(lián)免疫法，或者elisa法。它的中心就是讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過顯色來檢測(cè)。其基本原理為①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性；②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。它的類型有雙抗體夾心法、雙位點(diǎn)一步法、間接法測(cè)抗體、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法等，本發(fā)明所述的一種應(yīng)用于檢測(cè)堅(jiān)果過敏蛋白的fe3o4免疫納米磁珠，采用的是競(jìng)爭(zhēng)法。

競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。本發(fā)明中用于檢測(cè)抗原，操作步驟如下:⑴將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體；洗滌；⑵待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)；如受檢標(biāo)本中無抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合；如受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少；參考管中只加酶標(biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)最充分的量；洗滌；⑶加底物顯色:參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多，故顏色最深；參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量；待測(cè)管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。本發(fā)明是包被抗原，酶標(biāo)二抗進(jìn)行的間接競(jìng)爭(zhēng)法，該方法的好處在于對(duì)第一抗體不存在操作影響(沒有認(rèn)為的進(jìn)行標(biāo)記或其他處理)，一抗活性好，并且抗原的包被一般不會(huì)出現(xiàn)過量包被造成ic50值較高，靈敏度降低的情況。

包被，指將抗原或抗體固定的過程，常用的包被液為ph＝7.4的磷酸鹽緩沖液、ph＝9.6的碳酸鹽緩沖液、ph＝7-8的tris-hcl緩沖液。本發(fā)明實(shí)施例中只采用了其中的一種或幾種，未采用與采用的可以起到相同的作用。

在板式elisa中，常用的洗滌液為含0.05％吐溫-20的ph＝7.4的pbs緩沖液(簡(jiǎn)稱pbst)。

封閉是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程，是為了讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)填充這些空隙，從而排斥elisa后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用的封閉劑有：0.05％-0.5％bsa(牛血清白蛋白)、10％的小牛血清、1％明膠、脫脂奶粉等，本發(fā)明優(yōu)先選用bsa；每100ml的封閉液中含有0.5g的bsa和100ml的洗滌液。

終止液，常用的終止液為硫酸，在板式elisa中一般采用2mol/l的硫酸溶液。

本發(fā)明中的底物溶液含有ph＝7.4的pbs緩沖液、鄰苯二胺和雙氧水，需要現(xiàn)用現(xiàn)配，并且避光保存。底物溶液中ph＝7.4pbs緩沖液與雙氧水的體積比為1：0.0015，每10ml的ph＝7.4的pbs緩沖液中有鄰苯二胺0.004g。

od是opticaldensity(光密度)的縮寫，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度，是檢測(cè)方法里的專有名詞，檢測(cè)單位用od值表示，od＝lg(1/trans)，其中trans為檢測(cè)物的透光值。od450是某溶液在450nm波長(zhǎng)吸收光線多少的測(cè)量。

第二抗體是能和抗體結(jié)合的，即抗體的抗體。主要用于檢測(cè)抗體的存在。第二抗體應(yīng)選用與使用的第一抗體相同的物種來源，本發(fā)明中優(yōu)先選用羊抗鼠ige-hrp抗體。

本發(fā)明中所述洗滌指向待洗滌物中加入洗滌液，混合均勻，通過磁分離，磁珠匯集到磁場(chǎng)一邊，吸走上清液則，分離出磁珠。但是磁珠不能夠完全脫除洗滌液，最終會(huì)形成含有洗滌液和磁珠的混合液。

在理想溶液中，溶液的體積有加成性，總體積等于所有成份混合前的體積和。此時(shí)的體積分?jǐn)?shù)也可稱為體積濃度，指某種成分在總體積中所占的百分比。

過量，在化學(xué)反應(yīng)中指加入某一反應(yīng)物，使另一反應(yīng)物全部發(fā)生反應(yīng),自身還有剩余。

在了解了本發(fā)明中提及的相關(guān)材料、方法等之后，下面將結(jié)合具體的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法和應(yīng)用做進(jìn)一步的詳細(xì)介紹：

實(shí)施例1.

一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法和應(yīng)用，包括以下步驟：

(1)制備納米磁珠：

①稱取2.78g的feso4·7h2o和2.703g的fecl3·6h2o，溶解于50ml的純蒸水中，得鐵鹽溶液；(feso4·7h2o物質(zhì)的量為2.78÷278.01≈0.01mol，fe²⁺的摩爾濃度為0.2mol/l，fecl3·6h2o物質(zhì)的量為2.703÷270.2962≈0.01mol，fe³⁺的摩爾濃度為0.2mol/l)

②在65℃的溫度下，先超聲鐵鹽溶液6分鐘，再放入轉(zhuǎn)子置于磁力攪拌器上高速攪拌25分鐘，同時(shí)滴加160ml的0.5mol/l氫氧化鈉溶液，隨著naoh的加入，反應(yīng)液中晶化出現(xiàn)黑色值深紅色沉淀，再靜置晶化2小時(shí)，得fe3o4沉淀；

③用磁分離架將fe3o4沉淀分離出來，先用蒸餾水洗滌2次，再無水乙醇洗滌2次，得fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液；

(2)納米磁珠的表面修飾：

①量取25ml的fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液，用無水乙醇稀釋至150ml，得稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液；

②超聲振蕩稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液30分鐘后，加入0.4ml的aptes，室溫下攪拌7小時(shí)，用磁分離架分離，得硅烷化fe3o4納米磁珠(aptes與稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液的體積比為0.4:150＝1:375)；

③用無水乙醇溶液洗滌硅烷化fe3o4納米磁珠2次，得到硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液；

④吸取1ml的硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液，用ph＝7.4的pbs緩沖液洗滌硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液3次，得磁珠混合液；

⑤向磁珠混合液中加入4ml的體積分?jǐn)?shù)為5％的戊二醛溶液,室溫下振蕩交聯(lián)2小時(shí)，再用磁分離架分離，棄去上清液，得氨基化fe3o4納米磁珠混合液；(戊二醛溶液與硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液的體積比為4:1)

(3)免疫磁珠的制備：

用0.8ml的稀釋度為1：600的堅(jiān)果過敏小鼠陽性血清包被1ml的氨基化fe3o4納米磁珠混合液，室溫下振蕩固定1.5-2.5小時(shí)，再通過磁分離器進(jìn)行分離，將上清棄掉得包被后的氨基化fe3o4納米磁珠混合液，用蒸餾水和ph＝7.4的pbs緩沖液分別洗滌4次，得fe3o4免疫納米磁珠；

(4)fe3o4免疫納米磁珠通過酶聯(lián)免疫法檢測(cè)堅(jiān)果過敏蛋白

不同稀釋度的堅(jiān)果蛋白，以核桃過敏蛋白為例：

1倍稀釋液：為核桃蛋白提取液原液。

2倍稀釋液：吸取核桃蛋白液2ml，加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml并混勻。

4倍稀釋液：吸取2倍稀釋液2ml，加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

8倍稀釋液：吸取4倍稀釋液2ml，加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

16倍稀釋液：吸取8倍稀釋液2ml，加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

①分別加入核桃蛋白提取液原液及稀釋為2倍、4倍、8倍、16倍的蛋白液，同時(shí)設(shè)pbs緩沖液為陰性對(duì)照，100μl/孔；再加入ph＝7.4的pbs緩沖液進(jìn)行包被，100μl/孔，在37℃恒溫箱內(nèi)孵育一小時(shí)，4℃過夜。

②封閉：用洗滌液洗板3次，加入封閉液，300μl/孔，在搖床上37℃震蕩孵育2小時(shí)，洗板。(洗滌液為：含0.05％吐溫-20的ph＝7.4的pbs緩沖液；每100ml的封閉液中含有0.5g的bsa和100ml的洗滌液)

③競(jìng)爭(zhēng)：每孔加入50μl核桃蛋白提取液原液及稀釋為2倍、4倍、8倍、16倍的蛋白液和50μlfe3o4免疫納米磁珠，37℃震蕩孵育2小時(shí)，用洗滌液洗板；然后每孔加入100μl的羊抗鼠ige-hrp抗體，37℃震蕩孵育1小時(shí)，用洗滌液洗板。(洗滌液為：含0.05％吐溫-20的ph＝7.4的pbs緩沖液)

④顯色：每孔加入50μl臨時(shí)配制的底物溶液并充分混合；37℃避光顯色20分鐘后，每孔加入50μl終止液并充分混合，再用酶標(biāo)儀測(cè)定od450。(底物溶液的配制：將10ml的ph＝7.4的pbs緩沖液、0.004g的鄰苯二胺和15μl的雙氧水混合，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存；終止液：2mol/l的硫酸溶液)

本實(shí)施例所述的一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法和應(yīng)用，該制備方法可以不受氮?dú)獾牡南拗?，并改善了fe3o4的磁學(xué)性質(zhì)；通過對(duì)fe3o4納米磁珠表面進(jìn)行改性，制成磁性高分子微球，與堅(jiān)果過敏性血清抗體結(jié)合制成免疫磁珠，增加了免疫納米磁珠的種類和制備方法；使免疫磁珠與酶聯(lián)免疫法結(jié)合，無需生物傳感器法、質(zhì)譜儀等昂貴設(shè)備，成本低，可以有效檢測(cè)堅(jiān)果過敏蛋白，提高預(yù)測(cè)與評(píng)估交叉過敏反應(yīng)的準(zhǔn)確性，為我國(guó)食物過敏原標(biāo)簽標(biāo)識(shí)制度的實(shí)施提供了檢測(cè)技術(shù)方法。

實(shí)施例2.

一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法和應(yīng)用，包括以下步驟：

(1)制備納米磁珠：

①稱取2.78g的feso4·7h2o和5.406g的fecl3·6h2o，溶解于50ml的純蒸水中，得鐵鹽溶液；(feso4·7h2o物質(zhì)的量為2.78÷278.01≈0.01mol，fe²⁺的摩爾濃度為0.2mol/l，fecl3·6h2o物質(zhì)的量為5.406÷270.2962≈0.02mol，fe³⁺的摩爾濃度為0.4mol/l)

②在75℃的溫度下，先超聲鐵鹽溶液4分鐘，再放入s21-i恒溫磁力攪拌器上高速攪拌35分鐘，同時(shí)滴加180ml的0.75mol/l氫氧化鈉溶液，隨著naoh的加入，反應(yīng)液中晶化出現(xiàn)黑色值深紅色沉淀，再靜置晶化3小時(shí)，得fe3o4沉淀；

③用磁分離架將fe3o4沉淀分離出來，先用蒸餾水洗滌3次，再無水乙醇洗滌3次，得fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液；

取出10個(gè)1mlfe3o4納米磁珠無水乙醇混合液放入離心管中，在有無外加磁場(chǎng)情況下觀察其磁性。將得到的fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液分裝在平皿中，于冰箱中冷凍，凍好后在冷凍干燥機(jī)中干燥12個(gè)小時(shí)，得到納米磁珠粉末，取出觀察，在顯微鏡及x射線粉末衍射儀下觀察其形態(tài)，得到如圖1所示的圖譜。

(2)納米磁珠的表面修飾：

①量取50ml的fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液，用無水乙醇稀釋至250ml，得稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液；

②超聲振蕩稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液25分鐘后，加入0.7ml的aptes，室溫下攪拌6小時(shí)，用磁分離架分離，得硅烷化fe3o4納米磁珠；(aptes與稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液的體積比為0.7:250＝1:357.143)；

③用無水乙醇溶液洗滌硅烷化fe3o4納米磁珠2次，得到硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液；

④吸取4ml的硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液，用ph＝7.4的pbs緩沖液洗滌硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液2次，得磁珠混合液；

⑤向磁珠混合液中加入12ml的體積分?jǐn)?shù)為7％的戊二醛溶液,室溫下振蕩交聯(lián)2.5小時(shí)，再用磁分離架分離，棄去上清液，得氨基化fe3o4納米磁珠混合液；(戊二醛溶液與硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液的體積比為3:1)

(3)免疫磁珠的制備：

用1.2ml的的稀釋度為1：1000的堅(jiān)果過敏小鼠陽性血清包被1ml的氨基化fe3o4納米磁珠混合液，室溫下振蕩固定1.5-2.5小時(shí)，再通過磁分離器進(jìn)行分離，將上清棄掉得包被后的氨基化fe3o4納米磁珠混合液，用蒸餾水和ph＝7.4的pbs緩沖液分別洗滌4次，得fe3o4免疫納米磁珠；

(4)fe3o4免疫納米磁珠通過酶聯(lián)免疫法檢測(cè)堅(jiān)果過敏蛋白

不同稀釋度的堅(jiān)果蛋白，以腰果過敏蛋白為例：

1倍稀釋液：為腰果蛋白提取液原液。

2倍稀釋液：吸取腰果蛋白液2ml加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

4倍稀釋液：吸取2倍稀釋液2ml加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

8倍稀釋液：吸取4倍稀釋液2ml加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

16倍稀釋液：吸取8倍稀釋液2ml加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

①分別加入腰果蛋白提取液原液及稀釋為2倍、4倍、8倍、16倍的蛋白液，同時(shí)設(shè)pbs緩沖液為陰性對(duì)照，100μl/孔；再加入ph＝7.4的pbs緩沖液進(jìn)行包被，100μl/孔，在37℃恒溫箱內(nèi)孵育1小時(shí)，再4℃過夜。

②封閉：用洗滌液洗板3次，加入封閉液，300μl/孔，在搖床上37℃震蕩孵育2小時(shí)，洗板。(洗滌液為：含0.05％吐溫-20的ph＝7.4的pbs緩沖液；每100ml的封閉液中含有0.5g的bsa和100ml的洗滌液)

③競(jìng)爭(zhēng)：每孔加入50μl腰果蛋白提取液原液及稀釋為2倍、4倍、8倍、16倍的蛋白液和50μlfe3o4免疫納米磁珠，37℃震蕩孵育2小時(shí)，用洗滌液洗板；然后每孔加入100μl的羊抗鼠ige-hrp抗體，37℃震蕩孵育1h，用洗滌液洗板。(洗滌液為：含0.05％吐溫-20的ph＝7.4的pbs緩沖液)

④顯色：每孔加入50μl臨時(shí)配制的底物溶液并充分混合；37℃避光顯色20分鐘后，每孔加入50μl終止液并充分混合，再用酶標(biāo)儀測(cè)定od450。(底物溶液的配制：將10ml的ph＝7.4的pbs緩沖液、0.004g的鄰苯二胺和15μl的雙氧水混合，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存；終止液：2mol/l的硫酸溶液)

本實(shí)施例所述的一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法和應(yīng)用，該制備方法可以不受氮?dú)獾牡南拗?，并改善了fe3o4的磁學(xué)性質(zhì)；通過對(duì)fe3o4納米磁珠表面進(jìn)行改性，制成磁性高分子微球，與堅(jiān)果過敏性血清抗體結(jié)合制成免疫磁珠，增加了免疫納米磁珠的種類和制備方法；使免疫磁珠與酶聯(lián)免疫法結(jié)合，無需生物傳感器法、質(zhì)譜儀等昂貴設(shè)備，成本低，可以有效檢測(cè)堅(jiān)果過敏蛋白，提高預(yù)測(cè)與評(píng)估交叉過敏反應(yīng)的準(zhǔn)確性，為我國(guó)食物過敏原標(biāo)簽標(biāo)識(shí)制度的實(shí)施提供了檢測(cè)技術(shù)方法。

實(shí)施例3.

一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法和應(yīng)用，包括以下步驟：

(1)制備納米磁珠：

①稱取4.17g的feso4·7h2o和5.406g的fecl3·6h2o，溶解于50ml的純蒸水中，得鐵鹽溶液；(feso4·7h2o物質(zhì)的量為4.17÷278.01≈0.015mol，fe²⁺的摩爾濃度為0.3mol/l，fecl3·6h2o物質(zhì)的量為5.406÷270.2962≈0.02mol，fe³⁺的摩爾濃度為0.4mol/l)

②在70℃的溫度下，先超聲鐵鹽溶液5分鐘，再放入s21-i恒溫磁力攪拌器上高速攪拌30分鐘，同時(shí)滴加150ml的1mol/l氫氧化鈉溶液，隨著naoh的加入，反應(yīng)液中晶化出現(xiàn)黑色值深紅色沉淀，再靜置晶化2.5小時(shí)，得fe3o4沉淀；

③用磁分離架將fe3o4沉淀分離出來，先用蒸餾水洗滌3次，再無水乙醇洗滌2次，得fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液；

(2)納米磁珠的表面修飾：

①量取25ml的fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液，用無水乙醇稀釋至175ml，得稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液；

②超聲振蕩稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液35分鐘后，加入0.5ml的aptes，室溫下攪拌8小時(shí)，用磁分離架分離，得硅烷化fe3o4納米磁珠；(aptes與稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液的體積比為0.5:175＝1:350)；

③用無水乙醇溶液洗滌硅烷化fe3o4納米磁珠3次，得到硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液；

④吸取1ml的硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液，用ph＝7.4的pbs緩沖液洗滌硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液3次，得磁珠混合液；

⑤向磁珠混合液中加入5ml的體積分?jǐn)?shù)為3％的戊二醛溶液,室溫下振蕩交聯(lián)1.5小時(shí)，再用磁分離架分離，棄去上清液，得氨基化fe3o4納米磁珠混合液；(戊二醛溶液與硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液的體積比為5:1)

(3)免疫磁珠的制備：

用1ml的稀釋度為1：800的堅(jiān)果過敏小鼠陽性血清包被1ml的氨基化fe3o4納米磁珠混合液，室溫下振蕩固定1.5小時(shí)，再通過磁分離器進(jìn)行分離，將上清棄掉得包被后的氨基化fe3o4納米磁珠混合液，用蒸餾水和ph＝7.4的pbs緩沖液分別洗滌4次，得fe3o4免疫納米磁珠；

(4)fe3o4免疫納米磁珠通過酶聯(lián)免疫法檢測(cè)堅(jiān)果過敏蛋白

不同稀釋度的堅(jiān)果蛋白，以松子過敏蛋白為例：

1倍稀釋液：為松子蛋白提取液原液。

2倍稀釋液：吸取松子蛋白液2ml加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

4倍稀釋液：吸取2倍稀釋液2ml加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

8倍稀釋液：吸取4倍稀釋液2ml加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

16倍稀釋液：吸取8倍稀釋液2ml加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

①分別加入松子蛋白提取液原液及稀釋為2倍、4倍、8倍、16倍的蛋白液，同時(shí)設(shè)pbs緩沖液為陰性對(duì)照，100μl/孔；再加入ph＝7.4的pbs緩沖液進(jìn)行包被，100μl/孔，在37℃恒溫箱內(nèi)孵育一小時(shí)后，4℃過夜。

②封閉：用洗滌液洗板3次，加入封閉液，300μl/孔，在搖床上37℃震蕩孵育2小時(shí)，洗板。(洗滌液為：含0.05％吐溫-20的ph＝7.4的pbs緩沖液；每100ml的封閉液中含有0.5g的bsa和100ml的洗滌液)

③競(jìng)爭(zhēng)：每孔加入50μl松子蛋白提取液原液及稀釋為2倍、4倍、8倍、16倍的蛋白液和50μlfe3o4免疫納米磁珠，37℃震蕩孵育2小時(shí)，用洗滌液洗板；然后每孔加入100μl的羊抗鼠ige-hrp抗體，37℃震蕩孵育1小時(shí)，用洗滌液洗板。(洗滌液為：含0.05％吐溫-20的ph＝7.4的pbs緩沖液)

④顯色：每孔加入50μl臨時(shí)配制的底物溶液并充分混合；37℃避光顯色20分鐘后，每孔加入50μl終止液并充分混合，再用酶標(biāo)儀測(cè)定od450。(底物溶液的配制：將10ml的ph＝7.4的pbs緩沖液、0.004g的鄰苯二胺和15μl的雙氧水混合，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存；終止液：2mol/l的硫酸溶液)

本實(shí)施例所述的一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法和應(yīng)用，該制備方法可以不受氮?dú)獾牡南拗?，并改善了fe3o4的磁學(xué)性質(zhì)；通過對(duì)fe3o4納米磁珠表面進(jìn)行改性，制成磁性高分子微球，與堅(jiān)果過敏性血清抗體結(jié)合制成免疫磁珠，增加了免疫納米磁珠的種類和制備方法；使免疫磁珠與酶聯(lián)免疫法結(jié)合，無需生物傳感器法、質(zhì)譜儀等昂貴設(shè)備，成本低，可以有效檢測(cè)堅(jiān)果過敏蛋白，提高預(yù)測(cè)與評(píng)估交叉過敏反應(yīng)的準(zhǔn)確性，為我國(guó)食物過敏原標(biāo)簽標(biāo)識(shí)制度的實(shí)施提供了檢測(cè)技術(shù)方法。

實(shí)施例4.

一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法和應(yīng)用，包括以下步驟：

(1)制備納米磁珠：

①稱取9.73g的feso4·7h2o和10.812g的fecl3·6h2o，溶解于100ml的純蒸水中，得鐵鹽溶液；(feso4·7h2o物質(zhì)的量為9.73÷278.01≈0.035mol，fe²⁺的摩爾濃度為0.35mol/l，fecl3·6h2o物質(zhì)的量為10.812÷270.2962≈0.04mol，fe³⁺的摩爾濃度為0.4mol/l)

②在68℃的溫度下，先超聲鐵鹽溶液5分鐘，再放入(轉(zhuǎn)子置于磁力攪拌器上高速攪拌28分鐘，同時(shí)滴加340ml的0.9mol/l氫氧化鈉溶液，隨著naoh的加入，反應(yīng)液中晶化出現(xiàn)黑色值深紅色沉淀，再靜置晶化3小時(shí)，得fe3o4沉淀；

③用磁分離架將fe3o4沉淀分離出來，先用蒸餾水洗滌2次，再無水乙醇洗滌3次，得fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液；

取出10個(gè)1mlfe3o4納米磁珠無水乙醇混合液放入離心管中，在有無外加磁場(chǎng)情況下觀察其磁性。將得到的fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液分裝在平皿中，于冰箱中冷凍，凍好后在冷凍干燥機(jī)中干燥12個(gè)小時(shí)，得到納米磁珠粉末，取出觀察，在顯微鏡及x射線粉末衍射儀下觀察其形態(tài)，得到圖2所示的圖譜。

(2)納米磁珠的表面修飾：

①量取25ml的fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液，用無水乙醇稀釋至140ml，得稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液；

②超聲振蕩稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液28分鐘后，加入0.4ml的aptes，室溫下攪拌6.5小時(shí)，用磁分離架分離，得硅烷化fe3o4納米磁珠；(aptes與稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液的體積比為0.4:140＝1:350)；

③用無水乙醇溶液洗滌硅烷化fe3o4納米磁珠3次，得到硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液；

④吸取1ml的硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液，用ph＝7.4的pbs緩沖液洗滌硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液2次，每次ph＝7.4的pbs緩沖液的用量為2ml，得磁珠混合液；

⑤向磁珠混合液中加入3ml的體積分?jǐn)?shù)為6％的戊二醛溶液,室溫下振蕩交聯(lián)2小時(shí)，再用磁分離架分離，棄去上清液，得氨基化fe3o4納米磁珠混合液；(戊二醛溶液與硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液的體積比為3:1)

(3)免疫磁珠的制備：

用0.9ml的稀釋度為1：700的堅(jiān)果過敏小鼠陽性血清包被1ml的氨基化fe3o4納米磁珠混合液，室溫下振蕩固定2.5小時(shí)，再通過磁分離器進(jìn)行分離，將上清棄掉得包被后的氨基化fe3o4納米磁珠混合液，用蒸餾水和ph＝7.4的pbs緩沖液分別洗滌3次，得fe3o4免疫納米磁珠；

(4)fe3o4免疫納米磁珠通過酶聯(lián)免疫法檢測(cè)堅(jiān)果過敏蛋白

不同稀釋度的堅(jiān)果蛋白，以榛子過敏蛋白為例：

1倍稀釋液：為榛子蛋白提取液原液。

2倍稀釋液：吸取榛子蛋白液2ml加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

4倍稀釋液：吸取2倍稀釋液2ml加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

8倍稀釋液：吸取4倍稀釋液2ml加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

16倍稀釋液：吸取8倍稀釋液2ml加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

①分別加入榛子蛋白提取液原液及稀釋為2倍、4倍、8倍、16倍的蛋白液，同時(shí)設(shè)pbs緩沖液為陰性對(duì)照，100μl/孔；再加入ph＝7.4的pbs緩沖液進(jìn)行包被，100μl/孔，在37℃恒溫箱內(nèi)孵育一小時(shí)后，4℃過夜。

②封閉：用洗滌液洗板3次，加入封閉液，300μl/孔，在搖床上37℃震蕩孵育2小時(shí)，洗板。(洗滌液為：含0.05％吐溫-20的ph＝7.4的pbs緩沖液；每100ml的封閉液中含有0.5g的bsa和100ml的洗滌液)

③競(jìng)爭(zhēng)：每孔加入50μl榛子蛋白提取液原液及稀釋為2倍、4倍、8倍、16倍的蛋白液和50μlfe3o4免疫納米磁珠，37℃震蕩孵育2小時(shí)，用洗滌液洗板；然后每孔加入100μl的羊抗鼠ige-hrp抗體，37℃震蕩孵育1小時(shí)，用洗滌液洗板。(洗滌液為：含0.05％吐溫-20的ph＝7.4的pbs緩沖液)

④顯色：每孔加入50μl臨時(shí)配制的底物溶液并充分混合；37℃避光顯色20分鐘后，每孔加入50μl終止液并充分混合，再用酶標(biāo)儀測(cè)定od450。(底物溶液的配制：將10ml的ph＝7.4的pbs緩沖液、0.004g的鄰苯二胺和15μl的雙氧水混合，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存；終止液：2mol/l的硫酸溶液)

表1n(fe²⁺)∶n(fe³⁺)為1.75:2時(shí)樣品x射線粉末衍射數(shù)據(jù)表

由表1以及圖1和圖2的對(duì)比可知，使用n(fe²⁺)∶n(fe³⁺)為1.75:2比例所制備的納米磁性微球純度較高。由于制備fe3o4磁性微球理論上n(fe²⁺)∶n(fe³⁺)為1:2，所以在反應(yīng)過程中應(yīng)該是有部分損耗，綜合分析得出，此種損耗是由于fe²⁺在空氣中易被氧化。

本實(shí)施例所述的一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法和應(yīng)用，該制備方法可以不受氮?dú)獾牡南拗?，并改善了fe3o4的磁學(xué)性質(zhì)；通過對(duì)fe3o4納米磁珠表面進(jìn)行改性，制成磁性高分子微球，與堅(jiān)果過敏性血清抗體結(jié)合制成免疫磁珠，增加了免疫納米磁珠的種類和制備方法；使免疫磁珠與酶聯(lián)免疫法結(jié)合，無需生物傳感器法、質(zhì)譜儀等昂貴設(shè)備，成本低，可以有效檢測(cè)堅(jiān)果過敏蛋白，提高預(yù)測(cè)與評(píng)估交叉過敏反應(yīng)的準(zhǔn)確性，為我國(guó)食物過敏原標(biāo)簽標(biāo)識(shí)制度的實(shí)施提供了檢測(cè)技術(shù)方法。

實(shí)施例5.

一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法和應(yīng)用，包括以下步驟：

(1)制備納米磁珠：

①稱取2.78g的feso4·7h2o和4.055g的fecl3·6h2o，溶解于50ml的純蒸水中，得鐵鹽溶液；(feso4·7h2o物質(zhì)的量為2.78÷278.01≈0.01mol，fe²⁺的摩爾濃度為0.2mol/l，fecl3·6h2o物質(zhì)的量為4.055÷270.2962≈0.015mol，fe³⁺的摩爾濃度為0.3mol/l)

②在72℃的溫度下，先超聲鐵鹽溶液5分鐘，再放入s21-i恒溫磁力攪拌器上高速攪拌33分鐘，同時(shí)滴加140ml的0.8mol/l氫氧化鈉溶液，隨著naoh的加入，反應(yīng)液中晶化出現(xiàn)黑色值深紅色沉淀，再靜置晶化3小時(shí)，得fe3o4沉淀；

③用磁分離架將fe3o4沉淀分離出來，先用蒸餾水洗滌2次，再無水乙醇洗滌2次，得fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液；

(2)納米磁珠的表面修飾：

①量取25ml的fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液，用無水乙醇稀釋至160ml，得稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液；

②超聲振蕩稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液32分鐘后，加入0.4ml的aptes，室溫下攪拌7.5小時(shí)，用磁分離架分離，得硅烷化fe3o4納米磁珠；(aptes與稀釋后的納米磁珠無水乙醇混合液的體積比為0.4:160＝1:400)；

③用無水乙醇溶液洗滌硅烷化fe3o4納米磁珠3次，得到硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液；

④吸取1ml的硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液，用ph＝7.4的pbs緩沖液洗滌硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液2次，得磁珠混合液；

⑤向磁珠混合液中加入5ml的體積分?jǐn)?shù)為4％的戊二醛溶液,室溫下振蕩交聯(lián)2.5小時(shí)，再用磁分離架分離，棄去上清液，得氨基化fe3o4納米磁珠混合液；(戊二醛溶液與硅烷化fe3o4納米磁珠無水乙醇混合液的體積比為5:1)

(3)免疫磁珠的制備：

用1.1ml的稀釋度為1：700的堅(jiān)果過敏小鼠陽性血清包被1ml的氨基化fe3o4納米磁珠混合液，室溫下振蕩固定1.5-2.5小時(shí)，再通過磁分離器進(jìn)行分離，將上清棄掉得包被后的氨基化fe3o4納米磁珠混合液，用蒸餾水和ph＝7.4的pbs緩沖液分別洗滌3次，得fe3o4免疫納米磁珠；

(4)fe3o4免疫納米磁珠通過酶聯(lián)免疫法檢測(cè)堅(jiān)果過敏蛋白

不同稀釋度的堅(jiān)果蛋白，以杏仁過敏蛋白為例：

1倍稀釋液：為杏仁蛋白提取液原液。

2倍稀釋液：吸取杏仁蛋白液2ml加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

4倍稀釋液：吸取2倍稀釋液2ml加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

8倍稀釋液：吸取4倍稀釋液2ml加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

16倍稀釋液：吸取8倍稀釋液2ml加入ph＝7.4的pbs緩沖液2ml后混勻。

①分別加入杏仁蛋白提取液原液及稀釋為2倍、4倍、8倍、16倍的蛋白液，同時(shí)設(shè)pbs緩沖液為陰性對(duì)照，100μl/孔；再加入ph＝7.4的pbs緩沖液進(jìn)行包被，100μl/孔，在37℃恒溫箱內(nèi)孵育1小時(shí)，4℃過夜。

②封閉：用洗滌液洗板3次，加入封閉液，300μl/孔，在搖床上37℃震蕩孵育2小時(shí)，洗板。(洗滌液為：含0.05％吐溫-20的ph＝7.4的pbs緩沖液；每100ml的封閉液中含有0.5g的bsa和100ml的洗滌液)

③競(jìng)爭(zhēng)：每孔加入50μl杏仁蛋白提取液原液及稀釋為2倍、4倍、8倍、16倍的蛋白液和50μlfe3o4免疫納米磁珠，37℃震蕩孵育2小時(shí)，用洗滌液洗板；然后每孔加入100μl的羊抗鼠ige-hrp抗體，37℃震蕩孵育1小時(shí)，用洗滌液洗板。(洗滌液為：含0.05％吐溫-20的ph＝7.4的pbs緩沖液)

④顯色：每孔加入50μl臨時(shí)配制的底物溶液并充分混合；37℃避光顯色20分鐘后，每孔加入50μl終止液并充分混合，再用酶標(biāo)儀測(cè)定od450。(底物溶液的配制：將10ml的ph＝7.4的pbs緩沖液、0.004g的鄰苯二胺和15μl的雙氧水混合，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存；終止液：2mol/l的硫酸溶液)

本實(shí)施例所述的一種四氧化三鐵免疫納米磁珠及其制備方法和應(yīng)用，該制備方法可以不受氮?dú)獾牡南拗?，并改善了fe3o4的磁學(xué)性質(zhì)；通過對(duì)fe3o4納米磁珠表面進(jìn)行改性，制成磁性高分子微球，與堅(jiān)果過敏性血清抗體結(jié)合制成免疫磁珠，增加了免疫納米磁珠的種類和制備方法；使免疫磁珠與酶聯(lián)免疫法結(jié)合，無需生物傳感器法、質(zhì)譜儀等昂貴設(shè)備，成本低，可以有效檢測(cè)堅(jiān)果過敏蛋白，提高預(yù)測(cè)與評(píng)估交叉過敏反應(yīng)的準(zhǔn)確性，為我國(guó)食物過敏原標(biāo)簽標(biāo)識(shí)制度的實(shí)施提供了檢測(cè)技術(shù)方法。

以上所述，僅是本發(fā)明實(shí)施例的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明實(shí)施例作任何形式上的限制，依據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明實(shí)施例技術(shù)方案的范圍內(nèi)。