專(zhuān)利名稱(chēng)：在生物液體中測(cè)定含有β－內(nèi)酰胺核的抗生素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用對(duì)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素敏感的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)受體在生物液體中測(cè)定含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素的快速敏感的新方法。本發(fā)明還涉及用于實(shí)施該方法的試劑盒。
目前，抗生素的使用非常廣泛，它不僅在細(xì)菌引起的感染疾病的治療中作為治療劑，而且用作食物保存劑和刺激生長(zhǎng)的動(dòng)物飼料添加劑。因此，人們?cè)絹?lái)越感覺(jué)到，需要能夠在復(fù)雜的生物液體或緩沖水介質(zhì)中檢測(cè)即使是非常低濃度的抗生素的存在，所述生物液體例如奶、尿、血液、血清、唾液、肉提取物、發(fā)酵液。
一個(gè)例子是奶的生產(chǎn)，因?yàn)槭褂每股刂委熌膛５哪承└腥炯膊∈潜娝苤摹?br> 然而，由于明顯的醫(yī)學(xué)原因，原則上用于人類(lèi)食用的奶必須沒(méi)有任何微量抗生素。而且，在奶產(chǎn)品如奶酪、酸乳等的生產(chǎn)過(guò)程中，0.005I.U./ml或更低濃度的青霉素即可產(chǎn)生不利影響。
可設(shè)想幾種情況。在第一種情況中，例如為了在裝入貨車(chē)前在農(nóng)場(chǎng)中檢測(cè)抗生素的存在，將優(yōu)選一種極為快速(少于5分鐘)而簡(jiǎn)單的檢驗(yàn)方法。也可設(shè)想在例如用于治療的抗生素已知、而且該檢驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)法定標(biāo)準(zhǔn)的所述抗生素時(shí)使用這種快速檢驗(yàn)。在第二種情況下，當(dāng)重點(diǎn)不是速度時(shí)，重要的是檢測(cè)大部分(如果不是全部)法定標(biāo)準(zhǔn)的抗生素。
實(shí)際上，一些國(guó)家的法律實(shí)行非常明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。例如美國(guó)官方要求奶中下列六種抗生素的濃度不超過(guò)非常明確的值青霉素，5 ppb；氨芐青霉素，10 ppb；阿莫西林，10 ppb；氯唑西林，10 ppb；頭孢匹林，20 ppb；頭孢噻呋，50 ppb。歐盟實(shí)行如下質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)青霉素，4 ppb；阿莫西林，4 ppb；氨芐青霉素，4 ppb；氯唑西林，30 ppb；雙氯西林，30ppb；苯唑西林，30 ppb；頭孢匹林，10 ppb；頭孢噻呋，100 ppb；頭孢喹肟20 ppb；萘夫西林30 ppb；頭孢唑啉，50ppb。
因此，具有可檢測(cè)大多數(shù)抗生素的檢驗(yàn)方法是有利的。而且，在乳品加工業(yè)可以認(rèn)為，由于沒(méi)有兼有快速、靈敏和簡(jiǎn)便特征的檢驗(yàn)方法，能最佳組合這三個(gè)參數(shù)的檢驗(yàn)方法將是有利的，即使它們并沒(méi)有被完全滿足。
為在生物液體中檢測(cè)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素，已提出了各種類(lèi)型的檢驗(yàn)方法。通常這些檢驗(yàn)所采用的檢測(cè)方法使用特異識(shí)別抗生素或該抗生素類(lèi)似物的識(shí)別試劑(受體或抗體)和標(biāo)記試劑(放射性元素、酶、熒光試劑等)。根據(jù)所選試劑不同，可使用所謂的放射免疫分析(RIA)、放射性受體分析(RRA)、酶免疫分析(EIA)等。根據(jù)它們的一般原則，這些檢驗(yàn)采用上述兩種試劑(檢測(cè)試劑)的最小組合，該組合應(yīng)可獲得其數(shù)值指示存在的抗生素的量的結(jié)果。
應(yīng)當(dāng)注意，根據(jù)所選擇的檢測(cè)方法，標(biāo)記試劑可與識(shí)別試劑偶聯(lián)，或通過(guò)識(shí)別試劑的識(shí)別與抗生素或抗生素類(lèi)似物偶聯(lián)。也有一些方法，其中識(shí)別試劑或抗生素或抗生素類(lèi)似物本身含有標(biāo)記試劑(例如放射性標(biāo)記的抗生素)。
美國(guó)專(zhuān)利4,239,852描述了在奶中檢測(cè)具有β-內(nèi)酰胺核抗生素的微生物學(xué)方法。根據(jù)該方法，將奶樣品首先在對(duì)抗生素高度敏感的微生物特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)的細(xì)胞部分存在時(shí)孵育，然后在標(biāo)記了放射性元素或酶的抗生素存在下孵育。孵育的條件是允許樣品中可能存在的抗生素和標(biāo)記的抗生素與細(xì)胞部分結(jié)合。
孵育后，細(xì)胞部分從混合物中分離，然后洗滌。之后測(cè)定與細(xì)胞部分結(jié)合的標(biāo)記抗生素的量，并與標(biāo)準(zhǔn)品比較。與細(xì)胞部分結(jié)合的標(biāo)記抗生素的量與所分析的奶樣品中存在的抗生素的濃度成反比。
該方法要求相當(dāng)精確的操作，尤其是在細(xì)胞部分從混合物中分離階段。此外，在其最靈敏的版本中，該方法使用放射性元素(14C或125I)標(biāo)記的抗生素，其中該版本可在牛奶中檢測(cè)達(dá)0.01 I.U./ml，甚至0.001I.U./ml的青霉素G。在這種情況下，對(duì)牛奶中可能存在的抗生素量的測(cè)定必需使用特殊儀器例如閃爍計(jì)數(shù)器。此外，處理即使非常小量的放射性產(chǎn)品對(duì)進(jìn)行該分析的人員也不是完全沒(méi)有危險(xiǎn)。
歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)593112描述了另一種在奶中檢測(cè)抗生素的方法。該方法使用從抗生素敏感微生物如嗜熱脂肪芽孢桿菌中分離的一種蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)還標(biāo)記了酶如過(guò)氧化物酶。
該檢驗(yàn)按如下進(jìn)行奶樣品在所述標(biāo)記蛋白質(zhì)存在下于一管中孵育；孵育后，將奶轉(zhuǎn)移至管壁已固定了參照抗生素的第二管中；進(jìn)行第二次孵育，然后除去管中的內(nèi)容物；用洗滌溶液洗滌第二管管壁三次，除去洗滌液，然后將第二管中存在的殘余物轉(zhuǎn)移至一張吸附紙上；再向第二管中加入顯色底物，再次孵育，然后加入終止顯色的溶液；將該管的顯色與用抗生素標(biāo)準(zhǔn)樣品平行進(jìn)行的相同實(shí)驗(yàn)的顯色比較。支持物上固定的標(biāo)記蛋白的量，繼而顯色強(qiáng)度與所分析的奶樣品中存在的抗生素的量成反比。
根據(jù)該專(zhuān)利申請(qǐng)的實(shí)施例1,該檢驗(yàn)可檢測(cè)濃度低至約5ppb的青霉素G，并可檢測(cè)到阿莫西林(5ppb)、氨芐青霉素(10ppb)、頭孢匹林(5ppb)和頭孢噻呋(5ppb)。該檢驗(yàn)不能檢測(cè)高達(dá)歐洲法規(guī)所實(shí)行水平的青霉素、阿莫西林和氨芐青霉素，另一方面，該檢測(cè)相當(dāng)復(fù)雜，不能完全達(dá)到本發(fā)明所追求的靈敏和簡(jiǎn)便的標(biāo)準(zhǔn)。
還已知另一種酶學(xué)方法，該方法可測(cè)定奶中低濃度的抗生素(J.M.Frere等，抗微生物藥物和化學(xué)療法(Antimicrobial Agents andChemotherapy),18(4),506-510(1980)，以及專(zhuān)利EP 85667和EP 468946)，該方法基于特定酶的使用，即馬杜拉放線菌R39(ActinomaduraR39)產(chǎn)生的可溶性細(xì)胞外D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶(下文稱(chēng)作“酶R39”)。酶R39具有水解各種肽的D-丙氨酰-D-丙氨酸基團(tuán)的特異活性，并能水解某些硫酯。
此外，酶R39與具有β-內(nèi)酰胺核的抗生素反應(yīng)迅速形成無(wú)活性和基本不可逆的等摩爾酶-抗生素復(fù)合物。
該檢驗(yàn)的最新版本中(EP 468946)，在允許樣品中可能存在的β-內(nèi)酰胺抗生素與該酶反應(yīng)形成無(wú)活性和基本不可逆的等摩爾酶-抗生素復(fù)合物的條件下，將給定體積的待測(cè)液體樣品與預(yù)定量的酶R39孵育。
然后，在允許硫酯類(lèi)底物被第一次孵育過(guò)程中未與抗生素形成復(fù)合物的殘余酶R39水解的條件下，將確定量的硫酯類(lèi)底物與第一階段獲得的產(chǎn)物孵育。然后采用可通過(guò)與巰基鏈烷酸的游離SH基團(tuán)反應(yīng)顯色的試劑，經(jīng)比色分析測(cè)定由此形成的巰基鏈烷酸的量。顯色強(qiáng)度與預(yù)先從含有已知量抗生素的樣品建立的標(biāo)準(zhǔn)比較。定量測(cè)定可通過(guò)在分光光度計(jì)中測(cè)量來(lái)進(jìn)行；對(duì)于奶，必需預(yù)先凈化樣品。
根據(jù)專(zhuān)利EP 468,946的實(shí)施例，該方法可在奶中共5分鐘的孵育時(shí)間里測(cè)定10ppb青霉素G，共15分鐘的孵育時(shí)間里測(cè)定約2.5ppb青霉素G。
對(duì)于在食品中檢測(cè)抗生素的方法所必需的快速、簡(jiǎn)便和靈敏的標(biāo)準(zhǔn)，本申請(qǐng)人自己設(shè)定了探索生物液體中檢測(cè)抗生素的更有效的新方法的目標(biāo)。特別地，申請(qǐng)人自己設(shè)定了探索在單次檢驗(yàn)中測(cè)定歐洲和美國(guó)政府規(guī)定的大多數(shù)抗生素之方法的目標(biāo)。而且，所探索的方法應(yīng)當(dāng)可以在少數(shù)步驟中獲得該結(jié)果，優(yōu)選這些步驟可被非技術(shù)人員操作。本申請(qǐng)人還尋求了用比現(xiàn)有方法更短的孵育時(shí)間實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)的方法。
本申請(qǐng)人最近發(fā)現(xiàn)在生物液體中檢測(cè)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素的新方法，這些方法可以較好地實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)。
因此，本發(fā)明涉及在生物液體中檢測(cè)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素的新方法，其包括如下步驟a)用一定量的識(shí)別試劑接觸確定體積的所述生物液體，并在允許該識(shí)別試劑與所述液體中可能存在的抗生素形成復(fù)合物的條件下，孵育獲得的混合物；b)在允許參照抗生素與步驟a)中沒(méi)有反應(yīng)的識(shí)別試劑形成復(fù)合物的條件下，用至少一種固定在支持物上的參照抗生素與步驟a)獲得的混合物接觸；和c)測(cè)定結(jié)合在支持物上的識(shí)別試劑的量，其特征在于識(shí)別試劑包括獲自地衣芽孢桿菌并對(duì)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素敏感的受體。


圖1描述了一種根據(jù)本發(fā)明可使用的支持物，其是一種檢驗(yàn)裝置，包括固相支持物(1)及其上附著的膜(2)、(3)和(4)。圖1a是正面圖，圖1b是該檢驗(yàn)裝置的縱向橫截面圖。
本發(fā)明的方法的優(yōu)越性基于特異識(shí)別試劑的使用，該識(shí)別試劑包括獲自地衣芽孢桿菌并對(duì)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素敏感的受體，即BlaR蛋白，Y.Zhu等(細(xì)菌雜志(J.Bacteriol.),1137-1141,(1990))描述了其分離和肽序列，或BlaR-CTD多肽，BlaR-CTD是BlaR的羧基端區(qū)域，B.Joris等(FEMS Microbiology Letters,107-114,(1990))描述了其分離和肽序列。
本發(fā)明使用受體BlaR或BlaR-CDT檢測(cè)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素比迄今所使用的識(shí)別試劑具有明顯的優(yōu)點(diǎn)。其理由是受體BlaR或BlaR-CDT能非常迅速地與非常大量的抗生素形成復(fù)合物，并且比已知識(shí)別試劑例如獲自嗜熱脂肪芽孢桿菌的受體需要更短的孵育時(shí)間。
作為通過(guò)本發(fā)明的方法可檢測(cè)的抗生素的例子，可提到的是如下抗生素芐基青霉素(或青霉素G)，氨芐青霉素，阿莫西林，羧芐西林，甲基西林(methyleillin)，氯唑西林，6-APA，單環(huán)內(nèi)酰胺(monolactam)，氨曲南，美西林，頭孢氨芐，頭孢來(lái)星，頭孢噻啶，nitrocephine,cefatoxime，頭孢呋辛，頭孢噻呋，頭孢匹林，7-ACA。更具體地，本發(fā)明的方法可檢測(cè)美國(guó)和歐洲政府所控制的低至所能接受的極限閾值的所有抗生素。
本發(fā)明的方法允許在生物液體如奶、尿、血液、血清、唾液、肉提取物、發(fā)酵液，或緩沖水介質(zhì)中檢測(cè)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，識(shí)別試劑以偶聯(lián)標(biāo)記試劑的形式使用。該標(biāo)記試劑可是各種性質(zhì)的。該標(biāo)記試劑可是微粒型的，例如金屬膠體顆粒(鉑、金、銀等)，硒、碳、硫或碲的膠體顆粒，或有色合成乳膠的膠體顆粒。該標(biāo)記試劑還可是熒光物質(zhì)例如活化熒光素(可獲自Boeringher-Mannheim Biochemica)、熒光素異氰酸酯、羅丹明四甲基異氰酸酯、或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它熒光物質(zhì)。該標(biāo)記試劑還可是酶，例如β-內(nèi)酰胺酶、過(guò)氧化物酶、磷酸酶等。在這種情況下，受體BlaR或BlaR-CTD可通過(guò)化學(xué)或遺傳學(xué)方法與該酶性質(zhì)的標(biāo)記試劑偶聯(lián)形成融合蛋白。
該識(shí)別試劑可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)方法與標(biāo)記試劑偶聯(lián)。識(shí)別試劑可直接與標(biāo)記試劑相連，或通過(guò)形成中間復(fù)合物與之相連。識(shí)別試劑和標(biāo)記試劑之間的偶聯(lián)可在本發(fā)明方法實(shí)施過(guò)程中的不同時(shí)間進(jìn)行。根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案，識(shí)別試劑和標(biāo)記試劑之間的偶聯(lián)在識(shí)別試劑與待分析的生物液體接觸之前進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案，識(shí)別試劑和標(biāo)記試劑的偶聯(lián)可在識(shí)別試劑與生物液體樣品接觸時(shí)或之后進(jìn)行。優(yōu)選地，識(shí)別試劑的標(biāo)記在識(shí)別試劑與待分析樣品接觸之前進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的方法的第一步a)包括將一定體積的生物液體與一定量的識(shí)別試劑接觸，并在允許該識(shí)別試劑與該生物液體中可能存在的抗生素形成復(fù)合物的條件下，孵育獲得的混合物。
生物液體可在4-60℃的溫度范圍內(nèi)與受體BlaR或BlaR-CTD孵育。優(yōu)選地，該溫度是約47℃。孵育溫度的增加可縮短孵育時(shí)間，反之亦然。因此，總是可以通過(guò)增加溫度來(lái)縮短該方法的時(shí)間。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的第二步b)中，將步驟a)中獲得混合物與至少一種固定在支持物上的參照抗生素接觸。
根據(jù)本發(fā)明可使用的支持物可是多種類(lèi)型的。它們可是固相支持物，如包被了參照抗生素制品的管、盤(pán)或柱。其可是結(jié)合了膜的固相支持物形式的檢驗(yàn)裝置，在一個(gè)檢驗(yàn)區(qū)域放置了一或多種捕獲物質(zhì)。它們可以是能形成凝膠并固定了參照抗生素的磁性或非磁性珠形式的支持物(瓊脂糖、聚苯乙烯等)。
參照抗生素可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法固定在支持物上，例如通過(guò)與支持物共價(jià)或非共價(jià)吸附，吸附可選擇性地通過(guò)間隔子來(lái)進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，步驟a)和b)可同時(shí)進(jìn)行。
本發(fā)明的方法的步驟c)包括測(cè)定與固定了參照抗生素的固相支持物結(jié)合的受體。該測(cè)定所用方法與所用標(biāo)記試劑的類(lèi)型直接相關(guān)。如果標(biāo)記試劑是酶，測(cè)定步驟將涉及與該酶特異的反應(yīng)，該反應(yīng)與例如一定顏色的產(chǎn)生相關(guān)。如果標(biāo)記試劑是熒光性質(zhì)的，該測(cè)定將通過(guò)簡(jiǎn)單測(cè)量支持物上的熒光來(lái)進(jìn)行。對(duì)于金屬顆粒或有色乳膠，與支持物結(jié)合的受體的存在通過(guò)其強(qiáng)度與支持物上結(jié)合的受體的數(shù)量成正比的顏色來(lái)反映。不管使用何種類(lèi)型的標(biāo)記試劑，所檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度與分析樣品中存在的抗生素的量成反比。
本發(fā)明還涉及用于測(cè)定生物液體中的抗生素的檢驗(yàn)試劑盒，其包括至少一種識(shí)別試劑和至少一種固定在支持物上的參照抗生素，其中該識(shí)別試劑包含獲自地衣芽孢桿菌并對(duì)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素敏感的受體。
下列實(shí)施例闡述了實(shí)施本發(fā)明的各方面和實(shí)施方式，但其并不限制本本實(shí)施例闡述在奶中測(cè)定衛(wèi)生部門(mén)控制的含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素。本實(shí)施例中所描述的檢驗(yàn)使用與用作標(biāo)記試劑的金珠偶聯(lián)的BlaR-CTD受體，并使用檢驗(yàn)裝置形式的支持物，其包含結(jié)合了膜的固相支持物。1.1.BlaR-CTD與金珠的偶聯(lián)1.1.1.BlaR-CTD的生物素化將3.79ml BlaR-CTD(濃度6.6mg/ml)識(shí)別試劑溶液加至20mM pH7的磷酸鈉緩沖液中。然后向該BlaR-CTD溶液中加入41.71ml的碳酸氫鹽緩沖液(0.1M碳酸氫鈉，pH 9)和2ml同樣溶于碳酸氫鹽緩沖液的2.23mg/ml N-羥基琥珀酰亞胺6-(生物素酰氨基)己酸酯溶液。室溫避光在LABINCO轉(zhuǎn)軸管式攪拌器(可獲自VEL，比利時(shí))上以2轉(zhuǎn)/分鐘的速度溫和攪拌該溶液2小時(shí)。在相同條件下將2.5ml Tris緩沖液(1M pH8)與反應(yīng)混合物孵育30分鐘。由此獲得的溶液對(duì)HNM緩沖液(Hepes 100 mM,pH8,NaCl 100mM,MgCl250mM)透析24小時(shí)。以這種方式獲得溶于HNM-BSA緩沖液(Hepes 500mM,pH8,NaCl 500mM,MgCl2250mM,BSA10mg/ml)中濃度達(dá)250μg生物素化BlaR-CTD/ml緩沖液的生物素化BlaR-CTD溶液。該溶液保存于-20℃。1.1.2.標(biāo)記試劑標(biāo)記試劑使用沉積了羊抗生物素抗體的直徑40nm的金顆粒，其是溶于2mM四硼酸鈉水溶液(pH7.2)中的懸液形式，采用0.1％疊氮化鈉(可獲自British Biocell(Ref.GAB40))穩(wěn)定化。該懸液在520nm處的光密度約為10，蛋白質(zhì)濃度約為24μg/ml。1.1.3.生物素化BlaR-CTD與金顆粒偶聯(lián)實(shí)施例1.1.1中制備的生物素化BlaR-CTD用HNM-BSA緩沖液(Hepes500mM,pH8,NaCl 500mM,MgCl2250mM,BSA 10mg/ml)稀釋114.7倍。室溫混合22.5份體積的該生物素化BlaR-CTD稀釋溶液、7.5份體積的HNM-BSA緩沖液、9.27份體積用于標(biāo)記生物素化BlaR-CTD的金顆粒懸液和6份體積的參照金顆粒懸液(見(jiàn)下面實(shí)施例1.1.4)1.1.4．獨(dú)立參照在該檢驗(yàn)中還采用一種參照物質(zhì)，根據(jù)它提供的條帶強(qiáng)度能快速定量樣品中存在的抗生素。
為此，采用其上沉積了羊抗兔免疫球蛋白抗體的40nm金顆粒。該顆?？蓮腂ritish Biocell(Ref.GAR40)以0.1％疊氮化鈉穩(wěn)定的溶于2mM四硼酸鈉水溶液(pH7.2)的懸液形式獲得。該懸液在520nm處的光密度約為3，蛋白質(zhì)濃度約為6μg/ml。1.2．檢測(cè)裝置所用檢測(cè)裝置包括具有第一和第二末端的固相支持物(1)，從第一末端開(kāi)始其上連續(xù)結(jié)合了-用于純化被分析液體的膜(2)，-其上固定了兩種捕獲物質(zhì)(參照抗生素和能結(jié)合獨(dú)立參照物的物質(zhì))的膜(3)，和-吸附膜(4)。1.2.1組裝分析裝置首先按照下列方法使用Clamshell Laminator型層壓機(jī)(可獲自BioDot公司)組裝300×76.2mm大小的卡片裁出300×76.2mm大小的ArCare 8565型長(zhǎng)方形塑料支持物(可獲自Adhesive Research)(支持物(1))。然后，裁出300×20mm大小的長(zhǎng)方形Leukosorb LK4膜(可獲自Pall Gelman Sciences)(膜(2))、300×25mm大小的長(zhǎng)方形Hi-Flow SX膜(可獲自Millipore)(膜(3))、300×40mm大小的長(zhǎng)方形3mm纖維素膜(可獲自Whatmann)(膜(4))。
在層壓機(jī)下面模型的特定位置接連放上膜(2)和(4)，然后是膜(3)。覆蓋了粘合劑的固相支持物(1)置于該機(jī)器的頂蓋上，粘性面朝向空氣。閉合層壓機(jī)，將置于下面模型上的膜和粘性支持物接觸；通過(guò)真空泵抽氣將膜嚴(yán)密固定就位。當(dāng)真空停止時(shí)，獲得了包含固相支持物(1)和其上固定的膜(2)、(3)和(4)的卡片。
然后在膜(3)上沉積下列溶液近側(cè)第一捕獲物質(zhì)；1號(hào)帶；遠(yuǎn)側(cè)第二捕獲物質(zhì)；2號(hào)帶。這些捕獲物質(zhì)用Bio Dot公司的X-Y PlatformBiojet Quanti-3000型“分配器”沉積。
通過(guò)將整個(gè)卡片置于60℃壓力熱空氣中1分鐘以迅速蒸發(fā)沉淀的溶液。
用切紙機(jī)類(lèi)設(shè)備或旋轉(zhuǎn)設(shè)備(可獲自Bio Dot、Kinematic或Akzo)將組裝后的卡片切成長(zhǎng)條。丟棄末端的長(zhǎng)條，其它長(zhǎng)條備用。
圖1說(shuō)明了這種分析裝置。
為了保存，該分析裝置置于含有干燥劑的不透光密封容器中(AirSec，法國(guó))。1.2.2．第一捕獲物質(zhì)-參照抗生素。
在25℃將8ml含有溶于碳酸鈉緩沖液(100mM,pH9)的213mg人丙種球蛋白(G4386,Sigma)和8.6mg鹽酸2-亞氨基-硫雜戊環(huán)(Aldrich,330S6-6)的溶液孵育1小時(shí)。
此外，在25℃將20ml含有溶于碳酸鈉緩沖液(100mM,pH9)的119.8mg頭孢菌素C和54mg磺基琥珀酰亞胺基4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(sSMCC,22322 Pierce)的溶液孵育1小時(shí)。
然后將上述制備的二溶液混合。加入3ml NaH2PO4(500mM)調(diào)節(jié)獲得的溶液的pH值至7.1，將該溶液在25℃孵育2小時(shí)。孵育后獲得的混合物對(duì)1升磷酸鈉緩沖液(10mM,pH7.5)透析3次。將獲得的溶液通過(guò)0.22um濾器過(guò)濾，然后分成等分試樣凍存于-20℃直至使用。
使用時(shí)融化等分試樣，向其中加入食品著色劑，然后將其沉積于膜上，以隨時(shí)指示沉積物的確切位置和示蹤物的量。
第一捕獲物質(zhì)可結(jié)合相對(duì)于樣品中存在的抗生素的量而言過(guò)量的、與金顆粒偶聯(lián)的BlaR-CTD。1.2.3．第二捕獲物質(zhì)-能結(jié)合獨(dú)立參照物的物質(zhì)。
第二捕獲物質(zhì)可使用兔免疫球蛋白溶液(Sigma I 5006)，在10mM磷酸鈉(pH7.5)、5mg/ml人丙種球蛋白的緩沖液中的免疫球蛋白濃度為0.5mg/ml。當(dāng)液體沿分析裝置遷移時(shí)，該第二捕獲物質(zhì)可使獨(dú)立參照物停留。1.3．測(cè)定奶中的抗生素1.3.1．3分鐘檢驗(yàn)-快速檢驗(yàn)制備分別含有0、1、2、3、4、5和6ppb青霉素G的7份鮮奶樣品。然后以下列方式分析每一份溶液取200ul奶樣品和45.27ul實(shí)施例1.1.3制備的溶液，放入玻璃瓶中。將該混合物在47℃孵育1分鐘。取一檢驗(yàn)裝置垂直放入該玻璃瓶中，使檢驗(yàn)裝置的第一端與混合物接觸，并且第二端靠在玻璃瓶壁上。將該裝置在47℃孵育2分鐘，讓混合物在檢驗(yàn)裝置上遷移。
下面表1總結(jié)了這7個(gè)被測(cè)樣品的結(jié)果。給被測(cè)條帶確定一個(gè)范圍從0到10的強(qiáng)度值，數(shù)值10是指最強(qiáng)的條帶，數(shù)值0是指最弱的條帶。根據(jù)該度量法，參照條帶給出數(shù)值6。第一條帶中觀察到的信號(hào)強(qiáng)度與樣品中存在的青霉素G的量成反比。
表1青霉素G 強(qiáng)度(ppb)第一條帶第二條帶0 10 61 962 963 464 065 066 06在該實(shí)施例中，當(dāng)?shù)谝粭l帶的強(qiáng)度比第二條帶的強(qiáng)度低時(shí)，檢驗(yàn)被認(rèn)為是陽(yáng)性的。表1中的結(jié)果顯示，該檢驗(yàn)允許在3分鐘內(nèi)檢測(cè)奶樣品中低于4ppb的青霉素G。
還在相同條件下對(duì)含有β-內(nèi)酰胺核的其它抗生素進(jìn)行了檢測(cè)。在3分鐘內(nèi)進(jìn)行的該檢驗(yàn)允許在奶樣品中檢測(cè)低至5ppb的阿莫西林、低至5ppb的氨芐青霉素、低于10ppb的氯唑西林、低于20ppb的雙氯西林、低于20ppb的苯唑西林、低至20ppb的頭孢匹林。1.3.2．5分鐘檢驗(yàn)制備6個(gè)分別含0、2、4、6、8和10ppb氯唑西林的鮮奶樣品。然后以下列方式分析每一個(gè)樣品。
取200ul奶樣品和45.27ul實(shí)施例1.1.3制備的溶液，置于玻璃瓶中。將該混合物于47℃孵育3分鐘。取一檢驗(yàn)裝置垂直置于玻璃瓶中，使該檢驗(yàn)裝置第一端與混合物接觸，第二端靠在玻璃瓶壁上。將該裝置在47℃孵育2分鐘，讓混合物在檢驗(yàn)裝置上遷移。
下面的表2總結(jié)了這6個(gè)被測(cè)樣品獲得的結(jié)果。給被測(cè)條帶確定一個(gè)范圍從0到10的強(qiáng)度值，數(shù)值10是指最強(qiáng)的條帶，數(shù)值0是指最弱的條帶。根據(jù)該度量法，參照條帶給出數(shù)值6。第一條帶中觀察到的信號(hào)強(qiáng)度與樣品中存在的氯唑西林的量成反比。
表2氯唑西林 強(qiáng)度(ppb)第一條帶第二條帶0 10 62 6 64 5 66 3 68 3 610 3 6在該實(shí)施例中，當(dāng)?shù)谝粭l帶的強(qiáng)度比第二條帶的強(qiáng)度低時(shí)，檢驗(yàn)被認(rèn)為是陽(yáng)性的。表2中的結(jié)果顯示，該檢驗(yàn)允許在5分鐘內(nèi)檢測(cè)奶樣品中低于4ppb的氯唑西林。
還在相同條件下對(duì)含有β-內(nèi)酰胺核的其它抗生素進(jìn)行了檢測(cè)。在5分鐘內(nèi)進(jìn)行的該檢驗(yàn)允許在奶樣品中檢測(cè)低至3ppb的青霉素G、低至4ppb的阿莫西林、低至4ppb的氨芐青霉素、低至8ppb的雙氯西林、低至8ppb的苯唑西林、低至16ppb的頭孢匹林、低至100ppb的頭孢噻呋、低于20ppb的頭孢喹肟、低至20ppb的萘夫西林、低至60ppb的頭孢唑啉。
該檢驗(yàn)特別適于在將運(yùn)奶貨車(chē)倒空至倉(cāng)庫(kù)之前作為分類(lèi)檢驗(yàn)。1.3.3．9分鐘檢驗(yàn)制備6個(gè)分別含0、4、6、8、10和12ppb頭孢匹林的鮮奶樣品。然后以下列方式分析每一個(gè)樣品。
取200ul奶樣品和45.27ul實(shí)施例1.1.3制備的溶液，置于玻璃瓶中。將該混合物于47℃孵育7分鐘。取一檢驗(yàn)裝置垂直置于玻璃瓶中，使該檢驗(yàn)裝置第一端與混合物接觸，第二端靠在玻璃瓶壁上。將該裝置在47℃孵育2分鐘，讓混合物在檢驗(yàn)裝置上遷移。
下面的表3總結(jié)了這6個(gè)被測(cè)樣品獲得的結(jié)果。給被測(cè)條帶確定一個(gè)范圍從0到10的強(qiáng)度值，數(shù)值10是指最強(qiáng)的條帶，數(shù)值0是指最弱的條帶。根據(jù)該度量法，參照條帶給出數(shù)值6。第一條帶中觀察到的信號(hào)強(qiáng)度與樣品中存在的頭孢匹林的量成反比。
表3頭孢匹林(ppb) 強(qiáng)度第一條帶第二條帶0 10 64 6 66 5 68 4 610 3 612 3 6在該實(shí)施例中，當(dāng)?shù)谝粭l帶的強(qiáng)度比第二條帶的強(qiáng)度低時(shí)，檢驗(yàn)被認(rèn)為是陽(yáng)性的。表3中的結(jié)果顯示，該檢驗(yàn)允許在9分鐘內(nèi)檢測(cè)奶樣品中低于6ppb的頭孢匹林。
還在相同條件下對(duì)含有β-內(nèi)酰胺核的其它抗生素進(jìn)行了檢測(cè)。在9分鐘內(nèi)進(jìn)行的該檢驗(yàn)允許在奶樣品中檢測(cè)低至3ppb的青霉素G、低至4ppb的阿莫西林、低至4ppb的氨芐青霉素、低至4ppb的氯唑西林、低于8ppb的雙氯西林、低于8ppb的苯唑西林、低至80ppb的頭孢噻呋、低于20ppb的頭孢喹肟、低于20ppb的萘夫西林、低至45ppb的頭孢唑啉。
因此，在9分鐘內(nèi)進(jìn)行的該檢驗(yàn)允許檢測(cè)所有歐洲政府當(dāng)前控制的低至這些政府實(shí)行的法定極限的抗生素。1.3.4．20分鐘檢驗(yàn)制備6個(gè)分別含0、20、30、40、50和60ppb頭孢噻呋的鮮奶樣品。然后以下列方式分析每一個(gè)樣品。
取200ul奶樣品和45.27ul實(shí)施例1.1.3制備的溶液，置于玻璃瓶中。將該混合物于47℃孵育18分鐘。取一檢驗(yàn)裝置垂直置于玻璃瓶中，使該檢驗(yàn)裝置第一端與混合物接觸，第二端靠在玻璃瓶壁上。將該裝置在47℃孵育2分鐘，讓混合物在檢驗(yàn)裝置上遷移。
下面的表4總結(jié)了這6個(gè)被測(cè)樣品獲得的結(jié)果。給被測(cè)條帶確定一個(gè)范圍從0到10的強(qiáng)度值，數(shù)值10是指最強(qiáng)的條帶，數(shù)值0是指最弱的條帶。根據(jù)該度量法，參照條帶給出數(shù)值6。第一條帶中觀察到的信號(hào)強(qiáng)度與樣品中存在的頭孢噻呋的量成反比。
表4頭孢噻夫 強(qiáng)度(ppb)第一條帶第二條帶0 10620 6 630 5 640 4 650 3 660 3 6在該實(shí)施例中，當(dāng)?shù)谝粭l帶的強(qiáng)度比第二條帶的強(qiáng)度低時(shí)，檢驗(yàn)被認(rèn)為是陽(yáng)性的。表中的結(jié)果顯示，該檢驗(yàn)允許在20分鐘內(nèi)檢測(cè)奶樣品中低于30ppb的頭孢噻呋。
因此，在20分鐘內(nèi)進(jìn)行的該檢驗(yàn)允許在單次檢驗(yàn)中檢測(cè)所有歐洲和美國(guó)政府當(dāng)前控制的低至這些政府實(shí)行的法定極限的抗生素。實(shí)施例2．測(cè)定奶中6種抗生素該實(shí)施例闡述檢測(cè)奶中美國(guó)政府控制的6種含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素。該實(shí)施例所描述的檢驗(yàn)使用與β-內(nèi)酰胺酶融合的融合蛋白形式的受體BlaR-CTD，并使用磁珠形式的支持物。2.1．BlaR-CTD-β-內(nèi)酰胺酶融合蛋白。
BlaR-CTD-β-內(nèi)酰胺酶融合蛋白通過(guò)受體BlaR-CTD(B.Joris等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters,107-114,1990)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)的Znβ-內(nèi)酰胺酶(M.Hussain等，1985，細(xì)菌學(xué)雜志，164:l,223-229,1985)之間的遺傳偶聯(lián)來(lái)獲得。
偶聯(lián)按以下方式進(jìn)行2.1.1．質(zhì)粒的構(gòu)建在B1aR-CTD多肽和β-內(nèi)酰胺酶的兩基因之間進(jìn)行l(wèi)/1的偶聯(lián)β-內(nèi)酰胺酶編碼基因按編碼框?qū)朐贐laR-CTD基因之后。攜帶該遺傳融合物的質(zhì)粒顯示卡那霉素抗性。下文將融合蛋白稱(chēng)作Fus 1。2.1.2．生產(chǎn)-菌株將攜帶該融合基因的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌。在LB+Km(50ug/ml)中篩選攜帶重組質(zhì)粒的克隆。-篩選用放射性抗生素標(biāo)記細(xì)胞提取物，之后變性聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示大部分該蛋白質(zhì)以分子量約50,000的融合蛋白質(zhì)形式產(chǎn)生。然而，翻譯后蛋白水解似乎將非常小比例(2％)的這些分子分解為兩種不同的活性。-培養(yǎng)將儲(chǔ)存于-70℃的重組細(xì)胞接種在500ml LB+Km(50ug/ml)培養(yǎng)基中。預(yù)培養(yǎng)物于37℃225rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。用600nm光密度為4的該500ml預(yù)培養(yǎng)物接種18升LB+Km(50ug/ml)培養(yǎng)基。當(dāng)該18升培養(yǎng)物的光密度值達(dá)到6時(shí)，停止培養(yǎng)。2.1.3．抽提終止培養(yǎng)后，立即過(guò)濾并離心細(xì)胞。在破碎儀中裂解細(xì)胞沉淀，保留上清液。該上清液中含有融合蛋白FUS1。2.1.4．純化-所用緩沖液●緩沖液A:20mM pH8.0 Tris,10％1,2-乙二醇,50um DTT；●緩沖液B緩沖液A+1M NaCl。
通過(guò)離子層析和分子篩部分純化該融合蛋白。抽提物沉積在QSFF柱(Pharmacia,Upsala)上，以緩沖液A洗滌后，用線性梯度的緩沖液B洗脫FUS1。然后將活性部分(±0.25M NaCl)合并，并沉積在G-100分子篩(Pharmacia,Upsala)上；用緩沖液A將其洗脫?；厥詹糠值钠骄然罟烙?jì)為30％。2.1.5．β-內(nèi)酰胺酶的抑制融合蛋白(9/10體積)與50mM EDTA(1/10體積)于37℃孵育45分鐘。使用溶于10mM pH6.0的二甲胂酸鹽緩沖液的nitrocefine檢驗(yàn)抑制情況。在存在或不存在Zn的情況下，信號(hào)應(yīng)分別是陽(yáng)性或陰性的。抑制后，基于β-內(nèi)酰胺酶活性測(cè)量的有效濃度是7.74pmol/ul。2.2固相支持物磁珠-頭孢菌素C(參照抗生素)。
使用BioMag 4100顆粒(獲自DRG Instrument GmbH,Marburg，德國(guó)，貨號(hào)AM 4100 B)，其N(xiāo)H2末端按如下方式以戊二醛活化-一體積的BioMag 4100顆粒初始溶液用5體積的0.01M pH6.0嘧啶緩沖液漂洗4次。將這些顆粒懸浮在2.5體積的溶于嘧啶緩沖液的5％戊二醛中，室溫旋轉(zhuǎn)攪拌3小時(shí)。然后，用2體積的0.01M pH7.0 Kpi緩沖液洗滌10次。然后將該顆粒重懸在1體積的溶于Kpi緩沖液的0.1M頭孢菌素C中，4℃旋轉(zhuǎn)攪拌過(guò)夜。進(jìn)行最終的洗滌直到頭孢菌素C從0.1M pH7.0 Kpi緩沖液中完全除去。2.3．在奶中測(cè)定6種抗生素青霉素G、氨芐青霉素、阿莫西林，氯唑西林，頭孢匹林和頭孢噻呋。2.3.1．所用的溶液-溶液1將在100mM pH8 Tris、1mg/ml BSA、50mM EDTA、50um DTT中凍干的700pmol融合蛋白用5ml Milli-Q水重新水化；進(jìn)行一次測(cè)量需要50ul該溶液。-溶液2:2ml實(shí)施例1.2中制備在100％異丙醇中的BioMag-頭孢菌素C顆粒；進(jìn)行一次測(cè)量需要20ul。-溶液3凍干的10 mM,pH6二甲胂酸鹽緩沖液和1M NaCl用500mlMilli-Q水重新水化。-溶液4:400ml溶于DMF的10mM nitrocefine用溶液3稀釋至40ml；每次檢測(cè)需要400ul。2.3.2．檢測(cè)方法向500ml含添加物的奶樣品中加入50ul溶液1,47℃孵育2分鐘。將20ul溶液2懸浮在奶中，47℃再孵育2分鐘。使用順磁磁鐵將顆粒吸附在容器壁上，將管中上清液倒出。用溶液3洗滌顆粒2次，同時(shí)用磁鐵進(jìn)行相同的操作。最后，加入400ul溶液4，與顆粒在47℃孵育3分鐘。然后，測(cè)定482nm處殘余溶液相對(duì)于nitrocefine溶液的吸光度。
該方法允許檢測(cè)低于當(dāng)局所實(shí)行標(biāo)準(zhǔn)濃度的美國(guó)法規(guī)給出的6種抗生素，即5ppb青霉素、10ppb氨芐青霉素、10ppb阿莫西林、10ppb氯唑西林、20ppb頭孢匹林和50ppb頭孢噻呋。實(shí)施例3．測(cè)定奶中3種抗生素(青霉素G、氯唑西林、頭孢噻呋)。
該實(shí)施例闡述在奶中檢測(cè)衛(wèi)生部門(mén)控制的含有β-內(nèi)酰胺核的3種抗生素。該實(shí)施例中所描述的檢驗(yàn)使用分別與堿性磷酸酶和過(guò)氧化物酶融合的兩種融合蛋白形式的受體BlaR-CTD，并使用微量反應(yīng)板形式的支持物。3.1．BlaR-CTD-堿性磷酸酶融合蛋白。
通過(guò)受體BlaR-CTD(B.Joris等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters,107-114(1990))和可獲自Boehringer-Mannheim Biochemica的活化堿性磷酸酶(貨號(hào)1464752)之間的化學(xué)偶聯(lián)，獲得BlaR-CTD-堿性磷酸酶融合蛋白。
偶聯(lián)按如下方式進(jìn)行3.1.1．偶聯(lián)BlaR-CTD和堿性磷酸酶在100mM pH9.8碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液中透析。15nmol BlaR-CTD與100ul活化的堿性磷酸酶(20mg/ml)在25℃孵育2小時(shí)。3.1.2．終止反應(yīng)加入40ul 2mM,pH8三乙醇胺溶液，之后加入50ul 200mM硼氫化鈉溶液?；旌衔镌?℃孵育30分鐘。然后加入25ul 2mM,pH8三乙醇胺溶液，將混合物在4℃再孵育2小時(shí)。3.1.3．偶聯(lián)的穩(wěn)定化加入10ul 1M,pH7.0甘氨酸溶液。3.1.4．轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)存緩沖液中將反應(yīng)混合物(約300ul)在4℃對(duì)0.5升50mM,pH7.6三乙醇胺緩沖液，150mM NaCl,1mM MgCl2,0.5mM ZnCl2,10mM甘氨酸透析三次，每次8小時(shí)。3.1.5．最終效價(jià)偶聯(lián)的最終效價(jià)為約每μl溶液50pmol活性BlaR-CTD。3.2．BlaR-CTD)-過(guò)氧化物酶融合蛋白通過(guò)受體BlaR-CTD(B.Joris等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters,107-114(1990))和可獲自Boehringer-Mannheim Biochemica的活化過(guò)氧化物酶(貨號(hào)1428861)之間的化學(xué)偶聯(lián)，獲得BlaR-CTD-過(guò)氧化物酶融合蛋白。
偶聯(lián)按如下方式進(jìn)行3.2.1．偶聯(lián)BlaR-CTD和過(guò)氧化物酶在100mM pH9.8碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液中透析。40nmol BlaR-CTD與100ul活化的過(guò)氧化物酶(16mg/ml)在25℃孵育2小時(shí)。3.2.2．終止反應(yīng)加入40ul 2mM,pH8三乙醇胺溶液，之后加入50ul 200mM硼氫化鈉溶液?；旌衔镌?℃孵育30分鐘。然后加入25ul 2mM,pH8三乙醇胺溶液，將混合物在4℃再孵育2小時(shí)。3.2.3．偶聯(lián)的穩(wěn)定化加入10ul 1M,pH7.0甘氨酸溶液。3.2.4．轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)存緩沖液中將反應(yīng)混合物(約400ul)在4℃對(duì)0.5升10mM,pH7.5磷酸鉀緩沖液，200mM NaCl,10mM甘氨酸透析三次，每次8小時(shí)。3.2.5．最終效價(jià)偶聯(lián)的最終效價(jià)為約每μl溶液100pmol活性BlaR-CTD。3.3．固相支持物微量反應(yīng)板-頭孢菌素C。3.3.1．制備參照抗生素溶液。
在25C將8ml含有溶于碳酸鈉緩沖液(100mM,pH9)的213mg人丙種球蛋白(G4386,Sigma)和8.6mg鹽酸2-亞氨基硫雜戊環(huán)(Aldrich,33056-6)的溶液孵育1小時(shí)。
另外，在25℃將20ml含有溶于碳酸鈉緩沖液(100mM,pH9)的119.8mg頭孢菌素C和54mg磺基琥珀酰亞胺基4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(sSMCC,22322 Pierce)的溶液孵育1小時(shí)。
然后，將上述二溶液混合在一起。加入3ml 500mM NaH2PO4，調(diào)節(jié)所獲溶液的pH值至7.1，混合物在25℃孵育2小時(shí)。孵育后的混合物對(duì)1升磷酸鈉緩沖液(10mM,pH7.5)透析三次。所獲溶液通過(guò)0.22um濾器過(guò)濾。3.3.2．用參照抗生素包被微量反應(yīng)板。
采用商品名為NUNK(Immuno Plate:Maxisorp型)或商品名為GREINER(microlon 600，貨號(hào)705071)的具有高蛋白吸附能力的聚苯乙烯微量反應(yīng)板。用150mM,pH7.2 PBS洗滌微量反應(yīng)板的小室。然后將實(shí)施例3.3.1.制備的等份溶液在小室中4℃孵育24小時(shí)。孵育后用含有0.1％Tween-20的150mM,pH7.2 PBS緩沖液洗滌三次。然后在20℃用含有5％BSA的150 mM,pH7.2 PBS飽和緩沖液飽和該管2小時(shí)。用洗滌緩沖液洗滌三次后，干燥該管并避潮保存于4℃。
對(duì)用于BlaR-CTD-堿性磷酸酶識(shí)別試劑的小室，所用洗滌緩沖液是1M,pH9.8二乙醇胺，0.5mM MgCl2；對(duì)用于BlaR-CTD-過(guò)氧化物酶識(shí)別試劑的小室，所用洗滌緩沖液是50mM,pH5磷酸鉀。3.4．測(cè)定奶中三種抗生素將1.4pmol的標(biāo)記識(shí)別試劑與100ul含添加物的奶在47℃孵育5分鐘。用加樣器轉(zhuǎn)移該奶至按實(shí)施例2.3.所示預(yù)處理的小室中。然后該奶在47℃孵育2分鐘。除去奶后，用洗滌緩沖液洗滌兩次(參見(jiàn)實(shí)施例2.3.2.)，在小室中加入含有顯色底物的300ul緩沖液，孵育2分鐘(BlaR-CTD-過(guò)氧化物酶識(shí)別試劑的顯色底物50mM,pH5磷酸鉀，9.1mM ABTS,0.002％H2O2；BlaR-CTD-堿性磷酸酶識(shí)別試劑的顯色底物1 M,pH9.8二乙醇胺，0.5mM MgCl2,10mM 4-NPP)。然后將該板置于ELISA板的自動(dòng)分光光度計(jì)中，波長(zhǎng)設(shè)定為405nm。
該檢驗(yàn)允許檢測(cè)美國(guó)當(dāng)局所要求的控制閾值以下的三種抗生素青霉素G、氯唑西林和頭孢噻呋(青霉素G5ppb、氯唑西林10ppb和頭孢噻呋50ppb)。實(shí)施例4．測(cè)定奶中6種抗生素青霉素G、氨芐青霉素、阿莫西林、氯唑西林、頭孢匹林和頭孢噻呋。
該實(shí)施例闡述檢測(cè)低至美國(guó)當(dāng)局目前所要求標(biāo)準(zhǔn)的美國(guó)當(dāng)局控制的含有β-內(nèi)酰胺核的6種抗生素。該實(shí)施例所描述的檢驗(yàn)使用與堿性磷酸酶或過(guò)氧化物酶融合的融合蛋白形式的受體BlaR-CTD，并使用包被的管子形式的支持物。4.1．BlaR-CTD-堿性磷酸酶融合蛋白。
見(jiàn)實(shí)施例3.1.。4.2．固相支持物用參照抗生素包被的管子在本實(shí)施例中使用商品名為NUNK(Maxisorp型)的具有高蛋白吸附能力的聚苯乙烯管，該管按實(shí)施例3.3.2.所示用參照抗生素溶液處理。4.3．測(cè)定奶中6種抗生素。
在Eppendorf管中將7 pmol的識(shí)別試劑與500ul奶于47℃孵育5分鐘。然后用加樣器轉(zhuǎn)移該奶至按實(shí)施例3.2.所示處理的管中。然后該奶在47℃孵育2分鐘。除去奶后，用1ml of 1M pH9.8二乙醇胺緩沖液、0.5mM MgCl2洗滌該管兩次。然后加入500ul含有1M pH9.8二乙醇胺、0.5mM MgCl2、10mM 4-NPP顯色底物的緩沖液，將底物在47℃孵育2分鐘。然后用分光光度計(jì)測(cè)量上清液的吸光度，分光光度計(jì)波長(zhǎng)設(shè)定為405nm。
該檢驗(yàn)允許檢測(cè)低至美國(guó)當(dāng)局所要求標(biāo)準(zhǔn)的六種抗生素少于5ppb青霉素G；少于10ppb氨芐青霉素；少于10ppb阿莫西林；少于10ppb氯唑西林；少于20ppb頭孢匹林；少于50ppb頭孢噻呋。
權(quán)利要求
1．在生物液體中檢測(cè)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素的方法，其包括如下步驟a)用一定量的識(shí)別試劑接觸確定體積的所述生物液體，并在允許該識(shí)別試劑與所述生物液體中可能存在的抗生素形成復(fù)合物的條件下，孵育由此獲得的混合物，b)在允許參照抗生素與步驟a)中沒(méi)有反應(yīng)的識(shí)別試劑形成復(fù)合物的條件下，用至少一種固定在支持物上的參照抗生素與步驟a)獲得的混合物接觸，和c)測(cè)定結(jié)合在支持物上的識(shí)別試劑的量，其特征在于識(shí)別試劑包含獲自地衣芽孢桿菌并對(duì)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素敏感的受體。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述對(duì)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素敏感的受體是受體BlaR或受體BlaR-CTD。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述對(duì)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素敏感的受體與選自金屬膠體顆粒，硒、碳、硫或碲的膠體顆粒，或有色合成乳膠的膠體顆粒的標(biāo)記試劑偶聯(lián)。
4．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述對(duì)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素敏感的受體與選自熒光物質(zhì)的標(biāo)記試劑偶聯(lián)。
5．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述對(duì)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素敏感的受體與選自酶如堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶和β-內(nèi)酰胺酶的標(biāo)記試劑偶聯(lián)。
6．根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于對(duì)所述抗生素敏感的受體通過(guò)化學(xué)或遺傳學(xué)途徑與酶標(biāo)記試劑偶聯(lián)。
7．根據(jù)權(quán)利要求3-6之任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述對(duì)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素敏感的受體在步驟a)之前與標(biāo)記試劑偶聯(lián)。
8．根據(jù)權(quán)利要求3-6之任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述對(duì)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素敏感的受體在步驟a)過(guò)程中或之后與標(biāo)記試劑偶聯(lián)。
9．根據(jù)權(quán)利要求1-8之任一項(xiàng)的方法，其特征在于步驟a)和步驟b)同時(shí)發(fā)生。
10．根據(jù)權(quán)利要求1-9之任一項(xiàng)的方法，其特征在于步驟b)中所用的支持物選自用參照抗生素包被的管、板或柱。
11．根據(jù)權(quán)利要求1-9之任一項(xiàng)的方法，其特征在于步驟b)中所用的支持物是包含具有第一或第二末端的支持物(1)的檢驗(yàn)裝置，從第一末端開(kāi)始其上連續(xù)結(jié)合了-用于純化被分析液體的膜(2)，-其上固定了一種或數(shù)種捕獲物質(zhì)的膜(3)，和-吸附性膜(4)。
12．根據(jù)權(quán)利要求1-9之任一項(xiàng)的方法，其特征在于步驟b)中所用的支持物由一套磁性或非磁性珠組成。
13．用于通過(guò)權(quán)利要求1-12之任一項(xiàng)的方法在生物液體中檢測(cè)抗生素的檢驗(yàn)試劑盒，其包括至少一種識(shí)別試劑和至少一種固定在支持物上的參照抗生素，其中該識(shí)別試劑獲自地衣芽孢桿菌并對(duì)含有β-內(nèi)酰胺核的抗生素敏感。
全文摘要
本發(fā)明涉及在生物液體中檢測(cè)具有β－內(nèi)酰胺核的抗生素的方法,其包括如下步驟:a)用一定量的識(shí)別試劑接觸確定體積的所述生物液體,并在該識(shí)別試劑與所述液體中可能存在的抗生素形成復(fù)合物的條件下孵育獲得的混合物;b)在參照抗生素與步驟a)中沒(méi)有反應(yīng)的鑒定試劑形成復(fù)合物的條件下,用至少一種固定在支持物上的參照抗生素與步驟a)獲得的混合物接觸;和c)測(cè)定結(jié)合在支持物上的識(shí)別試劑的量。本發(fā)明的特征在于識(shí)別試劑包含獲自地衣芽孢桿菌并對(duì)具有β－內(nèi)酰胺核的抗生素敏感的受體。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1311857SQ99809405
公開(kāi)日2001年9月5日 申請(qǐng)日期1999年3月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月25日
發(fā)明者J·迪戈蘭, B·戈蘭尼爾, J－M·福雷爾, B·卓利斯 申請(qǐng)人:Ucb公司