本發(fā)明屬微生物檢測領(lǐng)域，具體涉及基于免疫磁珠和mno2納米粒子檢測副溶血性弧菌試劑盒。

背景技術(shù)：

副溶血性弧菌（vibrioparahaemolyticus，vp）是一種革蘭氏陰性非芽孢嗜鹽菌，是常見的食源性致病菌之一。該菌主要來源于蝦，魚和貝類等海產(chǎn)品中，主要通過污染的海產(chǎn)品引起人類急性胃腸炎、傷口感染和敗血癥等。近幾年來，隨著食用海產(chǎn)品的人群在不斷擴增，由副溶血性弧菌引起的食物中毒呈上升趨勢，據(jù)報道，自1998年以來，副溶血性弧菌引起的食物中毒已超過沙門菌食物中毒，成為最嚴(yán)重的食源性病原菌。目前，該菌是多數(shù)進出口水產(chǎn)品必檢的致病菌。

當(dāng)前，我國副溶血性弧菌的傳統(tǒng)檢測方法以微生物培養(yǎng)法為主，全程大概需要5-8天，操作繁瑣，耗時長，已不能滿足人們對食品安全檢測快速簡便的要求。隨著技術(shù)的不斷進步，推動著檢測方法的不斷發(fā)展，越來越多的方法應(yīng)用于檢測副溶血性弧菌，如pcr技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附法（elisa）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（lamp）等。pcr技術(shù)可在短時間內(nèi)放大檢測目標(biāo)，具有靈敏度高的特點，但是pcr操作過程要求高且易出現(xiàn)假陽性。elisa法利用抗原-抗體的特異性結(jié)合檢測，對設(shè)備要求低，但是耗時長，靈敏度相對而言較低。lamp作為一個新興的檢測技術(shù)，具有費用低，靈敏度高，特異性高等特點，但是lamp需要先選擇性增菌培養(yǎng)，因此不利于樣品的現(xiàn)場檢測，而且有可能進入新的污染。所以，非常必要有開發(fā)一種快速，靈敏度高，特異性強的檢測手段，來監(jiān)控食源性致病菌，以保障人們的食品安全。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種快速、靈敏、簡便的副溶血性弧菌檢測的基于免疫磁珠和mno2納米粒子檢測副溶血性弧菌試劑盒。

基于免疫磁珠和mno2納米粒子檢測副溶血性弧菌試劑盒，它包括：羧基化fe3o4納米粒子與抗副溶血性弧菌兔多抗偶聯(lián)的免疫磁珠和mno2納米粒子與抗副溶血性弧菌特異性雞卵黃抗體igy偶聯(lián)的mno2納米探針。

快速檢測食品副溶血性弧菌的方法，它包括：

1）納米磁珠的制備：

添加1.08gfecl3.6h2o到22ml乙二醇中，超聲溶解10min，；再添加1.2gnaac和0.2g檸檬酸鈉超聲10min，；最后，添加0.2gpeg6000于上述溶液中，超聲混勻，將所得均質(zhì)溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，于199℃烘箱中反應(yīng)18h；用永磁鐵從反應(yīng)溶液中分離中黑色的固體物質(zhì)，用超純水和乙醇交替清洗3-5次，得到羧基化fe3o4納米粒子；

2）免疫磁珠的制備：

取0.5mg羧基化fe3o4納米粒子，用pbs洗2次，用1mlpbs重懸，加入10mgedc和10mgnhs活化羧基，30min后，磁吸附，去上清，pbs洗3次，1mlpbs重懸，加入50μg抗副溶血性弧菌兔多抗，室溫反應(yīng)2h，磁分離，去上清，pbs洗3次，加入1ml封閉液封閉1h，得到功能化免疫磁珠；

3）納米mno2粒子的制備：

添加25mg牛血清白蛋白于10mlpbs中，攪拌混勻，加入100μlmnso4.h2o(0.1m)于混合液中，攪拌2min，再向其加入1m的naoh100μl，攪拌6-7h后，用超純水透析48h，15000rpm離心，得到mno2納米粒子；

4）mno2納米探針的制備：

取1mgmno2納米粒子，pbs重懸，加入1mgedc和1.5mgnhs活化15min，加入50μg抗副溶血性弧菌特異性雞卵黃抗體igy，反應(yīng)2h，15000rpm離心，得到功能化mno2納米探針；

5）副溶血性弧菌的檢測：

取待測樣品液100μl，mno2納米探針100μl，免疫磁珠0.5mg重懸為800μl于室溫反應(yīng)30min,磁分離，去上清，pbs洗3遍，加入1ml檸檬酸鹽緩沖液和10μltmb顯色10min，于紫外分光光度計測吸收光譜；

所述的pbs緩沖液為8gnacl，0.2gkcl，3.63gna2hpo4.12h2o，0.24gkh2po4溶于1l超純水中，調(diào)節(jié)ph至7.4；

所述的封閉液為10mg牛血清白蛋白（bsa）加入1mlpbs緩沖液中，現(xiàn)用現(xiàn)配；

所述的檸檬酸鹽緩沖液為0.73gna2hpo4.2h2o、0.4665g檸檬酸溶于50ml超純水中，調(diào)節(jié)ph至5；

所述的步驟1）fe3o4納米粒子尺寸為130-330nm。

本發(fā)明提供了基于免疫磁珠和mno2納米粒子檢測副溶血性弧菌試劑盒，制備具有超順磁性的磁珠，將該磁珠與副溶血性弧菌多克隆抗體偶聯(lián)；合成mno2納米粒子，將該納米粒子與副溶血性弧菌特異性雞卵黃抗體偶聯(lián)；取待測液，將其與兩種探針混合，使用磁力架分離磁珠-菌體-mno2復(fù)合物，用檸檬酸鹽緩沖液重懸該混合物，加入tmb顯色，從而實現(xiàn)副溶血性弧菌快速特異性檢測。該發(fā)明提出利用免疫磁珠和mno2納米粒子技術(shù)對副溶血性弧菌檢測，利用elisa方法的免疫學(xué)反應(yīng)顯色，縮短了檢測時間，定量檢測時變異系數(shù)小。最低檢測濃度為10cfu/ml，加標(biāo)回收率達到96.7%，靈敏度高，穩(wěn)定性好。

附圖說明

圖1免疫磁珠和mno2納米探針對副溶血性弧菌的檢測流程圖。

具體實施方式

實施例1副溶血性弧菌兔克隆抗體igg的制備

取濃度為1×10⁹cfu·ml^-1滅活菌液與等量的弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑乳化完全，制備滅活疫苗。首次免疫取濃度為1×10⁹cfu·ml^-1弗氏完全佐劑疫苗免疫健康新西蘭大白兔（由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），采用背部皮下多點注射法，每只免疫2ml，在第二周、第三周采用同等劑量的弗氏不完全佐劑疫苗對兔進行第二次免疫、第三次免疫。10天后，用滅活菌液加強免疫兩次。每次免疫前兔耳緣靜脈取血，測定血清效價。達到分離標(biāo)準(zhǔn)，兔心臟采血，分離血清，得到抗副溶血性弧菌的抗血清。采用飽和硫酸銨鹽析沉淀法對所述的抗血清中的多克隆抗體igg進行純化；采用間接elisa法對純化后抗體的效價和特異性進行測定，表1為免疫前后兔血清及抗體效價測定結(jié)果，結(jié)果顯示，隨著免疫次數(shù)的增加，血清抗體效價逐漸升高，最終獲得的副溶血性弧菌兔多克隆抗體效價可以達到1:1024000；表2為兔多克隆抗體igg特異性結(jié)果，結(jié)果顯示，制備的抗體特異性較好；采用bca蛋白定量試劑盒對純化后的igg抗體的濃度進行測定，并用pbs緩沖液將其蛋白濃度調(diào)整為1mg/ml，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2副溶血性弧菌雞卵黃抗體igy的制備

取濃度為1×10⁹cfu·ml^-1滅活菌液與等量的弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑乳化完全，制備滅活疫苗，用來免疫蛋雞。采用肌肉多點注射的方式將疫苗接種于雞胸。首次免疫采用弗氏完全佐劑疫苗，每只雞1ml，間隔兩周后采用弗氏不完全佐劑疫苗進行第二次免疫，隨后每隔兩周進行一次強化免疫。收集免疫前后的雞蛋，儲存于4℃冰箱中備用。采用peg6000鹽析法對雞蛋中的卵黃抗體進行提取。采用間接elisa法對純化前后卵黃抗體的效價和特異性進行測定，表3為免疫前后雞血清及抗體igy效價測定結(jié)果，結(jié)果顯示，隨著免疫次數(shù)的增加，雞血清中的抗體效價逐漸升高，最后一次免疫后，抗體效價高達1：64000，經(jīng)提取純化后，最終獲得的副溶血性弧菌igy抗體效價可以達到1:128000。表4為雞卵黃抗體igy特異性結(jié)果，結(jié)果顯示制備的igy抗體特異性較好；采用bca蛋白定量試劑盒對純化后的igy抗體的濃度進行測定，并用pbs緩沖液將其蛋白濃度調(diào)整為1mg/ml，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例3免疫磁珠的制備

添加1.08gfecl3.6h2o到22ml乙二醇中，超聲溶解10min，形成紅棕色溶液；再添加1.2gnaac和0.2g檸檬酸鈉到該溶液中，超聲10min，形成暗紅色溶液；最后，添加0.2gpeg6000于上述溶液中，超聲混勻，將所得均質(zhì)溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，于199℃烘箱中反應(yīng)18h。用永磁鐵從反應(yīng)溶液中分離中黑色的固體物質(zhì)，用超純水和乙醇交替清洗3-5次，得到fe3o4納米粒子；取0.5mg羧基化fe3o4納米粒子，用pbs洗2次，用1mlpbs重懸，加入10mgedc和10mgnhs活化羧基，30min后，磁吸附，去上清，pbs洗3次，1mlpbs重懸，加入50μg抗副溶血性弧菌兔多克隆抗體，室溫反應(yīng)2h，磁分離，去上清，pbs洗3次，加入1ml封閉液封閉1h，得到功能化免疫磁珠。

實施例4mno2納米探針的制備

添加25mg牛血清白蛋白（bsa）于10mlpbs中，攪拌混勻，加入100μlmnso4.h2o(0.1m)于混合液中，攪拌2min，溶液變成乳白色，再向其加入100μlnaoh(1m)，溶液由乳白色漸變?yōu)樽攸S色，攪拌6-7h后，用超純水透析48h，15000rpm離心，得到mno2納米粒子；取1mgmno2納米粒子，pbs重懸，加入1mgedc和1.5mgnhs活化15min，加入50μg抗副溶血性弧菌特異性雞卵黃抗體（igy），反應(yīng)2h，15000rpm離心，得到功能化mno2納米探針。

實施例5緩沖液的配置

pbs緩沖液:取8gnacl，0.2gkcl，3.63gna2hpo4.12h2o，0.24gkh2po4溶于1l超純水中，調(diào)節(jié)ph至7.4。

實施例6菌液標(biāo)準(zhǔn)品的制備

取-80℃保存菌種，進行菌株活化。將活化后的菌株在3%氯化鈉胰蛋白胨瓊脂平板上劃線分純，37℃培養(yǎng)18~24h后，挑取單個菌落，接種3%氯化鈉胰蛋白胨液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12~18h。取1ml菌液10倍倍比稀釋平板傾注法進行活菌計數(shù)。剩余的菌液用1%甲醛在室溫下滅活10min，將滅活的菌液3000rpm離心3min，收集菌體，然后用pbs溶液充分混勻，制成菌懸液并，用pbs溶液調(diào)節(jié)菌懸液濃度為10⁹cfu·ml^-1，存于4℃冰箱中備用。

實施例7基于免疫磁珠和mno2納米粒子檢測副溶血性弧菌的方法

檢測流程圖如圖1。取待測樣品液100μl，mno2納米探針100μl，免疫磁珠0.5mg重懸800μl于室溫反應(yīng)30min,磁分離，去上清，pbs洗3遍，加入1ml檸檬酸鹽緩沖液和10μltmb顯色10min，于紫外分光光度計測吸收光譜。參考所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，確定樣品中副溶血性弧菌的數(shù)量。定量檢測該菌濃度的范圍在10-10⁵cfu/ml.本發(fā)明方法檢測穩(wěn)定，檢測限可低至10cfu/ml，檢測時間短，檢測效果好。對副溶血性弧菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌（lm）、志賀菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌o157：h7等菌進行檢測，只有副溶血性弧菌的檢測結(jié)果呈陽性，其余均為陰性，該方法特異性強，未見假陽性和假陰性結(jié)果，結(jié)果如表5。

注：<+>表示副溶血性弧菌陽性，<->表示副溶血性弧菌陰性。

實施例8試劑盒的制備

由實施例3所描述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠、實施4例所描述的mno2納米探針、實施例5所描述的緩沖液、實施例6所描述的菌液標(biāo)準(zhǔn)品共同組成基于免疫磁珠和mno2納米粒子檢測副溶血性弧菌的試劑盒。

實施例9模擬樣品的檢測

制備蛤蜊浸出液：精確稱取5g蛤蜊肉，加入5ml滅菌pbs，研磨均勻后，用濾紙過濾，用0.22μm濾膜對濾出液進行抽濾；取不同濃度的副溶血性弧菌接種于該浸出液中，用本發(fā)明檢測方法對其進行檢測。取待測樣品液100μl，mno2納米探針100μl，免疫磁珠0.5mg重懸800μl于室溫反應(yīng)30min,磁分離，去上清，pbs洗3遍，加入1ml檸檬酸鹽緩沖液和10μltmb顯色10min，于紫外分光光度計測吸收光譜。

參考所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，確定樣品中副溶血性弧菌的數(shù)量。定量檢測該菌濃度的范圍在10-10³cfu/ml.本發(fā)明方法檢測穩(wěn)定，加標(biāo)回收率達到96.7%。