專利名稱：一檢多項一步免疫檢測方法與半定量一步免疫檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，一步法免疫檢測方法以其快速、簡便和靈敏度高等特性，已在全世界范圍內(nèi)的檢測診斷中得到日益廣泛的應(yīng)用，有在許多方面取代以前的酶聯(lián)固相免疫吸附檢測(ELISA)的趨勢，并在不斷完善中。
現(xiàn)在的一步法免疫檢測方法都是一次檢測只能測試一種結(jié)果，這樣在實際應(yīng)用中不僅浪費試樣，效率也不能提高。常用來作定量檢測的ELISA方法操作繁瑣，使用起來不甚方便，其它方法也有此弊病。
普通一步法免疫檢測方法(以HCG一步法檢測試條為例說明)HCG一步法檢測試條主要由以下三部分構(gòu)成(如圖1)。1試條與標(biāo)本直接接觸部分(A)其中主要成分為金標(biāo)抗HCG第一抗體。2反應(yīng)膜部分(B)(是測試條用于檢測反應(yīng)結(jié)果的材料主體)其左右兩端分別包被了兩條線，右端A線為抗HCG第二抗體，左端B線作為對照，包被兔抗鼠IgG抗體。3吸水材料部分(C)。
HCG一步法檢測試條的整體反應(yīng)過程為將試條有顏色標(biāo)志線一端直接侵入被檢標(biāo)本容器中時，其反應(yīng)開始啟動。(1)若被檢樣品中沒有HCG，則無法形成雙抗體夾心反應(yīng)，反應(yīng)體系的金標(biāo)第一抗體與包被的兔抗鼠IgG抗體(陰性對照)反應(yīng)，作為對照標(biāo)記形成一條紅色沉積反應(yīng)線，這不僅表明被測標(biāo)本中無HCG，為陰性結(jié)果；且表明測試條整體反應(yīng)系統(tǒng)工作正常。如圖2(2)若被檢樣品中存在HCG，則與反應(yīng)體系的金標(biāo)記抗HCG發(fā)生反應(yīng)，形成HCG金標(biāo)抗體復(fù)合物，繼而此混合物繼續(xù)爬行，再與HCG第二抗體相遇結(jié)合，形成雙抗體夾心反應(yīng)，顯示有一條沉積反應(yīng)，從而表明為HCG陽性反應(yīng)。同時，過量的金標(biāo)抗體越過第二抗體包被線與兔抗鼠IgG抗體結(jié)合，形成第二條紅色沉積反應(yīng)線。如圖3。
現(xiàn)有技術(shù)一步法檢測系統(tǒng)在反應(yīng)膜上尚沒有明確的類似標(biāo)志線的標(biāo)志分開。(有些一步法檢測系統(tǒng)為使結(jié)果更明確，不得不將試條裝入有某些特殊裝置的塑料殼內(nèi)，如在反應(yīng)膜位置處設(shè)倆個窗口，以分開對照區(qū)及檢測區(qū))。
本發(fā)明一步法免疫檢測方法其目的是提供一種新型的一步法免疫檢測模式。通過一次檢測一個操作步驟可同時獲得幾種定性結(jié)果或一個寬量程的多個分段定量本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的首先對現(xiàn)有測試條的結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行改造，即在原測試條反應(yīng)體表面用以觀察結(jié)果的測試反應(yīng)區(qū)設(shè)置打印了兩條或兩條以上的標(biāo)志線(該標(biāo)志線用打印機(jī)打印在反應(yīng)膜上，該反應(yīng)膜是測試條用于檢測反應(yīng)結(jié)果的材料主體)，以此劃分了三個或三個以上的反應(yīng)區(qū)，用以區(qū)別預(yù)先包被在反應(yīng)膜上面而在測試反應(yīng)前所看不到的若干檢測、對照及半定量對照等用于不同目的的反應(yīng)區(qū)域。簡言之，印在反應(yīng)膜上的明晰標(biāo)志線把不同項的反應(yīng)區(qū)及反應(yīng)結(jié)果明確清晰地分開，使檢測結(jié)果的判定更加一目了然，如圖4及圖5所示。
原測試條的對照線和反應(yīng)線通常是包被在反應(yīng)膜上，要區(qū)分反應(yīng)線和對照線只能在檢測之后，這里用特別印跡把兩條以上明線(標(biāo)志線)預(yù)先印在膜上用以區(qū)別三個以上反應(yīng)區(qū)和對照區(qū)，這樣便可以把不同項目結(jié)果清楚地分開，這就使本發(fā)明特別適于一檢多項一步法及半定量一步法免疫檢測。
為改進(jìn)原一步法免疫檢測試條不能定量的局限，尤其是克服原試條由HOOK效應(yīng)產(chǎn)生的待檢樣品在極高濃度與低濃度不易區(qū)分的現(xiàn)象，我們特別設(shè)置了兩個對照區(qū)，即對照區(qū)與半定量對照區(qū)和相應(yīng)的對照線和半定量對照線，從而可以區(qū)分待檢物質(zhì)的濃度范圍。
原一步法免疫檢測試條只有一條對照線，它只是作為鑒定檢測是否操作正常以及試條反應(yīng)是否有效，而沒有定量意義。同時，由于一步法檢測中不能避免的HOOK效應(yīng)(即待檢物質(zhì)在高濃度時反應(yīng)而使檢測線顏色減弱的現(xiàn)象)，從而使待檢樣品在極高濃度時的表現(xiàn)與濃度很弱時的反應(yīng)結(jié)果相近，從而使某些結(jié)果在實際診斷中難以判定。半定量一步法免疫檢測試條設(shè)置的對照線采用抗膠體金單克隆抗體作為包被在反應(yīng)膜對照區(qū)的生物活性材料，因此在檢測中，無論是否有待檢物質(zhì)存在，無論待檢物質(zhì)含量的高低，該對照線的顯色強(qiáng)弱和顏色深淺均不發(fā)生改變，而半定量線采用抗鼠IgG Fab段單克隆抗體作為包被在半定量對照區(qū)的生物活性材料，因此在檢測中，半定量線的顯色會在待檢樣品濃度超過一定范圍時，隨待檢樣品濃度增加而減弱，所以對測試反應(yīng)結(jié)果的顯示只要將變化的檢測線和半定量線分別與不變的對照線來比較其顏色深淺并結(jié)合使用隨本產(chǎn)品提供的特別比色卡進(jìn)行對比便可知待檢物的濃度范圍。
用比較檢測線，半定量以及用對照線區(qū)別高濃度和低濃度的情況(1)在低濃度時，半定量線的顏色比對照線的顏色深，在這種情況下檢測線的顏色與待檢物質(zhì)濃度成正比，如圖6(A)。
(2)在高濃度時，半定量線顏色比對照線顏色淺或相同，在這種情況下檢測線的顏色與待檢物質(zhì)濃度成反比，如圖6(B)。
檢測線、半定量線以及對照線可用dispenser(噴頭)包被，采用通常使用的噴的方式。也可采用″plotter″或人工劃線方式包被，即將需包被的溶液裝在“噴頭”或″plotter″或人工劃線用的吸水筆中，采用噴或劃線包被在膜上。
以下結(jié)合


實施例一、一檢多項法免疫檢測檢測血清樣品中的HBsAg(乙型肝炎表面抗原)和HBeAg(乙型肝炎e抗原)，顯示符號如圖7。
反應(yīng)膜處理用扣印機(jī)預(yù)先扣印兩條標(biāo)志線，將反應(yīng)膜劃分為HBsAg檢測區(qū)，HBeAg檢測區(qū)和對照區(qū)。選用分別抗HBsAg和HBeAg的單克隆抗體分別包被HBsAg檢測線，HBeAg檢測線，用抗鼠IgG單克隆抗體包被對照線。包被好的膜即用BSA-PBS溶液封閉風(fēng)干，此膜即用做試條中的反應(yīng)膜。選用抗HBsAg和HBeAg的單抗分別與膠體金交聯(lián)，分別按照普通一步法試條組裝法組裝成條，靈敏性試驗及特異性試驗分別確定膠體金標(biāo)記抗HBsAg與膠體金標(biāo)記抗HBeAg的最佳使用濃度，然后按照該最佳使用濃度混合抗HBsAg膠體金與抗HBeAg膠體金。再按普通一步法試條組裝成條，按普通HBsAg一步法試條檢測，結(jié)果如圖8。
圖8中各小圖表示1為HBsAg和HBeAg均為陰性。
2為HBsAg為陽性，HBeAg為陰性。
3為HBsAg和HBeAg均為陽性。
4為檢測失誤。
圖9。
二、半定量一步法免疫檢測檢測尿樣(或血清)中的HCG，顯示符號如反應(yīng)膜處理用打印機(jī)預(yù)先打印兩條標(biāo)志線，將反應(yīng)膜劃分為半定量對照區(qū)，對照區(qū)和檢測區(qū)。用抗鼠IgG Fab段單克隆抗體包被半定量對照區(qū)，用膠體金單克降抗體包被對照線，用抗HCG單克隆抗體包被檢測線。包被好的膜即用BSA-PBS溶液封閉風(fēng)于，此膜即用做試條中的反應(yīng)膜。選用抗HCG單克隆抗體與膠體金結(jié)合，再按照普通一步法試條組裝法組裝成條。
檢測時將試條的下端放入尿液或血清中(如圖9)取出后再放置幾分鐘便可對照色卡讀結(jié)果。
測量結(jié)果可用比色卡對比給出(圖10)1.在HCG含量在每毫升零國際單位至200毫國際單位的濃度范圍內(nèi)，半定量線(S)比對照線(C)。的顏色深，檢測線(T)的顏色隨NCG濃度升高而加深。
2.在HCG含量在每毫升5個國際單位或以上時，半定量線(S)顏色相同于或弱于對照線(C)，檢測線(T)的顏色隨HCG濃度升高而變淺。
本發(fā)明的優(yōu)點1)本發(fā)明免疫檢測方法可用在半定量檢測及一檢多項檢測2)操作簡便；3)整個檢測省時半定量檢測時省樣品4)用途廣泛，可用于所有一步法免疫檢測及其它檢測系統(tǒng)中。

1).圖1為HCG一步法檢測試條2).圖2為HCG檢測陰性結(jié)果3).圖3為HCG檢測陽性結(jié)果4).圖4為本發(fā)明一檢多項一步法免疫檢測試條5).圖5為本發(fā)明半定量一步法免疫檢測試條6).圖6A為低濃度半定量線顏色對比7).圖6B為高濃度半定量線顏色對比8).圖7為血清樣品檢測例結(jié)果9).圖8為血清樣品檢測試條顯示10).圖9為檢測尿樣(或血清)操作示意11).圖10為檢測尿樣比色卡結(jié)果
權(quán)利要求
1.一檢多項一步法免疫檢測方法與半定量一步法免疫檢測方法使用一步法檢測試條，其特征在于在原試條上用于觀察結(jié)果的測試反應(yīng)區(qū)預(yù)先設(shè)置打印了兩條或以上的標(biāo)志線，從而將反應(yīng)區(qū)劃分為三個或以上的反應(yīng)區(qū)，并利用反應(yīng)膜根據(jù)不同檢測目的可在不同反應(yīng)區(qū)包被不同抗原(抗體)的特性，以實現(xiàn)在一個試條上同時做多項檢測之目的。此外，將其中一個反應(yīng)區(qū)包被上一定量的抗膠體金單抗，或其他與檢測反應(yīng)無交叉的單抗系統(tǒng)即在反應(yīng)中作為顏色深淺永遠(yuǎn)不變的對照線，另一個反應(yīng)區(qū)包被上抗鼠IgG單抗即在反應(yīng)中作為顏色深線將隨著待檢物濃度不同而改變的半定量線，從而實現(xiàn)半定量檢測的目的，尤其可以有效判別一步法檢測中通常在高濃度出現(xiàn)的HOOK效應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的一檢多項一步法及半定量一步法免疫檢測方法，其特征在于所述的標(biāo)志線用打印機(jī)預(yù)先打印在反應(yīng)膜上，所述的各反應(yīng)線，對照線及半定量對照線可用dispenser(噴頭)包被，采用通常使用的噴的方式，也可采用″plotter″或人工劃線方式包被。
3.如權(quán)利要求1所述的半定量一步法免疫檢測方法，其特征在于檢測待檢物的濃度時，使用比色卡對比得出待檢物的濃度范圍。
全文摘要
本發(fā)明是將半定量免疫檢測方法與一檢多項免疫檢測方法應(yīng)用于一步法檢測試條上,從而解決了一步法檢測方法原來只能作定性檢測和一檢一項的缺陷。該方法通過一條試條一次檢測同時即能得到多項檢測結(jié)果,即同時得到多種定性結(jié)論或得到包括數(shù)種量程在內(nèi)的寬量程定量標(biāo)示。本方法將普通試條反應(yīng)區(qū)設(shè)置打印了兩條或兩條以上的標(biāo)志線,以此將反應(yīng)區(qū)劃分為三個或三個以上的反應(yīng)區(qū),并利用反應(yīng)膜,根據(jù)不同檢測目的,可在不同反應(yīng)區(qū)包被不同溶液的特性,以實現(xiàn)在一條試條上同時做多項檢測的目的;同時,通過增加一條半定量對照線,而使該一步法檢測試條在得到定性結(jié)果的同時,得到半定量檢測的結(jié)果。
文檔編號G01N33/53GK1220397SQ98117648
公開日1999年6月23日 申請日期1998年8月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月28日
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