本發(fā)明涉及一種磁性納米顆粒免疫層析快速檢測東方馬腦炎病毒抗體的檢測試劑盒及其制備方法，屬于生物檢測。

背景技術(shù)：

1、東方馬腦炎(eastern?equine?encephalitis，eee)是一種典型的人獸共患病毒性疾病，該病毒屬a組蟲媒病毒披膜病毒科甲病毒屬，含單股rna,因首先于病馬腦組織中分離出病毒，故而得名。隨后從病人腦組織中也分離出同樣病毒，其引起的人類腦炎癥狀十分危急而兇險(xiǎn)，其臨床表現(xiàn)與乙型腦炎很相似，病死率約在35%以上。該病的典型表現(xiàn)為迅速發(fā)生的流感樣癥狀，如頭痛和發(fā)熱，甚至有抽搐、意識(shí)障礙和腦膜刺激癥狀等。如果不加以治療，伴中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，預(yù)后不良，可能會(huì)導(dǎo)致35%的病例死亡。?東方馬腦炎的預(yù)后與病變的范圍和病情的輕重有關(guān)。腦部病變較局限且未侵犯"生命中樞"，病情較輕時(shí)，其預(yù)后往往良好。如昏迷持續(xù)時(shí)間較長，或有頻繁驚厥時(shí)，腦部缺氧及病理變化加重，預(yù)后多較差，容易留有神經(jīng)、精神的后遺癥。

2、東方馬腦炎病毒（eeev）經(jīng)感染的蚊子的叮咬而由馬傳播給人；潛伏期大約在5月15日之間。主要的傳播鏈?zhǔn)窃邙B和蚊子之間。在夏之交到秋末冬初福建省腦病變類患者具有一定數(shù)量，病因不明，實(shí)驗(yàn)診斷尚無法普及開展，給臨床上，尤其是神經(jīng)內(nèi)科造成很大困難，誤診誤治也較多見。如何開發(fā)快速、有效的東方馬腦炎病毒抗體檢測試劑迫在眉睫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、（一）要解決的技術(shù)問題

2、為了解決現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，本發(fā)明提供一種磁性納米顆粒免疫層析快速檢測東方馬腦炎病毒抗體的試劑盒及其制備方法。

3、（二）技術(shù)方案

4、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的主要技術(shù)方案包括：

5、一種磁性納米顆粒免疫層析快速檢測東方馬腦炎病毒抗體的試劑盒，其包括由樣品墊、玻璃纖維墊、硝酸纖維素檢測膜及吸水墊依次搭接并貼在底襯卡構(gòu)成的免疫層析試紙和磁性納米顆粒捕獲試劑，其中，所述硝酸纖維素檢測膜上包被有兔抗e1蛋白多克隆抗體的質(zhì)控線和東方馬腦炎病毒e1蛋白的檢測線，所述磁性納米顆粒捕獲試劑為東方馬腦炎病毒e1蛋白標(biāo)記的四氧化三鐵磁性納米磁顆粒。

6、如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述東方馬腦炎病毒e1蛋白的氨基酸序列如seq?idno.1所示。

7、如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述東方馬腦炎病毒e1蛋白的表達(dá)采用如seq?idno.2所示基因序列進(jìn)行。

8、如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述樣品墊為含吐溫-80的處理液進(jìn)行浸泡處理后的玻璃纖維膜。

9、如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述玻璃纖維墊為經(jīng)含有重量百分比為0.1%的tris堿、1.5%的bsa和2%的triton?x-100的溶液浸泡過的玻璃纖維膜。

10、對(duì)免疫層析試紙中玻璃纖維墊不進(jìn)行處理時(shí)，加入待測樣品的稀釋液時(shí)，會(huì)有少數(shù)試紙條出現(xiàn)假陽性，經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，當(dāng)將玻璃纖維墊采用0.1%的tris堿、1.5%的bsa和2%的triton?x-100的溶液浸泡后，有效避免了假陽性的發(fā)生。

11、一種磁性納米顆粒免疫層析快速檢測東方馬腦炎病毒抗體的試劑的制備方法，所述其包括如下步驟：

12、s1、將四氧化三鐵磁性納米磁顆粒羧基化后，加入東方馬腦炎病毒e1蛋白進(jìn)行標(biāo)記，獲得東方馬腦炎病毒e1蛋白標(biāo)記的四氧化三鐵磁性納米磁顆粒捕獲試劑；

13、s2、將玻璃纖維膜經(jīng)重懸液浸泡后，干燥獲得玻璃纖維墊；

14、s3、硝酸纖維素膜上設(shè)有質(zhì)控線和檢測線，質(zhì)控線上包被有兔抗e1蛋白多克隆抗體，檢測線上包被有東方馬腦炎病毒e1蛋白，獲得硝酸纖維素檢測膜；

15、s4、將玻璃纖維膜浸入含吐溫-80的處理液中浸泡處理后，取出烘干，獲得樣品墊；

16、s5、將樣品墊、玻璃纖維墊、硝酸纖維素檢測膜、吸水墊依次搭接并貼在底襯卡組成，按硝酸纖維素檢測膜上靠近質(zhì)控線的一端覆蓋上吸水墊，靠近檢測線的另一端覆蓋玻璃纖維墊進(jìn)行貼條。

17、如上所述的制備方法，優(yōu)選地，在步驟s1中，所述四氧化三鐵磁性納米磁顆粒的粒徑大小為20nm，羧基化采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的戊二醛溶液。

18、如上所述的制備方法，優(yōu)選地，在步驟s1中，所述東方馬腦炎病毒e1蛋白標(biāo)記的濃度為1.8mg/ml，標(biāo)記時(shí)反應(yīng)時(shí)間為2.5h，磁吸附后棄去溶液，再加入0.75%的bsa溶液，搖晃封閉30分鐘；磁吸附后棄去溶液，加入含0.05%的吐溫-20濃度為0.01mol/l的pbs，洗滌；再加入重懸液，獲得e1蛋白標(biāo)記的四氧化三鐵磁性納米顆粒捕獲試劑溶液，其中，重懸液中含有重量百分比為0.1%的tris堿、1.5%的bsa和2%的triton?x-100的溶液。

19、經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)證明，如果不采用含有0.75%的bsa溶液進(jìn)行封閉，會(huì)有非特異性條帶，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

20、如上所述的制備方法，優(yōu)選地，所述東方馬腦炎病毒e1蛋白的獲得采用基因序列如seq?id?no.2進(jìn)行表達(dá)制備。

21、如上所述的制備方法，優(yōu)選地，在步驟s2中，所述重懸液為含有重量百分比為0.1%的tris堿、1.5%的bsa和2%的triton?x-100的溶液。

22、如上所述的制備方法，優(yōu)選地，在步驟s3中，所述兔抗e1蛋白多克隆抗體的包被濃度為2.2mg/ml和東方馬腦炎病毒e1蛋白的包被濃度為1.8mg/ml。

23、本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證獲得濕法免疫層析快速檢測東方馬腦炎病毒抗體的試劑。采用了磁性納米顆粒捕獲試劑為東方馬腦炎病毒e1蛋白標(biāo)記的四氧化三鐵磁性納米磁顆粒，通過磁鐵的吸附作用起到富集的作用，將待檢測血清加入磁性納米顆粒捕獲試劑中，如果待測血清中有被感染東方馬腦炎病毒產(chǎn)生的抗體時(shí)，抗體會(huì)與東方馬腦炎病毒e1蛋白結(jié)合，而東方馬腦炎病毒e1蛋白包被在四氧化三鐵磁性納米磁顆粒上，通過磁力架的磁力吸附的作用，會(huì)將抗體-東方馬腦炎病毒e1蛋白-四氧化三鐵磁性納米磁顆粒的復(fù)合物吸附，此時(shí)棄去血清，達(dá)到富集抗體的目的。再將復(fù)合物重溶到100μl緩沖液，加入上述制備的免疫層析試紙的加樣孔中，通過磁鐵吸附富集有效提高了檢測靈敏度。本發(fā)明還對(duì)樣品墊進(jìn)行了處理，通過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過含有3%的吐溫-80的0.05mol/l?pbs處理過的樣品墊，可有效避免假陰性的發(fā)生。因采用未處理的樣品墊進(jìn)行血清的檢測時(shí)，會(huì)出現(xiàn)與條帶上抗原結(jié)合不完全的現(xiàn)象，導(dǎo)致假陰性的發(fā)生。

24、本發(fā)明經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，磁性納米顆粒捕獲試劑采用重量百分比為0.1%的tris堿、1.5%的bsa和2%的triton?x-100的重懸液時(shí)，采用該比例重懸液獲得最優(yōu)磁性顆粒分散度，并能有效避免非特異性條帶出現(xiàn)，避免假陽性。

25、（三）有益效果

26、本發(fā)明的有益效果是：

27、本發(fā)明提供了一種東方馬腦炎病毒e1蛋白，該蛋白可用做為抗原，用于檢測東方馬腦炎病毒抗體免疫試劑的制備。采用該東方馬腦炎病毒e1蛋白制備的磁性納米顆粒免疫層析快速檢測東方馬腦炎病毒抗體的試劑，其檢測靈敏度和特異性較強(qiáng)，可有效用于感染東方馬腦炎病毒的后產(chǎn)生陽性抗體的檢測。

28、本發(fā)明提供的磁性納米顆粒免疫層析快速檢測東方馬腦炎病毒抗體的試劑盒，采用制備的東方馬腦炎病毒e1蛋白抗原進(jìn)行制備，該免疫層析試劑用于檢測東方馬腦炎病毒抗體。

29、本發(fā)明提供的檢測東方馬腦炎病毒抗體的磁性納米顆粒免疫層析試劑，可通過磁性吸附富集作用捕獲體系內(nèi)更多的被檢物，通過富集作用提高檢測靈敏度。試劑成本低，檢測試劑溶液穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、靈敏度高、比膠體金檢測結(jié)果靈敏度高10倍，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，操作簡單，不需要較強(qiáng)的專業(yè)技術(shù)就可以操作，通過肉眼觀察來判斷檢測結(jié)果，并不需要儀器也可進(jìn)行判斷，使用方便。