一種用于結核分枝桿菌及其抗原雙重染色的試劑盒及其方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物技術領域，尤其設及一種用于結核分枝桿菌及其抗原雙重染色的 試劑盒及其方法。
【背景技術】
[0002] 結核病是嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，全球有1/3的人口感染了結核分枝桿 菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB)，每年有200萬人死于結核病，其死亡率在傳染性 疾病中僅低于艾滋病排第二。目前結核病診斷的金標準是疲細菌學檢測。但是疲涂片陽性 率低，疲培養(yǎng)需要一個月的時間才能出結果，因此最常用的疲細菌學檢測手段無法滿足臨 床確診的需求。此外，近年來基于免疫學的化ISP0T化及基于核酸檢測的PCR等新技術也 應用到了結核病診斷中。但是化ISP0T技術無法分辨潛伏感染者與真正的結核病患者，因 此在MTB感染率非常高的中國診斷價值非常有限。而多種PCR技術由于對設備、技術人員 的要求高，且測試成本高等原因無法普及到各級醫(yī)療機構。病理學診斷是結核病確診的重 要途徑，尤其是對于疲細菌學陰性的結核病患者及肺外結核患者的診斷。結核病組織病理 學特征是肉芽腫性炎癥，病變內可見類上皮細胞、朗漢斯巨細胞W及干酪樣壞死等。由于其 他感染性或非感染性疾病也可能會出現(xiàn)類似病理變化，臨床上確診結核病還需要在組織標 本中檢測到MTB的存在。目前使用最廣泛的MTB檢測方法是妻巧氏狂iehl-Neelsen)染色 法，但存在敏感性低，尋找MTB費時費力等缺點。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的一個目的是提供用于結核分枝桿菌檢測的組織切片染色方法。
[0004] 本發(fā)明提供的用于結核分枝桿菌檢測的組織切片染色方法，包括如下步驟：
[0005] 1)將待檢測組織切片與抗MTB抗原抗體溶液反應，得到一抗結合切片；
[0006] 2)將所述一抗結合切片與二抗溶液反應，得到二抗結合切片；
[0007] 3)用DAB染色液對所述二抗結合切片進行染色，得到DAB染色切片；
[000引 4)用石碳酸復紅染色液對所述DAB染色切片染色，得到石碳酸復紅染色切片；
[0009] 5)用蘇木素染色液對所述石碳酸復紅染色切片染色，得到染色切片，實現(xiàn)組織切 片染色。
[0010] 上述方法中，所述抗MTB抗原抗體為抗MTB抗原多克隆抗體；
[0011] 所述MTB抗原的氨基酸序列為序列表中序列1 ;
[0012] 所述二抗溶液的二抗為羊抗兔IgG抗體；所述羊抗兔IgG抗體具體HRP標記的羊 抗兔IgG抗體。二抗溶液采用羊抗兔-HRP二抗，邁新生物的產品。
[0013] 上述方法中，步驟1)中，所述反應的溫度為23-28°C，所述反應的時間為0. 5-化；
[0014] 步驟2)中，所述反應的溫度為23-28°C，所述反應的時間為10-20min。
[0015] 步驟3)中，所述染色時間為1-lOmin、染色溫度為23-28°C ;
[0016] 步驟4)中，所述染色時間為20-90min、染色溫度為23-28°C ;
[0017] 步驟5)中，所述染色時間為0. 5-2min、染色溫度為23-28°C。
[0018] 上述方法中，在步驟1)-2)之間，還包括如下步驟；洗漆所述一抗結合切片；
[0019] 在步驟2)-3)之間，還包括如下步驟；洗漆所述二抗結合切片；
[0020] 在步驟3) -4)之間，還包括如下步驟；洗漆所述DAB染色切片；
[0021] 在步驟4)-5)之間，還包括如下步驟；先用分化液脫色所述石碳酸復紅染色切片 得到脫色后石碳酸復紅染色切片，再洗漆所述脫色后石碳酸復紅染色切片；所述洗漆采用 的洗漆液具體濃度為0. 01M、抑值為7. 4的PBS或水；
[0022] 在步驟5)中，在所述染色得到染色切片后還包括如下步驟；先分化液脫色所述染 色切片，得到脫色后染色切片，再洗漆所述脫色后染色切片；所述洗漆采用的洗漆液具體濃 度為0. 01M、抑值為7. 4的PBS或水。
[0023] 上述方法中，所述脫色時間均為30秒-60秒。
[0024] 上述方法中，所述待檢測組織切片為石蠟包埋的待檢測組織切片。
[0025] 上述方法中，在所述方法的步驟1)前，還包括如下步驟：
[0026] A、將所述石蠟包埋的待檢測組織切片進行脫蠟水化，得到脫蠟水化后切片；
[0027] B、將所述脫蠟水化后切片在濃度為0. 01M、pH值為6. 0的巧樣酸緩沖液中高壓修 復，得到修復后切片；
[002引所述高壓的壓力為80-100千帕；
[0029] 所述修復時間為90s，所述修復的溫度為100°C ;
[0030] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于結核分枝桿菌檢測的組織切片染色的試劑 盒。
[0031] 本發(fā)明提供的試劑盒，包括DAB染色液、石碳酸復紅染色液和蘇木素染色液。
[0032] 上述試劑盒還包括記載在可讀載體上的染色方法，所述染色方法為上述的方法。
[0033] 所述可讀載體具體為說明書。
[0034] 上述的試劑盒在如下1)或2)至少一種中的應用也是本發(fā)明保護的范圍：
[0035] 1)制備檢測或輔助檢測或診斷或輔助診斷結核分枝桿菌產品中的應用；
[0036] 2)制備鑒定或輔助鑒定待測樣本是否含有結核分枝桿菌產品中的應用。
[0037] 0,01mol/L、抑值為6. 0的巧樣酸鋼緩沖液：將2. 41g巧樣酸鋼（化3〔品〇7 ? 2&0) 及0. 38g巧樣酸化品〇7 ? &0)溶于1L蒸饋水中。
[003引抗MTB抗原的多克隆抗體溶液：將MTB抗原（氨基酸序列為序列1)免疫新西蘭白 兔，收集兔血清，利用proteinG純化獲得抗MTB抗原的多克隆抗體溶液。
[0039] DAB染色液；先配置20XDAB染色母液：將0,1g二氨基聯(lián)苯胺 (3, 3' -diaminobenzidine，DAB)倒入10ml蒸饋水中，得到混合液，向混合液中加入3-5滴 10M肥1至混合液變?yōu)闇\棟色則DAB溶解完全，分裝，保存于-20°C。
[0040] 臨用前用0. 1M PB緩沖液（29g化2冊〇4 ? 12&0及3g化畔〇4 ? 2&0溶于1L蒸饋 水中）將20XDAB染色母液稀釋至1 X工作液后加入&化至終濃度0. 03%。；
[0041] 石碳酸復紅染色液；先配置10ml堿性復紅己醇飽和液（將Ig堿性復紅溶于10ml 無水己醇中）和配置90ml 5%石碳酸溶液（將5g苯酪溶于蒸饋水），再將該兩種溶液混合 即為石炭酸復紅液。
[00創(chuàng)分化液：在27ml蒸饋水中加入3ml濃鹽酸和70ml無水己醇，混勻即為分化液。
[0043] 蘇木素染色液：將5g蘇木素溶于50ml無水己醇，得到蘇木素無水己醇液；再將 44g硫酸侶鐘放入1L蒸饋水中加熱溶解，得到硫酸侶鐘溶液；再將蘇木素無水己醇液和硫 酸侶鐘溶液混合，得到混合液；等混合液沸騰后攬拌冷卻至91°C左右，緩慢加入2. 5g氧化 隸，溶解完畢后置于冷水中冷卻，得到反應產物，次日過濾反應產物，收集濾液，再向濾液中 加入4g巧樣酸，攬勻即為蘇木素染色液。
[0044] 濃度為 0. 01M、抑值為 7. 4PBS 配方；2. 9g 化2冊〇4 ? 12馬0, 0. 3g 化? 2&0 及 9gNaCl溶于1L蒸饋水中，調節(jié)抑值為7. 4。
[0045] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明開發(fā)了一種用于結核分枝桿菌及其抗原雙重染色的試 劑盒，該試劑盒可W實現(xiàn)在一張組織標本切片中同時檢測MTB及其表達的蛋白，從而提高 病理學診斷結核病的敏感性。該試劑盒使用方法簡便，適用于病理科開展常規(guī)檢測，具有良 好的臨床推廣價值。
【附圖說明】
[0046] 圖1為在結核病組織切片中按照4種不同染色方法進行染色的結果。
【具體實施方式】
[0047] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0048] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0049] 實施例1、結核病組織標本染色方法
[0050] 一、試劑的配置