一種基于核酸適體的水胺硫磷和丙溴磷的熒光檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種基于核酸適體的水胺硫磯和丙漠磯的巧光 檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 有機磯農(nóng)藥是我國殺蟲劑的主體，國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定農(nóng)產(chǎn)品中有機磯農(nóng)藥的最大允許 殘留量為0. 2mg/kg(GB/T5009. 199-2003)。水胺硫磯為高毒禁用的農(nóng)藥，丙漠磯為限量使用 的有機磯農(nóng)藥。但近年來，由于農(nóng)藥的不合理的使用，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留嚴(yán)重超標(biāo)，弓I 起的食物中毒事件逐漸增多，已嚴(yán)重的危害到我國的食品安全。2010年的毒班豆事件就是 高毒農(nóng)藥水胺硫磯的超范圍使用引起的。農(nóng)藥殘留的監(jiān)控離不開快速、靈敏的檢測技術(shù)。
[0003] 核酸適體（Aptamer)是通過SELEX技術(shù)，從人工體外合成的隨機寡核巧酸序列庫 中，反復(fù)篩選得到的。目前，越來越多的核酸適體在抗生素、重金屬食源性致病菌、生物毒素 等食品安全檢測領(lǐng)域得W成功應(yīng)用。經(jīng)過多輪SELEX篩選得到的核酸適體本身不具有信號 轉(zhuǎn)換的功能，當(dāng)其與祀分子結(jié)合時不能產(chǎn)生可W檢測的信號，因此必須經(jīng)過合理的修飾使 其與祀分子特異性識別時能夠轉(zhuǎn)換成易于檢測的物理信號，才能在分析檢測中應(yīng)用。結(jié)構(gòu) 轉(zhuǎn)換信號核酸適體是Nutiu和Li提出的（Nutiu and Li，2003)，他們巧妙的將核酸適體構(gòu) 建到DNA雜交雙鏈體系中，當(dāng)沒有祀標(biāo)分子存在時，DNA雙鏈的雜交使巧光基團和巧滅基團 靠近，巧光基團的巧光被巧滅，巧光強度很低，當(dāng)祀標(biāo)分子存在時，由于核酸適體和祀標(biāo)分 子的特異性結(jié)合形成適體-祀分子的復(fù)合物，使得巧光基團和巧滅基團遠(yuǎn)離，巧光強度增 強。該種方法可W將巧光基團和澤滅基團靈活地設(shè)計在不同的雜交位置，非常靈活和方便。
[0004] 目前核酸適體仿生分子識別體系的研究在國際、國內(nèi)均受到廣泛重視，相關(guān)研究 進展不斷出現(xiàn)，但是在食品安全領(lǐng)域中的應(yīng)用仍處于起步階段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的欠缺之處，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種 基于核酸適體的水胺硫磯和丙漠磯的巧光檢測方法，利用核酸適體的特異性識別作用，建 立基于核酸適體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換信號的巧光檢測方法，實現(xiàn)對水胺硫磯與丙漠磯的檢測。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種基于核酸適體的水胺硫磯 和丙漠磯的巧光檢測方法，基于核酸適體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換信號，包括如下步驟：
[0007] 1)、將核酸適體F-ssDNA與互補序列Q-B雜交；
[000引 2)、加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品組進行反應(yīng)，并預(yù)留空白實驗作為對照組，標(biāo)準(zhǔn)品含有系列 濃度的水胺硫磯和丙漠磯；
[0009] 3)、檢測各體系的巧光強度，計算巧光強度的變化；
[0010] 4)、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定最低檢出限和線性范圍；
[0011] 所述核酸適體F-ssDNA是5'末端標(biāo)記巧光基團FAM的識別水胺硫磯和丙漠磯的 35個堿基的單鏈DNA，序列為；
[0012] 5 f -FAM-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT-3';
[001引所述互補序列Q-B是3'末端標(biāo)記DABCYL的15個堿基的單鏈DM,序列為；
[0014] -GAATCGCTGCAGCAA-DABCYl^-3f ;
[0015] 所述互補序列Q-B與核酸適體F-ssDNA雜交的部位從核酸適體5'末端起第4個 堿基至第18個堿基，雜交后雙鏈的序列為：
[0016]
【主權(quán)項】
1. 一種基于核酸適體的水胺硫磯和丙漠磯的巧光檢測方法，基于核酸適體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換信 號，其特征是包括如下步驟： 1) 、將核酸適體F-ssDNA與互補序列Q-B雜交； 2) 、加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品組進行反應(yīng)，并預(yù)留空白實驗作為對照組，標(biāo)準(zhǔn)品含有系列濃度 的水胺硫磯和丙漠磯； 3) 、檢測各體系的巧光強度，計算巧光強度的變化； 4) 、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定最低檢出限和線性范圍； 所述核酸適體F-ssDNA是5'末端標(biāo)記巧光基團FAM的識別水胺硫磯和丙漠磯的35個 堿基的單鏈DNA，序列為； 5 f -FAM-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT-3'; 所述互補序列Q-B是3'末端標(biāo)記DABCTL的15個堿基的單鏈DNA，序列為； -GAATCGCTGCAGCAA-DABCYk3f ; 所述互補序列Q-B與核酸適體F-ssDNA雜交的部位從核酸適體5'末端起第4個堿基 至第18個堿基，雜交后雙鏈的序列為：
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于核酸適體的水胺硫磯和丙漠磯的巧光檢測方法，其特征 在于；所述步驟1)中核酸適體F-ssDNA、互補序列Q-B的緩沖溶液為A buffer緩沖體系。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于核酸適體的水胺硫磯和丙漠磯的巧光檢測方法，其特 征在于：所述步驟1)中核酸適體F-ssDNA的濃度為0. 1 y mol/L，互補序列Q-B的濃度為 0. 2 ymol/L，核酸適體F-ssDNA與互補序列Q-B的摩爾比為1 ;2,體積比為1 ;1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于核酸適體的水胺硫磯和丙漠磯的巧光檢測方法，其特征 在于；所述步驟1)中核酸適體F-ssDNA與互補序列Q-B的雜交條件為避光的室溫下雜交 20min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于核酸適體的水胺硫磯和丙漠磯的巧光檢測方法，其特征 在于；所述步驟2)中對照組、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品組的緩沖體系為含有1%丙酬的A buffer緩沖 體系，對照組、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品組與步驟1)雜交后體系的體積比均為1 ;1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于核酸適體的水胺硫磯和丙漠磯的巧光檢測方法，其特征 在于；所述步驟2)中的反應(yīng)時間為60min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于核酸適體的水胺硫磯和丙漠磯的巧光檢測方法，其特征 在于；所述步驟3)中巧光強度檢測的方法為；取體積為100 y L的檢測樣液，加入黑色96孔 板，在多功能讀板機上進行，激發(fā)波長為485nm、發(fā)射波長為535nm。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的基于核酸適體的水胺硫磯和丙漠磯的巧光檢測方 法，其特征在于：該巧光檢測方法還包括樣品組前處理的步驟，具體為；取待測蔬菜樣品， 擦去表面泥±后研碎，取Ig放入試管中，加入5mL丙酬，室溫下超聲波振蕩提取lOmin，過 濾，在沸水浴上將丙酬揮發(fā)干，用ImL含有1 %丙酬的A buffer振蕩溶解提取物，過0. 45 ym 濾膜后待測。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種基于核酸適體的水胺硫磷和丙溴磷的熒光檢測方法。其檢測的原理為將核酸適體5′末端標(biāo)記上熒光基團，設(shè)計了一段與核酸適配體互補雜交的序列并在3′末端標(biāo)記猝滅基團，核酸適體與互補序列雜交時熒光信號很弱，水胺硫磷、丙溴磷識別結(jié)合核酸適體時會引起互補序列解離而熒光信號增強，利用熒光信號的變化來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定最低檢出限和線性范圍，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷樣品中靶標(biāo)分子的含量。該方法快速簡單，具有較高的靈敏度和選擇性，適用于樣品中水胺硫磷和丙溴磷的快速檢測。
【IPC分類】G01N21-64
【公開號】CN104597022
【申請?zhí)枴緾N201510064537
【發(fā)明人】王麗, 徐龍峰, 王蓓蓓, 王丹丹, 吳叢婷
【申請人】安徽科技學(xué)院
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年2月6日