本發(fā)明屬于檢測，尤其涉及測定炎癥模型中花生四烯酸代謝通路cox-2代謝產(chǎn)物含量的方法。

背景技術(shù)：

1、花生四烯酸(arachidonic?acid，aa)是一種ω-6多不飽和脂肪酸，為體內(nèi)分布最廣泛的內(nèi)源性活性物質(zhì)，在維持機(jī)體細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能等方面具有重要的作用。aa不僅是機(jī)體各組織和器官中必不可少的磷脂，同時(shí)還是人體前列腺素(pg)合成的重要前體物質(zhì)，在aa代謝網(wǎng)絡(luò)中，aa分別通過環(huán)氧合酶(cyclooxygenases，coxs)、脂氧合酶(lipoxygenase，loxs)和細(xì)胞色素p450(cytochromep450，cyp450)酶三種代謝途徑分別產(chǎn)生了前列腺素類(prostaglandins，pgs)、血栓素類(thromboxanes，txs)、白三烯類(leucotrienes，lts)或羥基脂肪酸等一系列代謝產(chǎn)物，引發(fā)不同的炎癥反應(yīng)。前列腺素類包括前列腺素f2β(pgf2β)、前列腺素e2(pge2)、前列腺素e1(pge1)、前列腺素d1(pgd1)、前列腺素d2(pgd2)、前列腺素a1(pga1)、前列腺素a2(pga2)、前列腺素j2(pgj2)、前列腺素b2(pgb2)等。血栓素類包括血栓素b1(txb1)、血栓素b2(txb2)等。這些aa代謝產(chǎn)物統(tǒng)稱為花生酸類，是有效的自分泌和旁分泌生物活性介質(zhì)，是體內(nèi)重要的炎癥因子，參與機(jī)體免疫及炎癥反應(yīng)過程，并在許多疾病的病理生理過程中起著重要的作用。炎癥是關(guān)節(jié)炎的重要病理基礎(chǔ)，是與關(guān)節(jié)炎發(fā)生緊密相關(guān)的一個(gè)過程。以pge2為例，pge2在前列腺素樣物質(zhì)中促進(jìn)骨吸收的作用最強(qiáng)，關(guān)節(jié)炎組織中存在pge2受體，與pge2結(jié)合發(fā)揮作用，具有pge2受體動物的關(guān)節(jié)組織病理學(xué)揭示了軟骨退化，蛋白聚糖丟失，導(dǎo)致ⅱ型膠原的破壞，因此，其在關(guān)節(jié)炎的病理機(jī)制中起重要作用。

2、基于cox代謝途徑，其有cox-1和cox-2兩種亞型，cox-1用于基本前列腺素合成，屬于組成酶；cox-2在許多炎癥中有重要作用，受到激發(fā)而產(chǎn)生，屬于誘導(dǎo)酶?；ㄉ南┧?arachidonic?acid，aa)代謝通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。然而，在炎癥模型中的aa的整體代謝輪廓仍然難以捉摸。

3、目前，aa代謝通路中炎性因子的含量的檢測仍采用酶聯(lián)免疫吸附法、流式細(xì)胞術(shù)、westernblot等技術(shù)進(jìn)行單一指標(biāo)檢測，存在不同批次樣本不穩(wěn)定性、檢測成本高以及對技術(shù)人員要求高等問題。pang等建立了對大鼠脊髓挫傷后4h、24h和48h的脊髓組織進(jìn)定量分析pge2和ltb4(參考文獻(xiàn)：pang?y,liu?x,zhao?c,et?al.lc-ms/ms-based?arachidonicacid?metabolomics?in?acute?spinal?cord?injury?reveals?the?upregulation?of?5-lox?and?cox-2?products.free?radic?biol?med.2022；193(pt1):363-372.)。lin等則建立了測定人血漿樣本中白三烯b4的含量的lc-ms方法(參考文獻(xiàn)：lin?w，huang?mq，xue?x，et?al.ahighly?sensitive?and?selective?method?for?the?determination?ofleukotriene?b4(ltb4)in?ex?vivo?stimulated?human?plasma?by?ultra?fast?liquidchromatography?tandem?mass?spectrometry[j].jchromatogr?b?analyt?technolbiomed?life?sci，2013，925：54.)。現(xiàn)有方法僅能檢測1-2個(gè)aa的代謝產(chǎn)物，但1-2個(gè)aa的代謝產(chǎn)物的檢測無法清楚了解炎癥模型中的aa的整體代謝情況。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明提供測定炎癥模型中花生四烯酸代謝通路cox-2代謝產(chǎn)物含量的方法。本發(fā)明提供的方法可以同時(shí)檢測aa代謝通路中11種代謝產(chǎn)物的含量，具有快速、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

2、本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明提供測定炎癥模型中花生四烯酸代謝通路cox-2代謝產(chǎn)物含量的方法，包括以下步驟：

4、(1)對樣本前處理：對細(xì)胞上清液樣本和/或血清樣本進(jìn)行前處理，前處理的過程中加入內(nèi)標(biāo)工作液，內(nèi)標(biāo)工作液為內(nèi)標(biāo)物pga2-d4的溶液；

5、(2)采用agilent?6495三重四極桿質(zhì)譜儀檢測處理后的樣本。

6、采取上述方案的有益效果包括：本發(fā)明提供的方法可以確定aa代謝產(chǎn)物及其結(jié)構(gòu)類似物等成分的定性和定量分析，拓展了lc-ms在檢測pge2等炎癥因子方面的應(yīng)用。本發(fā)明通過uhplc-qqq-ms/ms方法建立快速、靈敏度高、穩(wěn)定性好的11個(gè)代謝產(chǎn)物的檢測方法，實(shí)現(xiàn)了樣本數(shù)多、信息量多以及對單個(gè)樣本量需要量少。

7、進(jìn)一步，步驟(2)中，檢測條件包括：在waters?acquity?uplc?c18柱上進(jìn)行色譜分離；流動相為0.1％甲酸a和乙腈b，梯度洗脫：40％b為0-3分鐘，40％-80％b為3-8分鐘，40％b為8.01-10分鐘；注射等量5μl，flow速度為300μl/min；使用mrm和esi源在負(fù)離子模式下對代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測；干燥氣體流量為11.0l/min，干燥氣體溫度為300℃，霧化器15psig，毛細(xì)管電壓為4000v。

8、進(jìn)一步，步驟(1)中，細(xì)胞上清液樣本進(jìn)行前處理的方法包括以下步驟：取上清液200μl，加入內(nèi)標(biāo)工作液50μl，加入乙腈800μl，渦旋3min；4℃，14000rpm離心10min，取上清；真空濃縮；加入色譜甲醇100μl重新溶解，靜置后超聲，渦旋3min；4℃，14000rpm離心10min，取上清。

9、進(jìn)一步，細(xì)胞上清液為經(jīng)lps誘導(dǎo)的raw264.7細(xì)胞炎癥模型的上清液。

10、進(jìn)一步，步驟(1)中，血清樣本進(jìn)行前處理的方法包括以下步驟：取血清200μl，加入內(nèi)標(biāo)工作液50μl，再加入乙腈800μl，渦旋3min；4℃，14000rpm離心10min，取上清；真空濃縮；加入色譜甲醇100μl重新溶解，靜置后超聲，渦旋3min；4℃，14000rpm離心10min，取上清。

11、進(jìn)一步，血清樣本為佐劑型誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(aia)模型的血清樣本或ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(cia)模型的血清樣本。

12、采取上述方案的有益效果包括：本發(fā)明采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(lc-ms法)可以同時(shí)對細(xì)胞上清液和動物血清中的11種aa代謝產(chǎn)物進(jìn)行快速定量分析，具有快速、高效、靈敏度高、穩(wěn)定性好、信息量大、單個(gè)樣本需要量少等優(yōu)點(diǎn)。該方法是應(yīng)用于各類不同炎癥模型構(gòu)建中cox-2代謝產(chǎn)物含量測定的合適方法。

13、進(jìn)一步，步驟(2)中，根據(jù)檢測得到的峰面積以及標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算代謝產(chǎn)物的含量。

14、當(dāng)檢測細(xì)胞上清液樣本時(shí)，txb1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.196x-0.0572，pgf2β的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝1.98x-0.0400，txb2的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.928x-0.0335，pge2的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝21.2x-0.259，pge1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝49.1x-0.500，pgd1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝4.09x-0.0314，pgd2的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝4.03x-0.232，pga2的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝48.5x-0.00965，pgj2的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝34.8x-0.315，pgb2的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝10.5x-0.0443，pga1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝4.86x-0.0330；上述中，x為目標(biāo)物濃度，單位為ng/ml，y為目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比。

15、當(dāng)檢測血清樣本時(shí)，txb1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.298x+0.0378，pgf2β的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝12.5x+0.131，txb2的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝8.84x+0.259，pge2的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝110.4x+3.21，pge1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝243.8x+5.23，pgd1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝76.0x+1.68，pgd2的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝646.23x+0.457，pga2的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝6051.63x+0.565，pgj2的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝136.94x+14.5，pgb2的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝62.8x+1.50，pga1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝24.7x+0.574；上述中，x為目標(biāo)物濃度，單位為ng/ml，y為目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比。

16、進(jìn)一步，步驟(1)中，內(nèi)標(biāo)工作液中，pga2-d4的濃度為0.1μg/ml。

17、采取上述方案的有益效果包括：pga2-d4作為內(nèi)標(biāo)效益更好，在幾個(gè)被測組分色譜峰中間，且不共溢出，而其他的內(nèi)標(biāo)arachidonic?acid-d8在樣品復(fù)溶后未檢測成功。