本發(fā)明涉及環(huán)境保護(hù)，具體涉及一種以效應(yīng)為導(dǎo)向的水體中激素及其疑似內(nèi)分泌干擾物的檢測方法。

背景技術(shù)：

1、內(nèi)分泌干擾物是一種外源性物質(zhì)，干擾生物體內(nèi)維持自穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)生殖發(fā)育和其他行為的荷爾蒙的合成、分泌、輸送、結(jié)合、作用和排泄。內(nèi)分泌干擾物主要關(guān)注雌激素類(抗雌激素)、雄激素類(抗雄激素)、孕激素類、糖皮質(zhì)激素類、烷基酚類和甲狀腺干擾物等。雌激素類、雄激素類、孕激素類和糖皮質(zhì)激素類污染物作為常見的類固醇激素，會(huì)不可避免的在生產(chǎn)和使用過程中被排放至環(huán)境，其對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)及人類健康造成的威脅已經(jīng)受到了關(guān)注。

2、由于水環(huán)境中痕量存在的激素類物質(zhì)對(duì)生物易造成內(nèi)分泌干擾現(xiàn)象，因此，需要建立水環(huán)境中激素的分析方法，進(jìn)一步對(duì)水環(huán)境中的激素的濃度進(jìn)行控制，進(jìn)而減少對(duì)生物體的內(nèi)分泌的干擾。中國專利cn109856266a中公開了同時(shí)測定環(huán)境水樣中多種痕量鹽/糖皮質(zhì)激素的分析方法，具體的步驟包括，(1)環(huán)境水樣的預(yù)處理：將水樣過濾后再經(jīng)固相萃取柱進(jìn)行萃取處理；(2)使用高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)對(duì)步驟(1)中處理后的樣品進(jìn)行檢測；(3)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以外標(biāo)法進(jìn)行定量測定，通過換算得到環(huán)境水樣中鹽/糖皮質(zhì)激素的含量。采用該專利中的方法能夠檢測到21種糖皮質(zhì)激素和3種鹽皮質(zhì)激素，檢測到的激素較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種以效應(yīng)為導(dǎo)向的水體中激素及其疑似內(nèi)分泌干擾物的檢測方法，結(jié)果準(zhǔn)確，可一次性檢出69種激素，包括雄激素、雌激素、糖皮質(zhì)激素及孕激素，且樣品處理簡單，適用于大批量樣品。

2、為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供了一種水體中激素的檢測方法，包括以下步驟：

3、s1、供試品溶液和激素對(duì)照品溶液的制備；

4、s2、采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法對(duì)供試品溶液和激素對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測，采用外標(biāo)法測定供試品溶液中激素的含量；色譜條件包括，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以含氟化銨的水溶液為流動(dòng)相a，以乙腈為流動(dòng)相b，按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫：

5、 時(shí)間/min 流動(dòng)相a/％ 流動(dòng)相b/％ 0-2 70 30 2-8 70→2 30→98 8-10 2 98 10-10.1 2→70 98→30 10.1-12.1 70 30

6、。

7、進(jìn)一步地，s1步驟中，所述供試品溶液的制備方法包括對(duì)待測水樣進(jìn)行過濾、富集的步驟；優(yōu)選的，所述富集的步驟中包括采用填料為親水-親油平衡樹脂的柱子對(duì)待測水樣中的成分進(jìn)行固定、采用洗脫劑洗脫、濃縮和復(fù)溶；更優(yōu)選的，所述洗脫劑為體積比為40-60:40-60的乙酸乙酯和甲醇的混合物；更優(yōu)選的，所述復(fù)溶的溶劑為體積百分濃度為10-50％的甲醇水溶液或乙腈水溶液。

8、進(jìn)一步地，激素對(duì)照品溶液的溶劑選自甲醇、乙腈、水中的一種或多種；和/或，所述激素對(duì)照品溶液的濃度為0.1-80μg/l；和/或，色譜柱的規(guī)格為2.1×100mm，2.2μm；和/或，柱溫為35-40℃；和/或，流速為0.1-0.3ml/min；和/或，進(jìn)樣體積為8-11μl；和/或，所述含氟化銨的水溶液的濃度為0.01-0.1mm。

9、進(jìn)一步地，所述質(zhì)譜的電離模式選自正離子和/或負(fù)離子；和/或，噴霧電壓為2.0-3.5kv，離子傳輸管的溫度為200-350℃，噴霧錐的溫度為200-350℃，鞘氣的流量為10-50arb，輔助氣的流量為10-20arb，反吹氣的流量為0-10arb。

10、進(jìn)一步地，所述激素對(duì)照品選自糖皮質(zhì)激素、雄激素、孕激素、雌激素中的一種或多種；優(yōu)選的，所述糖皮質(zhì)激素選自潑尼松、可的松、潑尼松龍、氫化可的松、甲基潑尼松龍、氟米龍、倍他米松、地塞米松、醋酸潑尼松、醋酸可的松、潑尼松龍醋酸酯、醋酸氫化可的松、倍氯米松、氟米松、甲基潑尼松龍醋酸酯、氟米龍醋酸酯、醋酸氟氫可的松、布地奈德、丁酸氫化可的松、曲安奈德、醋酸倍他米松、地塞米松醋酸酯、氟氫縮松、地夫可特、戊酸氫化可的松、哈西奈德、丙酸氯倍他索、醋酸曲安奈德、倍他米松戊酸酯、曲安西龍雙醋酸酯、丁酸氯倍他松、潑尼卡酯、醋酸氟輕松、醋酸雙氟拉松、氟替卡松丙酸酯、安西奈德、倍他米松二丙酸酯、阿氯米松雙丙酸酯、丙酸倍氯米松、糠酸莫米松中的一種或多種；優(yōu)選的，所述雄激素選自群勃龍、諾龍、勃地酮、雄烯二酮、睪酮、美雄酮、甲睪酮、康力龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍中的一種或多種；優(yōu)選的，所述孕激素選自炔諾酮、左炔諾孕酮、黃體酮、甲地孕酮、甲羥孕酮、炔諾肟酯、醋羥孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羥孕酮、醋酸氯地孕酮中的一種或多種；優(yōu)選的，所述雌激素選自己二烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚、雌酚酮、17-β-雌二醇、17-α-雌二醇、雌三醇、17α-乙炔雌二醇、苯甲酸雌二醇中的一種或多種。

11、所述外標(biāo)法為標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

12、進(jìn)一步地，在進(jìn)行s2步驟前還包括對(duì)供試品溶液進(jìn)行內(nèi)分泌干擾效應(yīng)檢測的步驟；優(yōu)選的，所述內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的檢測方法選自雌激素受體結(jié)合試驗(yàn)、雄激素受體結(jié)合試驗(yàn)、孕激素受體結(jié)合試驗(yàn)、糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合試驗(yàn)中的一種或多種；更優(yōu)選的，所述雌激素受體結(jié)合試驗(yàn)的方法為化學(xué)激活熒光素酶基因表達(dá)法。

13、進(jìn)一步地，所述雌激素受體結(jié)合試驗(yàn)中包括：

14、(1)檢測陽性對(duì)照品溶液處理的mvln細(xì)胞的熒光強(qiáng)度；

15、(2)檢測供試品溶液處理的mvln細(xì)胞的熒光強(qiáng)度并計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度；

16、(3)判斷供試品溶液是否具有雌激素受體結(jié)合效應(yīng)；

17、優(yōu)選的，還滿足以下a-e中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：

18、a、所述陽性對(duì)照品溶液的濃度為4800-5200pm；

19、b、所述陽性對(duì)照品溶液中的溶劑為饑餓培養(yǎng)基；

20、c、所述陽性對(duì)照品為17-β-雌二醇；

21、d、當(dāng)供試品溶液的相對(duì)熒光強(qiáng)度＞50％時(shí)，則供試品溶液具有雌激素受體結(jié)合效應(yīng)；

22、e、所述供試品溶液檢測前還包括采用二甲基亞砜進(jìn)行溶劑置換的步驟；更優(yōu)選的，供試品溶液與二甲基亞砜的體積比為1.5:0.18-0.22。

23、mvln細(xì)胞：通過將熒光素酶基因(luc)連接在雌激素受體(er)后，構(gòu)建質(zhì)粒，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)入人乳腺癌細(xì)胞mcf-7，獲得mvln細(xì)胞株。

24、雌激素受體結(jié)合試驗(yàn)原理：將mvln細(xì)胞暴露于外源具有雌激素效應(yīng)的物質(zhì)，該物質(zhì)與er結(jié)合后，可觸發(fā)下游熒光素酶的表達(dá)。熒光素酶催化底物熒光素(luciferin)生成氧化性熒光素(oxyluciferin)，同時(shí)發(fā)出生物熒光。通過酶標(biāo)儀測定熒光素氧化過程中生物熒光的變化，評(píng)價(jià)er的結(jié)合情況，從而評(píng)價(jià)物質(zhì)是否具有雌激素受體結(jié)合效應(yīng)。

25、進(jìn)一步地，供試品溶液的熒光強(qiáng)度與陽性對(duì)照品溶液的熒光強(qiáng)度的比值為相對(duì)熒光強(qiáng)度；優(yōu)選的，將供試品溶液或陽性對(duì)照品溶液的熒光強(qiáng)度采用溶劑對(duì)照品溶液的熒光強(qiáng)度進(jìn)行校正；更優(yōu)選的，所述溶劑對(duì)照品溶液包括二甲基亞砜的體積百分含量為0.09-0.11％的二甲基亞砜-饑餓培養(yǎng)基溶液。

26、進(jìn)一步地，在進(jìn)行雌激素受體結(jié)合試驗(yàn)前還包括對(duì)供試品溶液進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測，收集細(xì)胞存活率＞75％的供試品溶液進(jìn)行雌激素受體結(jié)合試驗(yàn)。

27、進(jìn)一步地，所述檢測的方法還包括采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法對(duì)供試品溶液進(jìn)行疑似內(nèi)分泌干擾物的檢測；優(yōu)選的，還滿足以下a-d中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：

28、a、以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲酸水溶液或水為流動(dòng)相a，以甲醇為流動(dòng)相b，按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫：

29、 時(shí)間/min 流動(dòng)相a/％ 流動(dòng)相b/％ 0-2 95％ 5％ 2-4.5 95％→5％ 5％→95％ 4.5-5.5 5％ 95％ 5.5-9.5 5％→95％ 95％→5％ 9.5-13 95％ 5％

30、；

31、更優(yōu)選的，所述甲酸水溶液的體積百分濃度為0.1-0.3％；

32、b、所述疑似內(nèi)分泌干擾物選自2-羥基-4-正辛氧基二苯甲酮、吡喹酮、去氫表雄酮、17-硫酸睪酮、2-萘磺酸、三正丁基氧化膦、硫酸單十二烷基酯、4-十二烷基苯磺酸、八乙二醇、皮諾斂酸、亞氨基(甲基)苯基-4-磺酸2,4,6-三甲基苯磺酸、10-(4-磺苯基)癸酸中的一種或多種；

33、c、噴霧電壓為2-3.5kv，離子傳輸管溫度為200-350℃，噴霧錐溫度為200-350℃，鞘氣的流速為10-50arb，輔助氣的流速為10-20arb，反吹氣的流速為0-10arb；

34、d、流速為0.3ml/min，柱溫為35-40℃。

35、本發(fā)明還提供一種上述水體中激素的檢測方法在環(huán)境水體檢測中的應(yīng)用。

36、本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下有益效果：

37、(1)本發(fā)明提供的一種水體中激素的檢測方法，包括以下步驟：s1、供試品溶液和激素對(duì)照品溶液的制備；s2、采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法對(duì)供試品溶液和激素對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測，采用外標(biāo)法測定供試品溶液中激素的含量；色譜條件包括，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以含氟化銨的水溶液為流動(dòng)相a，以乙腈為流動(dòng)相b進(jìn)行梯度洗脫。在本發(fā)明的檢測方法下，可一次性檢出69種激素，包括雄激素、雌激素、糖皮質(zhì)激素及孕激素，且響應(yīng)高，結(jié)果準(zhǔn)確。

38、(2)本發(fā)明提供的一種水體中激素的檢測方法，通過在s2步驟前增加對(duì)供試品溶液進(jìn)行內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的檢測的步驟，可在大量水樣中選擇具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的水樣進(jìn)行激素的定性定量分析，減少了水樣的檢測量，進(jìn)而縮短了檢測時(shí)間，為內(nèi)分泌干擾物的監(jiān)管提供了方法和依據(jù)。

39、(3)本發(fā)明提供的一種水體中激素的檢測方法，通過采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法對(duì)供試品溶液進(jìn)行疑似內(nèi)分泌干擾物的檢測，得到12種疑似內(nèi)分泌干擾物，進(jìn)一步為水污染治理提供了新的目標(biāo)化合物。