一種制備刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體用于dna損傷的檢測方法，屬于分析化學
技術領域：
及食品安全
技術領域：
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背景技術：
：dna是生命體的重要遺傳物質，但是dna損傷是在生物體內經常發(fā)生的事情。外源性的化學或者生物物質及其代謝物，例如生物毒素及其代謝物，經常會對細胞中的dna造成氧化（堿基氧化、堿基脫落或單、雙鏈斷裂）和/或堿基修飾（堿基加合物、堿基甲基化或形成嘧啶二聚體）等在內的結構性損傷。此類損傷的dna很容易造成基因突變甚至造成機體的癌變。因此，開展dna損傷檢測對與環(huán)境監(jiān)測和食品安全（特別是跨境食品安全）等都密切相關，目前急需發(fā)展針對dna損傷產物的高特異性、高靈敏的新型快速檢測技術，實現外源性的化學與生物物質對dna損傷的程度進行準確和定量分析。圓二色光譜的產生是由于體系中的手性物質對左右圓偏振光的吸收不同。目前，圓二色光譜主要是通過測量生物大分子的光譜學信號，從而對其二級或者三級結構進行解析。近年來，手性納米組裝超結構成為人們關注的研究熱點問題，特別是自從我們在2009年成功構建了具有類似有機手性碳的等離子納米手性四面體結構以來，等離子手性光學活性已經成功吸引了大量科學界和工業(yè)界的關注。生物分子的圓二色光譜學信號主要是位于紫外區(qū)域，天然的生物分子的圓二色光譜信號位于可見光區(qū)域。而等離子手性圓二色光譜學信號不同于生物分子的圓二色光譜學信號，其不僅僅在傳統(tǒng)的生物分子往往處于的紫外區(qū)域具有較強的光譜學信號，其還在可見光/近紅外區(qū)域產生了極強的圓二色光譜學信號，并且更為重要的是，等離子手性信號的靈敏度要遠遠高于目前檢測分析中最靈敏的放射性傳感信號。我們通過研究發(fā)現，該等離子手性無機納米組裝體在可見光/近紅外區(qū)域的信號的強度和信號的光譜學位置與納米級組裝基元的元素、尺寸、構型和其相應的產率息息相關，充分說明了等離子手性光譜學信號可成功應用于生物傳感檢測領域。利用核酸進行組裝形成刺狀鉑包裹的金納米棒二聚體產生可見光/近紅外區(qū)域的圓二色光譜信號進而用于生物毒素及其代謝物對dna損傷的檢測尚屬空白。技術實現要素：本發(fā)明的目的是提供一種刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體的制備方法，構建了利用等離子圓二色光譜信號檢測dna損傷的新技術。本發(fā)明的技術方案，一種制備刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體用于dna損傷的檢測方法。本發(fā)明的主要實施步驟為：（1）金納米棒的合成；（2）刺狀型鉑包覆金納米棒的合成；（3）刺狀鉑包裹的金納米棒結構表面定向核酸功能化；（4）構建刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體；（5）生物毒素對dna的預損傷；（6）刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體對dna損傷的檢測。具體步驟為：（1）金納米棒的合成按照專利《一種具有表面增強拉曼活性的自組裝材料的制備方法》（專利號：zl201010605799.9）的方法合成長徑比約為3.0的金納米棒。簡單的步驟如下：①晶種合成：28.0℃下取0.1ml的預先配置的2g/l的三水合四氯金酸加入到1ml的0.2m的十六烷基三甲基溴化銨溶液中，此時，溶液顏色由無色變成黃褐色。然后向上述混合體系中加入0.12ml的新配制的0.01m硼氫化鈉溶液快速攪拌2分鐘。溶液顏色即由黃褐色變?yōu)闇\棕色。將上述合成的晶種放入28.0℃的水浴鍋中靜置反應30分鐘，使未完全參與晶種合成的硼氫化鈉消耗殆盡，（一是硼氫化鈉進一步還原體系中未完全反應的金離子而被消耗，二是在靜置反應過程中硼氫化鈉由于水解導致其含量進一步降低），制備的晶種要在合成后4小時內進行下一步反應。②金納米棒生長過程：晶種合成完成以后，進行金納米棒的生長。5ml的2g/l的三水合四氯金酸加入到5ml0.2m的十六烷基三甲基溴化銨中后加入4ml的超純水，混勻。0.125ml的0.01m硝酸銀溶液加入到上述混合體系中，混勻，隨后將65μl的0.1m抗壞血酸溶液加入上述體系溶液，28.0℃下劇烈攪拌反應2分鐘，溶液由褐色變成無色。最后，加入0.05ml的晶種溶液輕柔攪拌混勻20秒。28.0℃反應2小時后溶液的顏色為土褐色。合成的金納米棒溶液經過10000轉每分鐘離心10分鐘，棄上清，采用0.005m的十六烷基三甲基溴化銨溶液將沉淀進行重分散，清洗一次，最終將金納米棒溶液分散在與初始等體積的溶液中，室溫靜置保存，以便進行下一步的表征及實驗需求。（2）刺狀型鉑包覆金納米棒的合成方法向5ml的金納米棒溶液中，加入50μm的碘化鈉，后加入10ml的0.05m的十六烷基三甲基溴化銨后，混勻，隨后加入500μl的0.2mm的硝酸銀溶液，混勻，再加入500μl的0.1m的抗壞血酸溶液，混勻，70℃孵育1h后，加入480μl的0.1m的鹽酸和440μl2mm的氯鉑酸，在70℃孵育反應4h后，6500rpm離心10min，棄上清，采用5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液分散，待用；（3）刺狀型鉑包覆金納米棒表面定向核酸功能化①刺狀型鉑包覆金納米棒對其進行端面封閉：取上述制備好的10nm的刺狀型鉑包覆金納米棒2ml，加入30μl的1mm的二硫蘇糖醇溶液，混勻，振搖反應4h，采用6000rpm離心5min，棄上清，用2ml的5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液分散金納米棒-二硫蘇糖醇的復合物，4℃保藏、備用；②刺狀型鉑包覆金納米棒側面定向修飾dna2：取上述處理過的刺狀型鉑包覆金納米棒-二硫蘇糖醇的復合物的溶液300μl加入3μl的10μm的巰基修飾的dna2，混勻，25℃、振搖反應8h，6000rpm離心5min，去上清，用300μl的5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液分散刺狀型鉑包覆金納米棒-二硫蘇糖醇-dna2的復合物，并且采用5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液清洗一次，4℃保藏、備用；③刺狀型鉑包覆金納米棒側面定向修飾dna3：取上述處理過的刺狀型鉑包覆金納米棒-二硫蘇糖醇的復合物的溶液300μl加入3μl的10μm的巰基修飾的dna3，混勻，25℃、振搖反應8h，6000rpm離心5min，去上清，用300μl的5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液對刺狀型鉑包覆金納米棒-二硫蘇糖醇-dna3的復合物進行分散，并且采用5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液清洗一次，4℃保藏、備用；（4）核酸功能化的刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體的制備取50μl上述制備的dna2和dna3側面定向修飾的鉑包裹的刺狀金納米棒進行混合、漩渦混勻，加入0.5μl的10μmdna1、漩渦混勻，室溫孵育8h后，借助核酸特異性雜交反應，使得dna2和dna3分別修飾的刺狀鉑包裹的金納米棒形成側面組裝二聚體；表一dna損傷檢測所用的堿基序列編號序列(5’-3’)長度dna1accggaggcccatcctcacc20dna2sh-ggcctccggt10dna3ggtgaggatg-sh10（5）生物毒素對dna的預損傷10μm的dna1和10、5、1、0.1、0.01μmol/l的黃曲霉毒素b1進行混合，室溫反應2.5h，將預損傷的dna1放置在4℃冰箱，備用；同時，對于黃曲霉毒素b1的代謝產物黃曲霉毒素m1及黃曲霉毒素m2按照黃曲霉毒素b1的步驟及相同的濃度，和dna1進行孵育2.5h，將預損傷后的dna1放置在4℃冰箱，備用；（6）刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體對dna損傷的檢測采用圓二色光譜學信號對黃曲霉毒素b1及其代謝產物黃曲霉毒素m1和黃曲霉毒素m2進行檢測，繪制摩爾橢圓度～黃曲霉毒素b1、m1及m2的濃度標準曲線：取50μl上述制備的dna2和dna3側面定向修飾的鉑包裹的刺狀金納米棒進行混合、漩渦混勻，加入經過步驟5處理過的預損傷的dna1（0.5μl），漩渦混勻，室溫孵育8h后，借助核酸特異性雜交反應，使得dna2及dna3分別修飾的鉑包裹的刺狀金納米棒形成側面組裝結構；由于加入的黃曲霉毒素b1或者其代謝產物m1及m2的濃度的不同，黃曲霉毒素和相應的dna1中的鳥嘌呤形成黃曲霉毒素-鳥嘌呤的加合物，進而使得dna2及dna3無法與dna1進行特異性的核酸識別雜交，導致刺狀鉑包裹的金納米棒形成的二聚體的產率不同進而引起等離子圓二色光譜學信號產生差異，利用圓二色光譜儀測定不同黃曲霉毒素濃度下的組裝產物的摩爾橢圓度，根據855nm波長下測定的不同黃曲霉毒素濃度的摩爾橢圓度，繪制黃曲霉毒素濃度的標準曲線。本發(fā)明的有益效果：我們通過研究發(fā)現，該等離子手性無機納米組裝體在可見光/近紅外區(qū)域的信號的強度和信號的光譜學位置與納米級組裝基元的元素、尺寸、構型和其相應的產率息息相關，充分說明了等離子手性光譜學信號可成功應用于生物傳感檢測領域。利用核酸進行組裝形成刺狀鉑包裹的金納米棒二聚體產生可見光/近紅外區(qū)域的圓二色光譜信號進而用于生物毒素及其代謝物對dna損傷的檢測尚屬空白。附圖說明圖1合成的金納米棒的電鏡照片。圖2合成的金納米棒的紫外/可見光譜圖。圖3刺狀鉑包裹的金納米棒二聚體的電鏡照片。圖4刺狀鉑包裹的金納米棒二聚體的圓二色光譜圖。圖5黃曲霉毒素b1的等離子圓二色光譜檢測方法的標準曲線。具體實施方式實施例1制備刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體用于dna的損傷檢測（1）金納米棒的合成按照專利《一種具有表面增強拉曼活性的自組裝材料的制備方法》（專利號：zl201010605799.9）的方法合成長徑比約為3.0的金納米棒。簡單的步驟如下：①晶種合成：28.0℃下取0.1ml的預先配置的2g/l的三水合四氯金酸加入到1ml的0.2m的十六烷基三甲基溴化銨溶液中，此時，溶液顏色由無色變成黃褐色。然后向上述混合體系中加入0.12ml的新配制的0.01m硼氫化鈉溶液快速攪拌2min。溶液顏色即由黃褐色變?yōu)闇\棕色。將上述合成的晶種放入28.0℃的水浴鍋中靜置反應30min，使未完全參與晶種合成的硼氫化鈉消耗殆盡，（一是硼氫化鈉進一步還原體系中未完全反應的金離子而被消耗，二是在靜置反應過程中硼氫化鈉由于水解導致其含量進一步降低），制備的晶種要在合成后4h內進行下一步反應。②金納米棒生長過程：晶種合成完成以后，進行金納米棒的生長。5ml的2g/l的三水合四氯金酸加入到5ml0.2m的十六烷基三甲基溴化銨中后加入4ml的超純水，混勻。0.125ml的0.01m硝酸銀溶液加入到上述混合體系中，混勻，隨后將65μl的0.1m抗壞血酸溶液加入上述體系溶液，28.0℃下劇烈攪拌反應2min，溶液由褐色變成無色。最后，加入0.05ml的晶種溶液輕柔攪拌混勻20s。28.0℃反應2h后溶液的顏色為土褐色。合成的金納米棒溶液經過10000rpm離心10min，棄上清，采用0.005m的十六烷基三甲基溴化銨溶液將沉淀進行重分散，清洗一次，最終將金納米棒溶液分散在與初始等體積的溶液中，室溫靜置保存，以便進行下一步的表征及實驗需求。（2）刺狀型鉑包覆金納米棒的合成方法向5ml的金納米棒溶液中，加入50μm的碘化鈉，后加入10ml的0.05m的十六烷基三甲基溴化銨后，混勻，隨后加入500μl的0.2mm的硝酸銀溶液，混勻，再加入500μl的0.1m的抗壞血酸溶液，混勻，70℃孵育1h后，加入480μl的0.1m的鹽酸和440μl2mm的氯鉑酸，在70℃孵育反應4h后，6500rpm離心10min，棄上清，采用5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液分散，待用。（3）刺狀型鉑包覆金納米棒表面定向核酸功能化①刺狀型鉑包覆金納米棒對其進行端面封閉：取上述制備好的10nm的刺狀型鉑包覆金納米棒2ml，加入30μl的1mm的二硫蘇糖醇溶液，混勻，振搖反應4小時，采用6000rpm離心5min，棄上清，用2ml的5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液分散金納米棒-二硫蘇糖醇的復合物，4℃保藏、備用。②刺狀型鉑包覆金納米棒側面定向修飾dna2：取上述處理過的刺狀型鉑包覆金納米棒-二硫蘇糖醇的復合物的溶液300μl加入3μl的10μm的巰基修飾的dna2，混勻，25℃、振搖反應8h，6000rpm離心5min，去上清，用300μl的5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液分散刺狀型鉑包覆金納米棒-二硫蘇糖醇-dna2的復合物，并且采用5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液清洗一次，4℃保藏、備用。③刺狀型鉑包覆金納米棒側面定向修飾dna3：取上述處理過的刺狀型鉑包覆金納米棒和二硫蘇糖醇的復合物的溶液300μl加入3μl的10μm的巰基修飾的dna3，混勻，25℃。振搖反應8h，6000rpm離心5min，去上清，用300μl的5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液對刺狀型鉑包覆金納米棒-二硫蘇糖醇-dna3的復合物進行分散，并且采用5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液清洗一次，4℃保藏、備用。（4）核酸功能化的刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體的制備取50μl上述制備的dna2和dna3側面定向修飾的鉑包裹的刺狀金納米棒進行混合、漩渦混勻，加入0.5μl的10μmdna1、漩渦混勻，室溫孵育8h后，借助核酸特異性雜交反應，使得dna2和dna3分別修飾的刺狀鉑包裹的金納米棒形成側面組裝二聚體。表一dna損傷檢測所用的堿基序列編號序列(5’-3’)長度dna1accggaggcccatcctcacc20dna2sh-ggcctccggt10dna3ggtgaggatg-sh10（5）生物毒素對dna的預損傷10μm的dna1和10、5、1、0.1、0.01μmol/l的黃曲霉毒素b1進行混合，室溫反應2.5h，將預損傷的dna放置在4℃冰箱，備用。同時，對于黃曲霉毒素b1的代謝產物黃曲霉毒素m1及黃曲霉毒素m2按照黃曲霉毒素b1的步驟及相同的濃度，和dna1進行孵育2.5h，將預損傷后的dna放置在4℃冰箱，備用。（6）鉑包裹的刺狀金納米棒手性二聚體對dna損傷的檢測；采用圓二色光譜學信號對黃曲霉毒素b1及其代謝產物黃曲霉毒素m1及黃曲霉毒素m2進行檢測，繪制摩爾橢圓度～黃曲霉毒素b1、m1及m2的濃度標準曲線：取50μl上述制備的dna2及dna3側面定向修飾的鉑包裹的刺狀金納米棒進行混合、漩渦混勻，加入經過步驟5處理過的預損傷的dna1（0.5μl）、漩渦混勻，室溫孵育8h后，借助核酸特異性雜交反應，使得dna2及dna3分別修飾的鉑包裹的刺狀金納米棒形成側面組裝結構。由于加入的黃曲霉毒素b1或者其代謝產物m1及m2的濃度的不同，黃曲霉毒素和相應的dna1中的鳥嘌呤形成黃曲霉毒素-鳥嘌呤的加合物，進而使得dna2及dna3無法與dna1進行特異性的核酸識別雜交，導致鉑包裹的刺狀金納米棒形成的二聚體的產率不同進而引起等離子圓二色光譜學信號產生差異。利用圓二色光譜儀測定不同黃曲霉毒素濃度下的組裝產物的摩爾橢圓度，根據855nm波長下測定的不同黃曲霉毒素濃度的摩爾橢圓度，繪制黃曲霉毒素濃度的標準曲線。當前第1頁12